白細胞介素-27基因多態(tài)性與結(jié)核性胸腔積液的相關(guān)性分析

黃娜 魏明莉 王貝 李萬成

在臨床上有很多原因都可能引起胸腔積液，而結(jié)核性胸腔積液是胸腔積液中最常見的原因之一。白介素-27(interleukin-27, IL-27)屬于IL-12家族中的一員[1]，是免疫介導(dǎo)炎癥性疾病的一個重要的介質(zhì)。在炎癥反應(yīng)的初期IL-27是促進T輔助細胞1(helper T cell1, Th1)應(yīng)答和γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)生成的主要因素，而在炎癥反應(yīng)的晚期則起著相對次要的免疫調(diào)控作用。IL-12是一個異二聚體抗炎癥反應(yīng)的細胞因子，由IL-12A和IL-12B分別編碼p35和p40的兩個亞單位構(gòu)成。p40亞單位的表達受活化的巨噬細胞嚴格的調(diào)控和制約。研究表明IL-27在炎癥性疾病、抗腫瘤、自身免疫性疾病和寄生蟲感染中起到關(guān)鍵作用[2]。目前，有關(guān)IL-27基因多態(tài)性與結(jié)核性胸腔積液的文獻罕有報道。為此，我們采用PCR/RFLP的方法，分析IL-27基因多態(tài)性與結(jié)核性胸腔積液的相關(guān)性，報道如下。

材料與方法

一、研究對象

選取2015年1月至2016年12月在成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科就診且經(jīng)胸腔鏡病理確診的漢族結(jié)核性胸腔積液患者160名，男87例，女73例；年齡( 24.2±5.7) 歲。選擇190名健康對照體檢者為對照組，男102例、女88例，年齡( 25.3±6.4) 歲。兩組之間在性別、年齡上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

二、研究方法

1. 基因組DNA的提?。?每位受試者簽訂知情同意書后，采集(包括結(jié)核性胸腔積液患者和健康對照體檢者)靜脈血約4ml，EDTA-Na抗凝，提取基因組DNA后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. PCR擴增、PCR-RFLP及測序分析： 查閱相關(guān)文獻并根據(jù)Genbank dbSNP數(shù)據(jù)庫中核對序列，選取了IL-27其3個位點，編號分別為： rs181206、rs153109和rs17855750(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。PCR引物的設(shè)計參照genebank數(shù)據(jù)庫提供的全序列，運用引物設(shè)計軟件進行設(shè)計并合成各位點所需引物及其內(nèi)切酶[3]。用于擴增IL-27 -964A /G(rs153109)，上游引物序列F:5′-TTGACGTCTCGTGAACTAGCCAG-3′，下游引物序列R:5′-TCTCATGACCACTCGAGCTAG-3′；用于擴增IL-27 4730T / C(rs181206)的上游引物序列F: 5′-GCGATACCGCCTCAGCTCT-3′，下游引物序列R:5′-CCTTCGAAGAGAGGTCCACG-3′；用于擴增IL-27 2905T /G(rs17855750)上游引物序列F: 5′-CAGCAGCTCCAGCTGGCAGC-3′，下游引物序列R:5′-AGCTGTTCGGCGAGACGTATA-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μl，94 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性30 s, 62 ℃退火40 s, 72 ℃延伸40 s, 共30 個循環(huán), 72 ℃終末延伸5 min RFLP反應(yīng)體系總體積10 μl，ddH2O 6.6 μl ，PCR產(chǎn)物2 μl，內(nèi)切酶0.4 μl(IL-27-964A /G、4730T/C和2905T /G均選用的XhoⅠ內(nèi)切酶)。最后將PCR產(chǎn)物送測序，進一步明確基因型， 3個位點的PCR產(chǎn)物大小分別為119 bp 、132 bp、120 bp。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析?；蛐秃偷任换蝾l率均應(yīng)用直接計數(shù)法。計數(shù)資料采用χ2檢驗進行單因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

各基因型和等位基因頻率確認符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律。本組160名結(jié)核性胸腔積液患者和190名健康對照者進行基因型和等位基因頻率檢測，在結(jié)核胸腔積液組和對照組之間，IL-27-964A/G位點基因型分布頻率有顯著差異(P=0.000), 結(jié)核性胸腔積液組AA基因型頻率(48.1%)明顯高于對照組(26.8%), 結(jié)核性胸腔積液組-964A等位基因頻率(66.3%)明顯高于對照組(55.8%)(P=0.000)。在結(jié)核性胸腔積液組和健康對照組之間，IL-27-964A/G的基因型和等位基因頻率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。而IL-27 4730T/C和2905T/G基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

表1 結(jié)核性胸腔積液組與健康對照組基因型及等位基因頻率[n(%)]

討 論

IL-27主要由抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)產(chǎn)生，具有抗炎癥反應(yīng)[4]和抗腫瘤免疫等多種生物學(xué)功能。IL-12激發(fā)許多生物反應(yīng)：它既可以刺激活化的NK細胞和T細胞增殖，又可以提高NK細胞和T細胞介導(dǎo)的細胞生物活性，從而誘導(dǎo)IFN-γ的生成。研究表明在腫瘤組織和自身免疫性疾病中IL-27表達明顯增高，且其增高的程度與疾病的嚴重程度密切相關(guān)[5-7]。在感染炎性反應(yīng)早期IL-27既可以直接參與Th1細胞分化，又可以刺激T細胞活化增生產(chǎn)生IFN-γ等細胞因子，促進Thl型免疫反應(yīng)[8]。IL-27信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子STAT1和STAT3通過Janus激酶(Januskinase, JAK)家族轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白STAT信號通路的激活而傳遞，發(fā)揮主要作用的信號通路是JAK1/STAT1和JAK1/STAT3。IL-27和WSX-1/gp130受體復(fù)合物結(jié)合后激活JAK1/STAT1、JAK1/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。激活STAT1對Th1細胞的增殖分化具有主要作用，而STAT3具有抑制細胞因子產(chǎn)生的作用，雖然STAT3活化可激活下游IL-6R起到促進炎癥反應(yīng)作用，但同時可激活I(lǐng)L-10R發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)作用，而且IL-27作用于初始CD4+T細胞，短暫激活STAT1和STAT3，誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)過程，但是，對于活化的CD4+T細胞，經(jīng)過IL-27作用，STAT3可持續(xù)被激活，從而起到免疫抑制的作用；而此時STAT1的作用卻并不明顯。故認為STAT3的短暫激活具有促炎作用，而持續(xù)激活具有免疫抑制作用。

羅俊華等[9]研究發(fā)現(xiàn)IL-27在結(jié)核性胸腔積液的炎性反應(yīng)中起到重要作用，有可能成為鑒別結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液一項重要指標，聯(lián)合檢測IL-27與INF-γ、ADA能進一步提高結(jié)核性胸腔積液診斷效率。戰(zhàn)玉助等[10]研究表明IL-27 -964A/G基因多態(tài)性可能與結(jié)核病易感性密切相關(guān)。這些研究結(jié)果與我們的研究結(jié)果基本一致。

本文采用了病例對照的方法客觀的評價了IL-27基因?qū)Y(jié)核性胸腔積液的遺傳易感性的影響，發(fā)現(xiàn)IL-27 -964A/G基因型和等位基因頻率在結(jié)核性胸腔積液組和對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這表明IL-27-964A/G基因是結(jié)核性胸腔積液的遺傳易感基因。而IL-27 2905T/G、4730T/C 兩個位點的基因型和等位基因頻率在結(jié)核性胸腔積液組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明這兩個位點的基因多態(tài)性與結(jié)核性胸腔積液無相關(guān)性，因此這兩個位點可能不是結(jié)核性胸腔積液易感性的相關(guān)位點。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-27-964A/G基因多態(tài)性可能與結(jié)核性胸腔積液遺傳易感性有關(guān)，這與文獻研究基本一致[9-10]，因此IL-27可能在結(jié)核性胸腔積液的發(fā)生、發(fā)展中起到了一定的作用。當然，本研究樣本量較少，尚需要大樣本的數(shù)據(jù)進行進一步的統(tǒng)計分析證實IL-27-964A/G基因多態(tài)性與結(jié)核性胸腔積液的相關(guān)性。

綜上所述，IL-27在結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用，從遺傳學(xué)的角度來講，有利于結(jié)核易感人群的篩查。

參 考 文 獻

1 李敬萍, 關(guān)鍵, 許西琳, 等. IL-27在結(jié)核性胸膜炎胸水中的表達及其意義[J]. 吉林醫(yī)學(xué), 2013, 34(19): 3752-3754.

2 Yoshimoto T, Chiba Y, Furusawa J, et al. Potential clinical application of interleukin-27 as an antitumor agent[J]. Cancer Sci, 2015, 106(9): 1103-1110.

3 黃娜, 姜軼, 楊帆, 等. IL-27基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病相關(guān)性的研究[J]. 臨床肺科雜志, 2015, 20(3): 456-458.

4 童欣欣, 呂芳麗. 白細胞介素27在寄生原蟲感染免疫中的作用研究進展[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2014, 32(3): 234-238.

5 班春梅, 李文倩, 李建平, 等. IL-27抗腫瘤作用機制的研究進展[J]. 細胞與分子免疫學(xué)雜志, 2016, 32(3): 410-413.

6 Hu T, Zhao H, Wang K, et al. Association of IL-27 polymorphisms and cancer risk in Chinese population[J]. Recept Signal Transduct Res, 2014, 22(7): 1-4.

7 Di Carlo E, Sorrentino C, Zorzoli A, et al. The antitumor potential of interleukin-27 in prostate cancer[J]. Oncotarget, 2014, 5(21): 10332-10341.

8 Wojno ED, Hosken N, Stumhofer JS, et al. A role for IL-27 in limiting T regulatory cell populations[J]. J Immunol, 2011, 187: 266-273.

9 羅俊華, 吳娜. IL-27、ADA 及INF-γ 在結(jié)核性和惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值[J]. 河北醫(yī)藥, 2015, 37(4): 512-514.

10 戰(zhàn)玉助, 蔣利萍, 王莉, 等. 白細胞介素-27基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的關(guān)系[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2009, 30(24): 3100-3103.