褐藻多糖硫酸酯減輕尿酸性腎病大鼠腎小管上皮細胞損傷的作用機制

鄧蓉， 謝麗芬， 成杏芳， 陳美艷， 陳偉堅， 聶曉莉，2

（1.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東廣州510515；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院 中醫(yī)科，廣東廣州510515）

尿酸性腎病（uric acid nephropathy，UAN）是指由于尿酸鹽沉積于腎臟所引起的腎臟損傷.近年來隨著高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）患病率逐年增高，UAN患病率也隨之升高［1］，然而目前國內(nèi)外尚無理想的治療藥物.褐藻多糖硫酸酯（fucoidan polysaccharide sulfate，F(xiàn)PS）是從海洋生物褐藻中提取的一種高度支鏈化的α-L-巖藻糖-4-硫酸酯聚合成的天然硫酸酯多糖，具有抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用［2］，在臨床治療慢性腎衰竭方面有較好的療效［3］，本課題組前期實驗表明FPS能改善單側輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化［4］.但是 FPS防治UAN的研究仍然較少.因此，本研究采用氧嗪酸鉀和腺嘌呤聯(lián)合給藥建立UAN實驗大鼠模型，探討FPS對UAN大鼠腎保護的作用機制，為FPS防治UAN提供實驗依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

褐藻多糖硫酸購自吉林輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司，別嘌呤醇、腺嘌呤、氧嗪酸鉀購自阿拉丁生化科技股份有限公司，TUNEL染色試劑盒購自Roche公司，大鼠活性氧（ROS）ELISA試劑盒購自北京拓英時代科技有限公司.

1.1.2 實驗動物

健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心（動物許可證號：SYXK（粵）2011-0074），本研究通過南方醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準.

1.1.3 儀器

RS-20Ⅲ型低溫冷凍離心機購自日本TOMY SEIKO公司；貝克曼AU4802購自美國BECKMAN COULTER公司；透射電子顯微鏡購自日本HITACHI公司；正置光學顯微鏡、成像系統(tǒng)購自日本尼康公司；包埋機、凍臺、組織攤片機購自武漢俊杰電子有限公司；電鏡專用切片機購自武漢谷歌生物公司.

1.2 方法

1.2.1 UAN大鼠模型的制備、分組及給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后隨機分為正常對照組、模型組、別嘌呤醇組、FPS低質(zhì)量分數(shù)組（每天給質(zhì)量分數(shù)50 mg/kg）、中質(zhì)量分數(shù)組（每天給質(zhì)量分數(shù)100 mg/kg）、高質(zhì)量分數(shù)組（每天給質(zhì)量分數(shù)200 mg/kg），每組10只，除正常對照組予以等體積蒸餾水外，其余4組均每天予以質(zhì)量分數(shù)100 mg/kg腺嘌呤和質(zhì)量分數(shù)250 mg/kg氧嗪酸鉀灌胃給藥，連續(xù)2周造模.別嘌呤醇組、FPS組大鼠在造模后同時分別每天給予別嘌呤醇（質(zhì)量分數(shù)5 mg/kg）、低中高質(zhì)量分數(shù) FPS灌胃，正常對照組和模型組大鼠同時予等量蒸餾水，連續(xù)給藥2周.

1.2.2 樣本采集

末次給藥后1 h，所有大鼠麻醉后腹腔靜脈采血，5 000×g離心10 min獲取血清樣本.在冰臺上迅速分離腎臟組織，于-80℃保存待測.

1.2.3 血清生化指標檢測

采用全自動生化分析儀檢測大鼠血尿酸（uric acid，UA）、血清肌酐 （serum creatinine，SCr）、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）.

1.2.4 腎組織病理形態(tài)學觀察

經(jīng)體積分數(shù)為10%中性甲醛固定的腎組織常規(guī)脫水、透明、包埋，制成3μm切片，行蘇木素伊紅染色（haematoxylin-eosin stain，HE），光鏡下觀察腎臟病理改變情況.

1.2.5 腎小管上皮細胞透射電鏡觀察

經(jīng)體積分數(shù)為2.5%戊二醛溶液固定的腎臟組織用PBS沖洗3次，15 min/次，加入體積分數(shù)為1%餓酸處理直至樣品變黑后PBS沖洗3次，15min/次；4℃下，組織經(jīng)乙醇梯度脫水后于室溫中加入丙酮，作用3次，15 min/次，純丙酮+包埋液（體積比為2∶1）室溫包埋4 h后純丙酮+包埋液（體積比為2∶1）包埋24 h，之后用包埋液在37℃包埋3 h；37℃聚合過夜，45℃聚合12 h，60℃聚合48 h后切成60 nm切片，用體積分數(shù)為2%醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色15 min，干燥后上機觀察.

1.2.6 TUNEL免疫組化染色觀察腎小管上皮細胞凋亡

經(jīng)體積分數(shù)為10%中性甲醛固定的腎組織常規(guī)脫水、透明、包埋，制成石蠟切片，按TUNEL說明書操作.光學顯微鏡下觀察每組腎小管上皮細胞凋亡情況，正常細胞核顯藍色，凋亡陽性細胞核呈棕黃色，應用Image-Pro Plus 6.0軟件（Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA）分析圖片，計算每200倍放大視野凋亡陽性細胞數(shù)目與細胞總數(shù)的百分比（陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%）即為凋亡率（%）.

1.2.7 酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定腎臟組織中ROS水平

腎臟組織質(zhì)量0.5 g置PBS中勻漿，在水浴中用勻漿器制備質(zhì)量比為1∶10的勻漿，4℃下12 000×g離心15 min，取上清液，按照試劑盒方法測定ROS的量.

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以（均數(shù)±標準誤差）（±s）表示，均數(shù)比較采用t檢驗，多組間的比較用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異.

2 結果

2.1 FPS對大鼠一般狀況及血尿酸、腎功能指標影響

實驗過程中模型組死亡大鼠4只，F(xiàn)PS低質(zhì)量分數(shù)組死亡2只，別嘌呤醇組、FPS中質(zhì)量分數(shù)組各死亡1只，正常對照組、FPS高質(zhì)量分數(shù)組無死亡（圖1）.與正常對照組相比，模型組大鼠精神萎靡，反應能力下降，飲水量和尿量增加，毛色欠光澤，檢測血清UA、BUN、SCr水平顯著升高（P＜0.01），表明UAN實驗大鼠模型造模成功.別嘌呤醇組和FPS中、高質(zhì)量分數(shù)組大鼠一般狀況較模型組顯著改善，且大鼠血清尿酸、尿素氮和肌酐水平較模型組均顯著降低（P＜0.01）.結果表明質(zhì)量分數(shù)為100 mg/kg的腺嘌呤和250 mg/kg的氧嗪酸鉀連續(xù)灌胃2周可建立UAN大鼠模型，F(xiàn)PS能降低UAN大鼠血清UA水平、改善腎功能損傷（表1）.

表1 FPS對UAN大鼠血尿酸、腎功能指標的的影響Table 1 Effect of FPS on SUA and renal function indexes in rats with UAN（±s）

表1 FPS對UAN大鼠血尿酸、腎功能指標的的影響Table 1 Effect of FPS on SUA and renal function indexes in rats with UAN（±s）

與模型組比較：1）P＜0.01；與正常對照組比較：2）P＜0.01，3）P＜0.05.

正常對照組 10 - 102.5±30.41） 4.0±1.01） 20.0±2.11）模型組 6 - 632.2±83.92） 8.6±2.12） 82.1±5.52）別嘌呤醇組 9 5 108.7±31.71） 4.4±2.51） 25.4±1.91）FPS低質(zhì)量分數(shù)組 8 100 130.4±28.31），3） 5.1±2.31） 27.6±3.51）FPS中質(zhì)量分數(shù)組 9 200 110.3±29.31） 4.7±1.71） 22.3±2.11）FPS高質(zhì)量分數(shù)組 10 300 103.3±17.91） 4.1±1.31） 20.1±1.61）

2.2 FPS對UAN大鼠腎臟外觀及組織病理學影響

肉眼觀察可見，模型組大鼠腎臟體積增大，顏色蒼白，表面顆粒狀較多，與模型組相比，F(xiàn)PS中、高質(zhì)量分數(shù)組及別嘌呤醇組腎臟體積略小，表面顆粒減少，而FPS低質(zhì)量分數(shù)組與模型組相似.HE染色組織病理學可見，模型組腎小管內(nèi)皮細胞萎縮，管腔擴大，腎小管內(nèi)大量黃褐色尿酸鹽結晶沉積，腎小管間質(zhì)較多炎性細胞浸潤，腎間質(zhì)纖維增生樣改變.與模型組相比，F(xiàn)PS中、高質(zhì)量分數(shù)組及別嘌呤醇組炎性細胞浸潤、腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化有不同程度減輕，而FPS低質(zhì)量分數(shù)組改善不明顯.結果表明UAN大鼠主要表現(xiàn)為腎小管損傷，F(xiàn)PS可以顯著改善腎小管損傷（圖2，圖3）.

圖2 各組大鼠腎臟外觀觀察（×20）Fig.2 Appearance observation on kidney of rats in each group（×20）

2.3 FPS對腎小管上皮細胞凋亡的影響

與正常對照組比較，模型組腎小管上皮細胞凋亡明顯（P＜0.01）.與模型組比較，F(xiàn)PS低、中、高質(zhì)量分數(shù)組和別嘌呤醇組腎小管上皮細胞凋亡均有顯著減少（P＜0.01，P＜0.05，圖4、表 2）.結果表明腎小管上皮細胞凋亡是UAN大鼠腎臟損傷重要的病理機制，F(xiàn)PS可顯著抑制UAN大鼠腎小管上皮細胞凋亡.

圖4 FPS對UAN大鼠腎小管上皮細胞凋亡的影響（×20）Fig.4 Effect of FPS on apoptosis of renal tubular cells in rats with UAN（×20）

表2 FPS對UAN大鼠腎小管上皮細胞凋亡的的影響Table 2 Effect of FPS on apoptotic indexes of renal tubular cells in rats with UAN（±s）

表2 FPS對UAN大鼠腎小管上皮細胞凋亡的的影響Table 2 Effect of FPS on apoptotic indexes of renal tubular cells in rats with UAN（±s）

與模型組比較：1）P＜0.01；與正常對照組比較：2）P＜0.01，3）P＜0.05.

正常對照組 10 - 1.3±0.21）模型組 6 - 7.8±0.32）別嘌呤醇組 9 5 3.5±0.41），3）FPS低質(zhì)量分數(shù)組 8 100 3.1±0.31），3）FPS中質(zhì)量分數(shù)組 9 200 2.5±0.41）FPS高質(zhì)量分數(shù)組 10 300 1.4±0.31）

2.4 FPS對UAN大鼠腎小管上皮細胞微結構的影響

電鏡觀察可見，模型組腎小管上皮細胞膜結構不清，微絨毛排列紊亂，線粒體腫脹，基底部可見大量溶酶體和自噬體形成.與模型組相比，F(xiàn)PS各治療組腎小管上皮細胞微結構損害均有不同程度恢復（圖5）.結果表明HUA可誘導UAN大鼠腎小管上皮細胞線粒體損傷、細胞過度自噬，而FPS顯著改善腎小管上皮細胞線粒體損傷及細胞過度自噬.

圖5 各組大鼠腎小管上皮細胞電鏡觀察（×20 000）Fig.5 Electron Microscope observation on renal tubular epithelial cells of rats in each group（×20 000）

2.5 FPS對腎臟組織ROS水平影響

與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織ROS水平顯著升高（P＜0.01），而 FPS低、中、高質(zhì)量分數(shù)組和別嘌呤醇組ROS較模型組均顯著降低（P＜0.01）.結果表明FPS可顯著降低腎臟組織中ROS水平（表3）.

表3 FPS對UAN大鼠腎臟組織ROS的影響Table 3 Effect of FPS on ROS of kidney tissues in rats with UAN（±s）

表3 FPS對UAN大鼠腎臟組織ROS的影響Table 3 Effect of FPS on ROS of kidney tissues in rats with UAN（±s）

與模型組比較：1）P＜0.01；與正常對照組比較：2）P＜0.01.

正常對照組 10 - 10.2±1.41）模型組 6 - 13.1±2.82）別嘌呤醇組 9 5 11.1±1.31）FPS低質(zhì)量分數(shù)組 8 100 11.0±1.41）FPS中質(zhì)量分數(shù)組 9 200 10.8±1.21）FPS高質(zhì)量分數(shù)組 10 300 10.1±1.31）

3 討論

HUA是由于人體內(nèi)嘌呤生成代謝紊亂所致機體內(nèi)血尿酸生成過多的一種代謝性疾病.流行病學調(diào)查顯示，血尿酸水平是慢性腎臟病、心血管疾病、高血壓及代謝綜合征等疾病進展的獨立危險因素［5］.目前臨床上用于治療HUA的藥物如別嘌醇、苯溴馬隆等藥物具有明確的降尿酸作用，但常出現(xiàn)藥物過敏、肝腎損害等副作用［6］，而新型降尿酸藥物由于價格昂貴、缺乏足夠的試驗數(shù)據(jù)，其療效和安全性需要進一步完善，所以并沒有在臨床上廣泛使用［7］.因此，探尋更為安全有效的降尿酸藥物具有重大的臨床及社會意義.

研究表明褐藻多糖硫酸酯具有廣泛的生物學活性，如抗凝血、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等，而且各種活性之間相互關聯(lián)，可通過多途徑、多靶點發(fā)揮腎臟保護作用［8］.Wu等［9］發(fā)現(xiàn) FPS可通過促進腎組織中表面有機陽離子轉運蛋白-2表達，上調(diào)蛋白激酶表達，抑制腎臟細胞凋亡，明顯減輕經(jīng)腺嘌呤誘導的 UAN，減輕腎損傷.Wang［10］研究發(fā)現(xiàn)FPS具有抗氧化作用，通過提高抗氧化酶活性，可抑制細胞脂質(zhì)過氧化，并有效緩解腺嘌呤誘導的腎小管間質(zhì)及腎小球系膜區(qū)域的病理損害.Josephine等［11］研究發(fā)現(xiàn)FPS能抑制細胞中ROS生成，降低氧化應激反應，減輕細胞內(nèi)線粒體損傷，緩解環(huán)孢霉素A誘導的腎小管損傷.本實驗采用氧嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤誘導建立UAN大鼠模型，并用不同濃度的FPS進行干預，結果表明FPS具有確切有效地降低UAN大鼠血尿酸水平、改善腎功能的作用.

細胞凋亡是細胞在生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)性、程序性死亡的過程，與細胞增殖共同維持正常的生命活動，兩者調(diào)節(jié)失控可引起多種疾病發(fā)生［12］.腎臟損傷時由內(nèi)源或浸潤細胞線粒體損傷會產(chǎn)生過量ROS可導致生物膜和大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷，引起組織病變及多器官功能的損傷［13］.研究表明，HUA大鼠多種組織細胞均有氧化應激加強，線粒體功能障礙，ATP水平降低［14-15］，而高尿酸體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞可上調(diào)NADPH氧化酶 NOX4蛋白表達，促進ROS生成，誘導細腎小管細胞凋亡［16］，并且ROS的增加可能是誘導Parkin/PINK1依賴性線粒體自噬的重要因素［17］.UAN腎臟損傷的主要病理基礎是腎小管上皮細胞損傷，本研究中腎臟組織免疫組化、電鏡觀察及ELISA檢測ROS含量等結果進一步提示，UAN大鼠腎小管上皮細胞線粒體損傷導致細胞中ROS生成過多，大量ROS可誘導UAN大鼠腎小管上皮細胞發(fā)生程序性凋亡、自噬相關性死亡等病理變化，而FPS可顯著減輕UAN腎小管上皮細胞線粒體損傷、減少細胞過度自噬、抑制腎小管上皮細胞凋亡，這提示FPS改善UAN腎損傷的作用機制與調(diào)控細胞凋亡及自噬過度相關.

綜上所述，UAN的發(fā)生發(fā)展與HUA損傷腎小管上皮細胞線粒體，產(chǎn)生大量ROS誘導細胞凋亡及自噬性死亡相關，而FPS可通過降低ROS水平、減輕細胞線粒體損傷、抗腎小管上皮細胞凋亡等作用，從而有效減輕UAN腎小管上皮細胞損害，本研究為FPS防治UAN提供了基礎藥理學依據(jù)，下一步將在FPS防治UAN的分子機制進行深入研究.

［1］LIU H，ZHANG X M，WANG Y L，et al.Prevalence of hyperuricemia among Chinese adults：a national crosssectional survey using multistage，stratified sampling［J］.Journal of Nephrology，2014，27（6）：653-658.

［2］VEENA C K，JOSEPHINE A，PREETHA S P，et al.Renal peroxidative changes mediated by oxalate：the protective role of fucoidan［J］.Life Sci，2006，79（19）：1789-1795.

［3］FITTON J H，STRINGER D N，KARPINIEC S S.Therapies from Fucoidan：An Update［J］.Mar Drugs，2015，13（9）：5920-5946.

［4］雷作熹，羅仁，李詠梅，等.羊棲菜對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響［J］.中藥藥理與臨床，2006，22（1）：46-48.LEIZ X，LUO R，LIY M，et al.Sargassum fusiforme（Harv） Setchell ameliorates renal interstitial fibrosis caused by unilateral ureteral obstruction ［J］.Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica，2006，22（1）：46-48.

［5］CHOIH K，F(xiàn)ORD E S.Prevalence of the metabolic syndrome in individuals with hyperuricemia［J］.Am J Med，2007，120（5）：442-447.

［6］楊媛，李靜，甄健存，等.抗痛風藥別嘌呤醇、苯溴馬隆及秋水仙堿不良反應報告分析［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2013，33（15）：1296-1297.YANG Y，LI J，ZHEN JC，et al.Analysis of adverse drug reactions of antigout drugs allopurinol，benzbromarone，and colchicine［J］.China Journal of Hospital Pharmacy，2013，33（15）：1296-1297.

［7］李鑫德，李長貴.促進尿酸分解藥物的療效與安全性評價［J］.藥品評價，2015，12（7）：55-60.LIX D，LIC G.Evaluation on the safety and efficacy of drugs promote the decomposition of uric acid［J］.Drugs and Clinic，2015，12（7）：55-60.

［8］FITTON J H， STINGER D N， KARPINIEC S S.Therapies from Fucoidan：An Update［J］.Marine Drugs，2015，13（9）：5920-5946.

［9］WU X L，YAN M，LIU T，et al.Fucoidan elevates surface organic cation transporter 2 expression via upregulation of protein kinase A in uric acid nephropathy［J］.Experimental and Therapeutic Medicine，2017，14（5）：4153-4159.

［10］WANG J， WANG F， YUN H， et al. Effect and mechanism of fucoidan derivatives from Laminaria japonica in experimental adenine-induced chronic kidney disease［J］.JEthnopharmacol，2012，139（3）：807-813.

［11］JOSEPHINE A，AMUDHA G，VEENA C K，et al.Beneficial effects of sulfated polysaccharides from Sargassum wightii against mitochondrial alterations induced by Cyclosporine A in rat kidney［J］.Mol Nutr Food Res，2007，51（11）：1413-1422.

［12］盧曉曄，鐘雪云.Caspases與細胞凋亡（綜述）［J］.暨南大學學報（自然科學與醫(yī)學版），2000，21（6）：121-124.LU X Y，ZHONG X Y.Caspases and apoptosis［J］.Journal of Jinan University（Natural Science＆Medicine Edition），2000，21（6）：121-124.

［13］秦濤余，陳志偉.機體內(nèi)活性氧生理功能研究進展［J］.生命科學器，2008，6（2）：12-16.QIN T Y，CHEN Z W.Progress in physiological functions of reactive oxygen species in the body［J］.Life Science Instruments，2008，6（2）：12-16.

［14］MAARMAN G J，ANDREW BM，BLACKHURSTD M，et al.Melatonin protects against uric acid-induced mitochondrial dysfunction， oxidative stress， and triglyceride accumulation in C2C12 myotubes［J］.JAppl Physiol（1985），2017，122（4）：1003-1010.

［15］SáNCHEZ-LOZADA L G，LANASPA M A，CRISTóBALGARCíA M， et al. Uric acid-induced endothelial dysfunction is associated with mitochondrial alterations and decreased intracellular ATP concentrations［J］.Nephron Experimental nephrology，2012，121（0）：e71-e78.

［16］LIZ，SHENG Y，LIU C，et al.Nox4 has a crucial role in uric acid-induced oxidative stress and apoptosis in renal tubular cells［J］.Mol Med Rep，2016，13（5）：4343-4348.

［17］XIAO B，GOH J Y，XIAO L，et al.Reactive oxygen species trigger Parkin/PINK1 pathway-dependent mitophagy by inducing mitochondrial recruitment of Parkin［J］.J Biol Chem，2017，292（40）：16697-16708.