丹參酮IIA對慢性腎功能衰竭大鼠認知障礙的神經(jīng)保護作用及其機制

朱鳴，王小同，閔晶晶，陳琪，王霄一

（1.湖州市第一人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 湖州 313000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 康復科，浙江溫州 325027；3.湖州市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 湖州 313000）

慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是指各種原發(fā)性腎臟疾病或繼發(fā)于其他相關(guān)疾病引起的腎功能受損及惡化，是全球老年患者最普遍的公共健康問題之一。近年來我國的一項大型研究顯示慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）的患病率為10.8%，這意味著我國大約有1.2億患者[1]，這些患者可能最終都會進入CRF階段。越來越多的研究開始關(guān)注到CRF患者的認知障礙問題，通常表現(xiàn)為注意力不集中、暫時性和延遲性記憶障礙、定向障礙、執(zhí)行功能下降和思維遲緩、失眠、冷漠、煩躁易怒等癥狀，甚者可出現(xiàn)幻聽、幻視、偏執(zhí)和妄想等精神障礙，并且會隨腎功能水平下降而惡化，嚴重影響了患者對治療計劃的依從性以及生活質(zhì)量。約1/3的CKD患者和終末期腎病患者都存在不同程度的認知功能障礙[2]。透析治療雖然是治療終末期腎臟病并從體內(nèi)去除累積毒素的首選方法，但仍無法阻止CRF患者認知障礙的發(fā)生與進展，有研究表明在接受透析的CRF患者中約70%存在中度或重度認知障礙[3]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)專門從事蛋白質(zhì)合成、折疊、裝配和修飾的細胞器。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的未折疊蛋白聚集負荷超過了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常折疊能力時，將誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。其中GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的關(guān)鍵分子伴侶之一，在ERS的激活中起重要作用。ERS不僅可以啟動有保護作用的未折疊蛋白反應和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解，持續(xù)過度的ERS還可以觸發(fā)ERS相關(guān)凋亡，這其中包括ERS誘導的CHOP/GADD153表達、JNK的活化和Caspase-12蛋白水解酶的活化等[4-5]。氧化應激是指人體受到有害刺激時由活性氧自由基ROS引起的病理反應。研究表明，氧化應激與認知障礙的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。過度的ROS可能破壞細胞結(jié)構(gòu)，誘導凋亡甚至壞死[6]。

丹參酮I IA（tanshinone I IA，Tan I IA）是丹參中含量最高的二萜醌類化合物，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化及抗動脈粥樣硬化等作用[7-9]。有研究證明Tan I IA可以改善ERS誘導的心肌細胞凋亡[10]，還可逆轉(zhuǎn)血管性癡呆大鼠的學習和記憶缺陷，主要機制可能與其抗自由基損傷、調(diào)節(jié)谷氨酸和γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質(zhì)含量有關(guān)[11]。但目前關(guān)于Tan I IA是否能保護CRF誘導的認知功能障礙及其與ERS相關(guān)凋亡的關(guān)系尚未明確。本研究旨在評估Tan I IA對CRF相關(guān)認知功能障礙大鼠的神經(jīng)保護作用及是否與調(diào)控ERS相關(guān)凋亡、氧化應激有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和藥物：Tan I IA磺酸鈉注射液（諾新康）（2 mL∶10 mg）購自杭州華東醫(yī)藥股份有限公司，由上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。ERS激活劑衣霉素（tunicamycin，TM，美國Sigma-Aldrich公司），小鼠抗大鼠多克隆GRP78抗體（1∶1000）、小鼠抗大鼠多克隆CHOP抗體（1∶1000）、兔抗大鼠多克隆GAPDH抗體（1∶1000）均購買自美國Santa Cruz公司，兔抗大鼠Caspase-12抗體（1∶2000）購買自美國Abcam公司。Tunel試劑盒購買自瑞士羅氏公司。丙二醛（malonaldehyde，MDA）測定試劑盒和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備：醫(yī)用微波爐（廣東格蘭仕公司），DK-S12型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司），顯微鏡（日本Nikon公司），STP12脫水機、HM335E切片機、AP280-2包埋機（德國Microm公司），LEICA彩色病理圖像分析系統(tǒng)（德國LEICA公司），超低溫冰箱（日本Sanyo公司），Morris水迷宮（北京碩林苑科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模：SD雄性大鼠60只，初始體質(zhì)量150～180 g，購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2013-0184。隨機分為5組，每組12只，分別為：對照組、模型組、TM組、TM+Tan I IA組和Tan I IA組。模型組、TM組、TM+Tan I IA組和Tan I IA組大鼠用10%水合氯醛麻醉，呈俯臥位固定于操作臺上，從距右側(cè)脊肋骨1.5 cm處斜向外方切口，暴露出右側(cè)腎臟，將整個右腎切除。1周后再次用10%水合氯醛麻醉后，俯臥位固定于操作臺上，從距左脊肋骨1.5 cm處斜向外方切口，暴露左側(cè)腎臟，分離腎周圍脂肪囊后將腎的上下極各1/3切除，明膠海綿壓迫切面止血，復位腎臟，縫合，2次手術(shù)共切除5/6腎臟。4周時檢測血肌酐、尿素氮水平，若均大于對照組20%，證實造模成功。造模4周后開始至12周，TM組和TM+Tan I IA組腹腔注射TM，劑量為4.5 mg/kg，2次/周；TM+Tan I IA組和Tan I IA組各給予Tan I IA 15 mg/kg，1次/d，腹腔注射，對照組注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 Morris水迷宮實驗：采用Morris水迷宮檢測大鼠的學習記憶能力。造模12周后進行訓練測試，將大鼠頭朝池壁放入水中，取東、南、西、北4個象限任選1個放入水中，水迷宮上方掛有自動攝像系統(tǒng)用以記錄實驗大鼠尋找平臺的路線，逃避潛伏期。若60 s后仍不能找到平臺，則系統(tǒng)自動默認潛伏期為60 s，在第1、第2天若未找到則將其引導至平臺適應10 s，第3天開始不再引導。每只大鼠訓練5 d，每天訓練3次。第6天進行平臺搜索實驗，將平臺撤去，任選一個象限將大鼠放入水中，其后4組大鼠均從同一個象限入水，觀察并記錄60 s內(nèi)大鼠穿越平臺的次數(shù)。

1.2.3 取材：水迷宮實驗結(jié)束后，將大鼠經(jīng)6%水合氯醛腹腔麻醉，0.9%氯化鈉溶液快速心臟灌注將血液沖凈后，置于冰盤上取腦，快速分離海馬-80 ℃冰箱保存。HE染色、Tunel染色海馬標本置于4%多聚甲醛固定。

這樣，如果司法機關(guān)嚴格執(zhí)行寬嚴相濟刑事政策，判處死刑的案件就會增加。這種增加顯然不符合刑罰輕緩化的世界潮流。在刑罰輕緩化思潮與寬嚴相濟刑事政策之間沖突的協(xié)調(diào)中，對嚴重刑事案件判處死刑但緩期二年執(zhí)行是一條走得通的道路。這種死刑緩期兩年執(zhí)行的判決，一方面滿足了從嚴辦理嚴重刑事案件的政策要求，另一方面又不至于使刑罰整體上呈現(xiàn)出過分偏重于重刑而完全有悖于刑罰輕緩化趨勢的情況。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性、方差齊性檢驗，以±s表示，水迷宮逃避潛伏期采用重復測量資料的方差分析，其他數(shù)據(jù)組間比較均采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力 圖1顯示了各組搜索平臺的路線圖，模型組、TM組搜索平臺路線較對照組明顯延長，加入Tan I IA后路線距離明顯縮短。各組之間，訓練前2 d逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與對照組比，模型組、TM組大鼠從第3天開始逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），且TM組較模型組逃避潛伏期更長（P＜0.05）。

1.2.4 海馬組織、血清中MDA和SOD含量測定：取海馬組織勻漿液和血清各0.1 mL，采用TBA比色法，比色波長532 nm，按照試劑盒說明檢測MDA含量。使用冷的0.9%氯化鈉溶液作為勻漿介質(zhì)，海馬勻漿液3000 r/min離心10 min，取40 μL上清液，取血清20 μL，采用黃嘌呤氧化酶法，比色波長550 nm，按照試劑盒說明書檢測SOD含量。

1.2.5 HE染色：取經(jīng)過4%多聚甲醛固定的海馬，在0.01 mol/L的PBS中浸泡過夜，按照常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇復水后，行HE染色，再使用梯度乙醇脫水，滴加中性樹膠封片，顯微鏡拍照觀察。

1.2.6 Tunel染色：經(jīng)4%多聚甲醛固定的海馬石蠟切片用蒸餾水洗滌后，在37 ℃下與蛋白質(zhì)消化酶一起溫育20 min，然后，使用Tunel凋亡試劑盒按照說明書進行分析。

1.2.7 Western blot檢測：取60 mg海馬組織使用RIPA裂解液充分裂解后抽提總蛋白，離心后取上清液。依照BCA蛋白定量試劑盒的使用方法檢測上清中蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度加入相應體積的總蛋白與5×SDS-PAGE加樣緩沖液混合煮沸5～10 min后加入加樣孔，進行SDS-PAGE電泳。用濕轉(zhuǎn)法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，分別加入CHOP（1∶1000）、GRP78（1∶1000）和Caspase-12一抗（1∶2000）稀釋液，以及內(nèi)參GAPDH抗體（1∶1000）稀釋液，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜后用稀釋好的二抗（HRP標記山羊抗鼠/抗兔二抗1∶5000）室溫下孵育2 h，洗膜，顯影后定影，自動成像系統(tǒng)成像并分析。TM組在使用Tan I IA干預后水迷宮訓練的第3天開始逃避潛伏期較TM組明顯縮短（P＜0.05），造模后單純使用Tan I IA干預的大鼠第3天逃避潛伏期縮短更明顯，第5天時接近正常水平（P＜0.05），見圖2。水迷宮實驗第6天的空間探索實驗中，與對照組比，模型組穿越平臺次數(shù)明顯減少（P＜0.05），TM組減少更加明顯（P＜0.05），而TM組在使用Tan I IA干預后穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.05），單純使用Tan I IA干預組大鼠穿越平臺次數(shù)接近對照組，見圖3。

圖1 各組搜索平臺的路線圖

圖2 各組逃避潛伏期

2.2 大鼠血清和海馬MDA、SOD含量比較 模型組血清、海馬組織中MDA含量較對照組明顯升高（P＜0.05），加入TM干預后進一步升高（P＜0.05），而模型組和TM組在各自加入Tan I IA干預后MDA含量明顯下降（P＜0.05），造模后單純加入Tan I IA較TM+Tan I IA組大鼠大鼠血清、海馬MDA含量下降更明顯（P＜0.05）。模型組血清、海馬組織中SOD含量較對照組明顯下降（P＜0.05），加入TM干預后進一步下降（P＜0.01），而模型組和TM組在分別加入Tan I IA干預后SOD含量明顯升高（P＜0.05），單純加入Tan I IA的較TM+Tan I IA組大鼠血清、海馬SOD含量升高更明顯（P＜0.01）。見表1。

圖3 穿越平臺次數(shù)

表1 各組大鼠血清和海馬MDA含量及SOD活力比較（n=12， ±s）

表1 各組大鼠血清和海馬MDA含量及SOD活力比較（n=12， ±s）

與對照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05，cP＜0.01；與TM組比：dP＜0.05；與TM+Tan I IA組比：eP＜0.05，fP＜0.01

SOD血清（μmol/L） 海馬（μmol/g） 血清（kU/L） 海馬（kU/g）對照組 6.18±1.03 31.53± 7.47 236.56± 7.33 421.67±21.41模型組 10.21±1.55a 43.72±12.59a 188.62±17.49a 278.73±43.52a TM組 13.46±1.78b 58.59±15.36b 105.76±12.85b 163.58±32.75c TM+Tan IIA組 9.73±1.14d 45.84± 8.55d 169.83±10.48d 252.24±28.46d Tan IIA組 7.12±1.34be 37.82±10.24be 210.73±20.56be 378.53±36.64cf組別 MDA

2.4 各組大鼠12周時海馬凋亡情況比較 與對照組比，模型組凋亡細胞百分比明顯增高（P＜0.05）；與模型組比，TM組凋亡細胞百分比更進一步升高，使用Tan I IA干預后可明顯降低模型組和TM組的凋亡率（P＜0.05），造模大鼠單純使用Tan I IA干預較TM+Tan I IA組凋亡百分比降低更明顯（P＜0.01）。見圖5。

2.5 Western blot檢測各組海馬組織GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示模型組大鼠海馬GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白水平較對照組比明顯增加（P＜0.05），TM組上述蛋白表達更進一步升高（P＜0.05），加入Tan I IA干預后上述蛋白表達明顯下降（P＜0.05），單純加入Tan I IA干預較TM+Tan I IA組GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達下降更明顯（P＜0.05）。見圖6。

3 討論

ERS在細胞應激過程中起著重要作用，作為ERS的重要信號通路之一，未折疊蛋白反應（unfolded protein reaction，UPR）主要是通過改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)負載和折疊能力之間的平衡，以及營養(yǎng)因子和（或）生長因子的分泌，進而減輕ERS并促使細胞存活[12-14]。嚴重而持續(xù)的ERS超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所能承受的范圍時，則會對細胞造成損傷或觸發(fā)細胞凋亡信號途徑引起細胞死亡，這被稱為ERS相關(guān)的細胞凋亡[4，12-14]。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的關(guān)鍵分子伴侶之一，在ERS的激活中起重要作用。GRP78表達的上調(diào)是ERS活化的標志。ERS誘導的凋亡與CHOP和Caspase-12表達密切相關(guān)。CHOP是轉(zhuǎn)錄因子家族C/EBP的成員，在正常生理條件下其表達水平非常低，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到應激時，CHOP被顯著誘導并參與下游凋亡相關(guān)基因的表達[4，12-14]。Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，通過ERS誘導的降解誘導細胞凋亡。因此，Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號通路中的關(guān)鍵分子[4，12-14]。

圖4 各組大鼠海馬12周病理形態(tài)學改變（HE，×200）

許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制與ERS及其相關(guān)凋亡密切相關(guān)。阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是最常見的神經(jīng)退行性疾病，其特征在于漸進性認知功能減退和神經(jīng)元退行性改變。AD的主要病理改變是錯誤折疊的Aβ蛋白，以及作為神經(jīng)原纖維纏結(jié)成分的老年斑和tau蛋白的形成[15-16]。人腦中的早老素1蛋白（presenilin 1，PS-1）隨著年齡的增長而增加并且影響老年人的記憶。編碼這種蛋白質(zhì)的PS-1基因的突變被認為與AD的發(fā)病密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，PS-1突變細胞可提高ERS的敏感性，使GRP78/Bip mRNA的表達受到明顯抑制，進而使神經(jīng)元更易受到過度應激引起損傷[17]。與此不同，在AD大鼠模型中，敲除Caspase-12可明顯抑制ERS誘導的細胞凋亡[17]。在持續(xù)光照誘導空間認知障礙的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)tau蛋白存在多個位點磷酸化且GRP78/Bip及CHOP表達增加，從而證明AD樣分子病理損傷也涉及ERS[18]。帕金森氏?。≒arkinson’s disease，PD）被認為是一種以α-突觸核蛋白為主要成分的聚集體在胞漿內(nèi)聚積，進而引起黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細胞選擇性死亡的神經(jīng)退行性病變。有研究表明，ERS誘導劑，如毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）和布雷菲德菌素A（brefeldin A，BFA），能引起大量多巴胺能神經(jīng)元的死亡，并且發(fā)現(xiàn)人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y在經(jīng)過多巴胺處理以后出現(xiàn)了CHOP等一些與ERS相關(guān)的凋亡蛋白表達的增加及細胞的死亡[19-20]。本研究觀察到CRF大鼠中存在著一定程度的學習記憶障礙以及海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的破壞，同時伴隨有GRP78、CHOP及Cas-pase-12表達的增加，而ERS誘導劑TM更進一步加重了上述改變，說明CRF大鼠的認知障礙與ERS誘導的細胞凋亡密切相關(guān)。

圖5 各組大鼠12周海馬凋亡圖（A-E，Tunel染色，×200）及細胞凋亡率比較（F）

圖6 各組海馬組織GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白Western blot檢測（A）及統(tǒng)計圖（B）

Tan IIA是丹參中含量最高的活性成分，具有清除自由基、抗氧化、降低血液黏度、抑制血液凝固、促進纖維蛋白溶解、抑制血小板聚集、促進血栓溶解的作用。最近的研究證實Tan I IA具有神經(jīng)保護作用[7-9]。研究表明Tan I IA可以通過維持錐體細胞在海馬CA1區(qū)域的興奮性和突觸可塑性來改善慢性缺氧大鼠的認知缺陷[21]。Tan I IA也可以通過減少海馬長時程增強抑制來改善癲癇大鼠的認知功能障礙[22]。它可以通過抗氧化應激、增加海馬谷氨酸和γ-氨基丁酸含量，在血管性癡呆大鼠中起到神經(jīng)保護作用[11]。

MDA是脂質(zhì)過氧化物的最終產(chǎn)物，可反映氧自由基的產(chǎn)生，SOD是人體內(nèi)重要的氧化自由基清除劑，可以消除氧化自由基對體內(nèi)脂質(zhì)和碳水化合物代謝的影響及其對細胞的損傷，從而保護身體免受損傷。本研究表明，Tan I IA可以降低大鼠血清、海馬組織MDA活性，增加SOD水平，表明Tan I IA具有抗氧化應激的作用并且可以抑制脂質(zhì)過氧化。在抗凋亡研究方面，有學者發(fā)現(xiàn)Tan I IA能顯著抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡，增加心肌細胞中Bcl-2/Bax蛋白比率，減少Tunel陽性細胞和Caspase-3的激活[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)Tan I IA可通過激活PI3K/Akt和磷酸化GSK3/β抑制Aβ25-35誘導的凋亡[24]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)Tan I IA能通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白和線粒體膜超極化、抑制cytC釋放和Caspase-3活性，從而靶向抑制線粒體凋亡途徑來抑制慢性低氧誘導的H9C2細胞凋亡[25]。本研究發(fā)現(xiàn)Tan I IA可以改善CRF模型組大鼠記憶障礙，下調(diào)GRP78、CHOP及Caspase-12蛋白表達，減少凋亡細胞，改善海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，在加入ERS激活劑TM干預后，造模大鼠的ERS相關(guān)凋亡情況、海馬神經(jīng)元破壞較模型組更明顯，認知障礙更為突出，但加入Tan I IA后可以得到明顯改善，說明Tan I IA可能通過抑制ERS相關(guān)凋亡、抗氧化應激發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，在本研究中，通過Morris水迷宮訓練發(fā)現(xiàn)模型組大鼠學習記憶能力較對照組明顯下降，使用TM干預后下降更為明顯，在加入Tan I IA干預后模型大鼠在搜索平臺試驗和穿越平臺次數(shù)試驗中表現(xiàn)都明顯改善。造模12周以后模型組大鼠ERS相關(guān)凋亡水平顯著上升，GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達水平和凋亡細胞百分比增加，MDA水平增加，SOD水平降低，細胞結(jié)構(gòu)破壞明顯，使用TM后ERS相關(guān)凋亡水平，氧化應激水平進一步上升，細胞結(jié)構(gòu)破壞較模型組更明顯，而Tan I IA干預后ERS凋亡水平顯著下降，抗氧化應激能力顯著提高，細胞結(jié)構(gòu)得到明顯改善。說明在CRF相關(guān)的認知障礙中Tan I IA可能可以通過抑制ERS相關(guān)凋亡、抗氧化應激來發(fā)揮神經(jīng)保護、改善認知作用。

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