高血壓病血瘀證患者血清對內皮細胞功能及AMPK激活的影響

鄧波， 江小梨， 劉彬， 張雙偉， 陳利國， 張競之

（1.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，廣東廣州510260；2.暨南大學中醫(yī)學院，廣東廣州510632）

高血壓病是一種以動脈血壓升高為特征、臨床上常見的心血管疾病.據(jù)資料顯示，我國心血管疾病死亡率逐年升高，其死亡率居首位，占居民疾病死亡構成的40%以上，已經高于腫瘤和其他疾?。?］.高血壓病是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┑闹饕ｋU因素之一，高血壓患者發(fā)生冠心病是正常血壓人群的3～4倍［2］，因此預防和控制高血壓有重要臨床意義.血瘀證是高血壓病在中醫(yī)辯證分型中最常見的證型，通過觀察血瘀證患者血清對血管內皮功能障礙的影響，可探討高血壓病血瘀證的機理過程，對防治高血壓引起的冠心病有重要的臨床意義.內皮功能障礙是冠心病發(fā)生的重要因素，其主要表現(xiàn)為內皮依賴性的舒張功能異常、血管內皮黏附功能異常和血管內皮炎癥.本研究借鑒陳利國教授提出的血瘀證病證結合內皮細胞損傷模型［3］，即采用高血壓血瘀證患者血清處理內皮細胞，觀察高血壓病血瘀證患者血清損傷對內皮細胞功能的影響，探討高血壓病血瘀證的病理實質和形成機制.

1 材料與方法

1.1 主要試劑

EBM-2購自 Lonza公司（貨號：CC-3156），胎牛血清（FBS）購自 BI公司（貨號：04-001-1ACS）；細胞裂解液（RIPA）購自碧云天公司（貨號：P0013）、一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（貨號：A013-2）、內皮素（endothelin-1，ET-1）檢測試劑盒（貨號：H093），髓過氧化物酶檢測試盒（貨號：A044）購于南京建成公司；兔抗p-eNOS抗體（貨號：9572）、兔抗 eNOS抗體（貨號：35362）、兔抗 p-腺苷酸活化蛋白激酶 α（adenosine monophosphate activated protein kinaseα，AMPKα）抗體（貨號：2535）、兔抗 AMPKα抗體（貨號：5831）、兔抗甘油醛-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗體 （貨號：2118）及兔-IgG二抗（貨號：7074）購自美國 CST公司；兔抗 ICAM-1抗體（貨號：AF6088）、兔抗VCAM-1抗體（貨號：DF6082）購自美國 Affinity公司；Trizol（貨號：15596018）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（貨號：23250）購自 Thermofisher公司；Prime Script RT逆轉錄試劑盒（貨號：RR037A）、SYBR Green qPCR Master Mix熒光定量PCR試劑（貨號：638320）購自Takara公司；引物由Invitrogene公司合成.

1.2 細胞來源與培養(yǎng)

原代人靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購于 Cell applications公司，采用Lonza的EBM-2內皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃體積分數(shù)為5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液1次，待細胞長滿至80%～90%左右單層時傳代，取第4到6代用于實驗.

1.3 病例來源

病例選擇及血清制備相關標準按文獻［4-5］.

病例選取2016年3月至2017年6月廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院住院確診者.高血壓病診斷符合世界衛(wèi)生組織/國際高血壓學會統(tǒng)一的“高血壓病”診斷標準，血瘀證診斷參照文獻［6］的診療共識.其中高血壓病血瘀證組：40例，其中2級高血壓32例，3級高血壓8例；男21例，女19例；平均收縮壓（164.25±12.17）mmHg，平均舒張壓（102.73±7.58）mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）；平均年齡（64.22±7.83）歲.本課題選用的血瘀證主要證型為：陰虛血瘀證、氣虛血瘀證、痰濕血瘀證，其余少量為氣滯血瘀證和熱結血瘀證，所選病例能較好的代表血瘀證的各種兼證的臨床分布情況.高血壓病非血瘀證組：40例.其中2級高血壓31例，3級高血壓9例；男25例，女15例；平均收縮壓 （166.19±7.56）mmHg，平均舒張壓（103.53±8.47）mmHg；平均年齡（64.60±9.46）歲.兩組患者均為原發(fā)性高血壓患者，排除糖尿病，排除心、腦、腎等靶器官損害及并發(fā)癥，檢查前1周未服用影響血壓的藥物.兩組患者的血壓分級、平均血壓、平均年齡、性別分布、血脂異常無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），具有基線可比性.

1.4 血清采集

試劑患者組及對照組均空腹取血，置入無菌帶帽不抗凝干燥試管，自凝后離心（4℃，2 000 r/min，15 min），取上清液置無菌EP管，凍存于-20℃，備用.

1.5 NO、ET-1含量檢測

將HUVECs接種于24孔培養(yǎng)板中，每組設3個復孔，分別給予體積分數(shù)為10%高血壓病血瘀證或非血瘀證患者血清處理24 h，收集細胞上清，依NO及ET-1檢測試劑盒說明書步驟，檢測NO及ET-1的含量.

1.6 Western blot檢測

將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)板中，每組設3個復孔，分別給予高血壓病血瘀證或非血瘀證患者的血清（體積分數(shù)均為10%）處理24 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后收集細胞，加入適量的RIPA裂解液裂解，BCA蛋白定量試劑盒定量，加入上樣緩沖液，質量分數(shù)為10%SDS-PAGE電泳，100 V，90 min進行轉膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，1×（TBST）液洗滌3次，每次7 min，加入二抗，37℃孵育 1 h，1×TBST液洗滌 3次，每次 7 min.（Electro-Chemi-Luminescence，ECL）化學發(fā)光試劑盒顯色，膠片曝光.

1.7 單核細胞黏附率檢測

HUVECs接種于48孔培養(yǎng)板中，分別給予高血壓病血瘀證或非血瘀證患者血清處理24 h后，PBS洗滌3次，加入新鮮分離的單核細胞1.00×105個，37℃ 孵育30 min，無血清培養(yǎng)基輕柔洗滌2次，去除未結合的粒細胞.每組4個復孔.根據(jù)髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性變化對黏附于內皮細胞上的粒細胞進行定量分析.

粒細胞黏附率（%）＝黏附單核細胞MPO活性/總單核細胞數(shù)（1.00×105個）MPO活性.

1.8 熒光定量PCR檢測

采用Trizol法提取細胞的總RNA，按照Prime Script RT逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，按照SYBR Green qPCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作.分別以 cDNA為模板，以GAPDH為內參，使用定量PCR儀進行熒光定量PCR反應.采用primer premier 5.0，根據(jù)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（NM_000594.3）、白細胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）（NM_000576.2）和 GAPDH（NM_001289745.2）的序列設計引物.引物序列為：TNF-α上游：5′-CCA GGG ACC TCT CTC TAA TCA-3′，TNF-α下游：5′-TCA GCT TGA GGG TTTGCT AC-3′；IL-1β上游：5′-ATG GAC AAG CTG AGG AAG ATG-3′；IL-1β下游：5′-CCC ATG TGT CGA AGA AGA TAG G-3′；GAPDH 上游：5′-GGT GTG AAC CAT GAG AAG TAT GA-3′；GAPDH下游 5′-GAG TCC TTC CACGAT ACC AAA G-3′.反應條件為：95℃預變性30 s；95℃ 5 s、60℃ 15 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)，最后進行熔解曲線的檢測.結果以Ct值顯示，Ct值為每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環(huán)數(shù).采用相對定量法來比較上述基因表達的差異.

1.9 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)采用（均數(shù)±標準差）（±s），多組比較采用單因素方差（One-Way ANOVA），當P＜0.05時，為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 高血壓病血瘀證患者血清對血管內皮依賴性舒縮功能的影響

將HUVECs分為兩組，分別給予體積分數(shù)為10%高血壓病非血瘀證患者血清（對照組，Control）與體積分數(shù)為10%高血壓病血瘀證患者血清（血瘀證組，blood stasis syndrome，BSS），刺激24 h后檢測NO、ET-1以及p-eNOS的表達，觀察高血壓病血瘀證患者血清對血管內皮依賴性舒縮功能的影響.結果顯示，高血壓病血瘀證患者血清能顯著升高ET-1、降低NO的含量和p-eNOS的表達，與高血壓病非血瘀證血清比較，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.提示高血壓病血瘀證患者血清能誘導血管內皮依賴性舒縮功能異常.

圖1 高血壓病血瘀證患者血清對血管內皮依賴性舒縮功能的影響Fig.1 The effects of the serum of on hypertensive patients with blood stasis syndrome on the endothelium dependent relaxation and contraction function

2.2 高血壓病血瘀證患者血清對單核細胞黏附的影響

采用 Western blot法檢測 ICAM-1、VCAM-1的表達量、單核細胞黏附實驗檢測單核細胞黏附率，觀察高血壓病血瘀證患者血清對單核細胞的影響.結果顯示：高血壓病血瘀證患者血清能顯著升高黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達，與高血壓病非血瘀證血清相比較，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.進一步采用單核細胞黏附模型探索高血壓病血瘀證患者血清對單核細胞黏附的影響，發(fā)現(xiàn)高血壓病血瘀證患者血清能升高單核細胞黏附率，與高血壓病非血瘀證血清比較，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.提示高血壓病血瘀證患者血清能誘導單核細胞黏附.

圖2 高血壓病血瘀證患者血清對單核細胞黏附的影響Fig.2 The effects of the serum of on hypertensive patients with blood stasis syndrome on themonocyte adhesion

2.3 高血壓病血瘀證患者血清對內皮炎癥反應的影響

采用qPCR法檢測了炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達，以觀察高血壓病血瘀證患者血清對內皮細胞炎癥的影響.結果顯示，高血壓病血瘀證患者血清能顯著升高TNF-α和IL-1β的表達，與高血壓病非血瘀證血清比較，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.提示高血壓病血瘀證患者血清能誘導內皮細胞炎癥.

圖3 高血壓病血瘀證患者血清對內皮炎癥反應的影響Fig.3 The effects of the serum of on hypertensive patients with blood stasis syndrome on the endothelial inflammation

2.4 高血壓病血瘀證患者血清對內皮細胞AM PK活性的影響

為了探索AMPK在高血壓病血瘀證誘導內皮功能障礙中的作用，本組進一步采用Westernblot法檢測了高血壓病血瘀證患者血清對AMPK激活的影響，發(fā)現(xiàn)高血壓病血瘀證患者血清顯著抑制磷酸化AMPKα的表達，與高血壓病非血瘀證血清比較，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.提示高血壓病血瘀證可能與抑制AMPK有關.

圖4 高血壓病血瘀證患者血清對內皮細胞AMPK活性的影響Fig.4 The effects of the serum of on hypertensive patients with blood stasis syndrome on the activation of AMPK

3 討論

血瘀證是高血壓病中醫(yī)辨證分型中最常見的證型之一，是由多種病理因素所致的“血行失度”、“血脈瘀阻”的病理過程，形成機理復雜.“心主血脈”、“脈不通則血不流”、“脈道以通，血氣乃行”等提示其機理的研究應更關注血管與血瘀證形成的關系，因此探討“脈”以及“血”與“脈”的關系成為研究重點.血瘀證與血管內皮功能具有相關性［7］，一方面血瘀證能加重血管內皮功能障礙，另一方面血管內皮功能障礙亦能造成脈道瘀血及“血瘀”的程度，兩者相互促進，形成惡性循環(huán).既往研究表明血瘀證者患冠心病的危險是非血瘀證者的8.959倍［8］.本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與高血壓非血瘀證相比，高血壓血瘀證血清對內皮細胞損傷程度更為嚴重［9-10］.本研究從內皮依賴性的舒縮功能異常、血管內皮黏附功能異常和血管內皮炎癥3個方面探索高血壓病血瘀證血清對內皮功能的影響.研究結果表明，與高血壓非血瘀證組比較，高血壓病血瘀證患者血清能顯著降低NO含量、eNOS的活性、升高ET-1的含量，這提示高血壓病血瘀證患者血清能引起內皮依賴性的舒縮功能異常.本研究結果顯示高血壓血瘀證患者血清能夠升高黏附因子ICAM-1、VCAM-1的表達量，明顯提升單核細胞黏附率，提示高血壓病血瘀證患者血清能誘導單核細胞黏附.另外，在內皮細胞炎癥反應方面，高血壓血瘀證患者血清能明顯升高炎性因子TNF-α、IL-1β的表達水平，提示高血壓血瘀證患者血清能加重內皮炎癥反應；高血壓病血瘀證患者血清能誘導血管內皮功能障礙.

腺苷酸活化蛋白激酶（adenosinemonophosphate activated protein kinaseα，AMPKα）是參與調節(jié)生物能量代謝關鍵分子，各種代謝相關的組織或細胞都有所表達［11］.當機體受到細胞應激、運動和多種激素等刺激后，這將會使AMPK活化［12-13］.AMPK具有調節(jié)eNOS活性以及NO生物合成，維持血管內皮的正常功能的作用.在內皮細胞中，活化的AMPK可以磷酸化和激活 eNOS（Ser1177）［14］，這個位點被激活可以降低 eNOS對 Ca2+的敏感性［15］，同時 eNOS促進血管內皮分泌 NO［16］，繼而舒張痙攣的血管，改善內皮功能，延緩心血管疾病進程.AMPK激動劑AICAR不僅能夠抑制TNFα誘導的單核細胞與內皮細胞黏附，還可以抑制內皮細胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素（E-selectin）的表達和分泌，而且上述效應可以被AMPK抑制劑 Compound C逆轉或緩解［17-18］.同時有研究表明AMPK活化可以抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的炎癥反應［19］.研究表明，臨床上廣泛用于治療糖尿病［20］、降血壓［21］等藥物通過激活AMPK發(fā)揮心血管保護作用.本研究探索AMPK在高血壓病血瘀證患者血清誘導血管內皮功能障礙中的作用，結果提示高血壓病血瘀證患者血清顯著抑制AMPKα的活性.由此，推測高血壓血瘀證患者血清有可能是通過抑制AMPKα的活性，從而抑制內皮功能障礙.

本研究明確了高血壓病血瘀證患者血清能誘導內皮功能障礙，同時，高血壓病血瘀證患者血清顯著抑制內皮細胞AMPK活性，其誘導內皮功能障礙作用可能與抑制AMPK有關.AMPK在心血管疾病防治中是一個重要的潛在靶點，而活血化瘀類中草藥具有心血管保護的作用或許與激活AMPK相關.

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