Twist1蛋白在潰瘍性結(jié)腸炎及其相關(guān)性結(jié)直腸癌的表達(dá)及意義

歐陽(yáng)滿照， 唐立， 姚學(xué)清， 陸巖， 伍錦浩，張偉杰， 廖天佑， 羅振濤

（1.南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院胃腸外科，佛山順德528308；2.廣東省人民醫(yī)院 普通外科，廣東廣州510080）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）所致的潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌（ulcerative colitisassociated colorectal cancer，ucCRC）是 UC嚴(yán)重并發(fā)癥之一，占UC患者死亡原因的10%～15%［1］.有研究發(fā)現(xiàn)Twist1在部分慢性炎癥性疾病中有較高的表達(dá)［2］，但Twist1在ucCRC中的表達(dá)情況尚未見(jiàn)明確報(bào)道.同時(shí)，也有研究表明Twist1具有癌基因特性，能編碼凋亡抑制蛋白，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡［3-5］，但 Twist1是否參與“UC→ucCRC”的癌變過(guò)程及其機(jī)制仍不完全明確.本研究通過(guò)收集腸鏡檢查的患者腸道標(biāo)本并構(gòu)建UC細(xì)胞模型，通過(guò)分組并檢測(cè)Twist1的表達(dá)情況，初步探討Twist1蛋白在“UC→ucCRC”的癌變過(guò)程中的可能機(jī)制.

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料

收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院（原南方醫(yī)科大學(xué)順德第一人民醫(yī)院）病理科2015年1月至2017年12月存檔的蠟塊標(biāo)本，共分為3組：正常對(duì)照組（13例），取自正常人志愿者，經(jīng)腸鏡及病理檢查確認(rèn)無(wú)UC及ucCRC；UC組（35例），臨床與病理皆確診為UC；ucCRC組（11例），均有UC病史，臨床與病理皆確診為結(jié)直腸癌.本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，患者及其家屬術(shù)前均簽署知情同意書(shū).

1.1.2 細(xì)胞選取

人高分化結(jié)腸腺癌Caco2細(xì)胞株購(gòu)自上海ATCC細(xì)胞庫(kù).

1.1.3 主要試劑和儀器

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（中國(guó)碧云天公司）；葡萄糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）（美國(guó) MP Biomedicals公司），Twist1單克隆抗體（美國(guó)Santa公司）；Bcl-2多克隆抗體（美國(guó)Bioworld公司）；超敏SP法免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；RM2235切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；正置顯微鏡（日本Olympus公司）.

1.2 方法

1.2.1 腸道組織中Twist1表達(dá)檢測(cè)

應(yīng)用免疫組化檢測(cè)Twist1表達(dá).將收集的標(biāo)本蠟塊經(jīng)切片機(jī)4μm連續(xù)切片，制片后經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，然后根據(jù)免疫組化按超敏SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法）免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用枸櫞酸鹽緩沖液加熱修復(fù)抗原，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，Twist1單克隆抗體按1∶200稀釋并4℃條件下孵育過(guò)夜，二抗孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺（diamino benzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂封片.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將Caco2細(xì)胞用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng).用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰酶消化細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，傳至3、4代左右，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，增殖旺盛的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究.

1.2.3 UC細(xì)胞模型構(gòu)建及分組

取指數(shù)生長(zhǎng)期的Caco2細(xì)胞，分為正常對(duì)照組、DSS作用2 d組、DSS作用4 d組，每24 h對(duì)進(jìn)行換液：正常對(duì)照組選取DMEM+質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基換液，DSS作用2 d組、DSS作用4 d組選取3 mL的DMEM+質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS+質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%DSS培養(yǎng)基（DSS直接按比例溶于培養(yǎng)基中，溶解后用孔徑10 nm的濾頭過(guò)濾）換液.

1.2.4 Twist1和 Bcl-2表達(dá)檢測(cè)

采用Western Blot法對(duì)各組 Twist1、Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè).Western及IP細(xì)胞裂解液（RIPA）裂解細(xì)胞提取蛋白，調(diào)整濃度后進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、Twist1、Bcl-2、β-actin（1∶1 000）抗體4℃搖床孵育過(guò)夜，二抗37℃條件下孵育2 h，通過(guò)動(dòng)物成像儀掃描成像.用ImageJ圖像分析軟件對(duì)條帶密度掃描，以測(cè)量出的灰度值比值為蛋白的相對(duì)表達(dá)含量.

1.2.5 結(jié)果判定

實(shí)驗(yàn)中Twist1蛋白的表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕色或棕褐色沉著表現(xiàn).采集每張切片上的5個(gè)高倍視野（400倍），每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)計(jì)算每張切片所選5個(gè)視野的平均陽(yáng)性細(xì)胞百分率.平均陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分.染色強(qiáng)度計(jì)分：若不染色則為0分，若為淡黃色則為1分，若為棕黃色則為2分，若為棕褐色則為3分.最后將每張切片的平均陽(yáng)性細(xì)胞百分率分值與相應(yīng)的平均染色強(qiáng)度分值相乘得到其染色分?jǐn)?shù)：≤3分為陰性，4分為弱陽(yáng)性，6分為陽(yáng)性，9分為強(qiáng)陽(yáng)性.將弱陽(yáng)性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性定義為陽(yáng)性，陰性定義為陰性［6］.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理.計(jì)數(shù)資料比較采用Radit分析和χ2檢驗(yàn)分析，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性，采用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較；方差不齊，采用Dunnett’s T3法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 各組腸道組織中Twist1蛋白的表達(dá)情況

Twist1蛋白可在腸道上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核表達(dá)，且以細(xì)胞質(zhì)為主.檢測(cè)結(jié)果顯示：Twist1在正常對(duì)照組、UC組和ucCRC組中均有表達(dá).但正常對(duì)照組中Twist1表達(dá)比較較弱，陽(yáng)性表達(dá)率為7.7%（1/13），與其他兩組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）.而 ucCRC組中的 Twist1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為90.1%（10/11），較UC組的陽(yáng)性表達(dá)率82.9%（29/35）有所升高（P＜0.05，圖 1）.

圖1 各組腸道組織中Twist1蛋白的免疫組化檢測(cè)（SP×400）Fig.1 Immunohistochemical detection of Twist1 protein in intestinal tissues of each group（SP×400）

2.2 各組Twist1蛋白表達(dá)與患者臨床病理因素關(guān)系

UC組和ucCRC組中Twist1蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）.其中，Twist1蛋白在潰瘍性結(jié)腸炎組織中的表達(dá)水平與患者的年齡、性別無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05）.同時(shí)，Twist1蛋白在潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌組織的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05，表1、表2及表3）.

表1 Twist1在正常對(duì)照組、UC組和ucCRC組之間的表達(dá)Table 1 Expression of Twist1 in normal，UC，and ucCRC groups

表2 35例UC患者臨床病理因素與Twist1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率之間的關(guān)系Table 2 Relationship between clinicopathologic factors and positive expression of Twist1 protein in 35 UC patients n（%）

表3 11例ucCRC患者臨床病理因素與Twist1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率之間的關(guān)系Table 3 Relationship between clinicopathological factors and positive expression of Twist1 protein in 11 patients with ucCRC

2.3 UC模型細(xì)胞中各組Twist1蛋白的表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，DSS作用2 d組和DSS作用4 d組的Twist1表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），同時(shí)DSS作用4 d組的Twist1表達(dá)量也較DSS作用 2 d組增高（P＜0.05）.此外，與正常對(duì)照組比較，DSS作用2 d組和DSS作用4 d組的Bcl-2表達(dá)量也明顯增高（P＜0.05），但兩組之間Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05，圖2、圖3）.

圖2 各組UC模型細(xì)胞中Twist1蛋白Western blot電泳圖Fig.2 Western blot analysis of Twist1 protein in UCmodel cells in each group

圖3 各組UC模型細(xì)胞中Twist1蛋白表達(dá)情況柱狀圖Fig.3 Twist1 protein expression histogram in each group of UCmodel cells

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是指發(fā)生在結(jié)直腸的慢性非特異性炎癥，其病程漫長(zhǎng)，常反復(fù)發(fā)作，遷延難愈，且易誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌［7］.其癌變機(jī)制可能與UC中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmensenchymal transition，EMT）的發(fā) 生 有 關(guān)［9］.Twist1作為EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子，已明確其在部分慢性炎癥中由較高的表達(dá)［2］，同時(shí)Twist1也與細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)系.然而目前關(guān)于Twist1在UC和ucCRC中的表達(dá)情況在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，且Twist1是否在“UC→ucCRC”的轉(zhuǎn)變過(guò)程中起重要作用仍未清楚.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建UC細(xì)胞模型以及收集人體UC和ucCRC腸道標(biāo)本并檢測(cè)Twist1的表達(dá)情況，初步探討Twist1蛋白在“UC→ucCRC”的癌變過(guò)程中的可能機(jī)制.

3.1 Twist1在UC、ucCRC組織中的表達(dá)

Twist1是 Twist家族下的重要成員，學(xué)者Niesner［2］研究發(fā)現(xiàn) Twist1可由具有被反復(fù)刺激特征的效應(yīng)記憶Th細(xì)胞所表達(dá)，這種記憶Th細(xì)胞是慢性炎癥的特征性細(xì)胞，因此，Twist1可能在潰瘍性結(jié)腸炎等慢性炎癥性疾病中有較高的表達(dá).同時(shí)，近年研究表明活動(dòng)性UC中有EMT的發(fā)生［8］，也有研究指出EMT與結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，更有部分學(xué)者認(rèn)為EMT是聯(lián)系免疫炎癥反應(yīng)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的橋梁，是“炎-癌”鏈中的重要事件.而Twist1作為EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子，除在慢性炎癥疾病中有表達(dá)之外，有理由認(rèn)為其在結(jié)直腸癌腫瘤中也呈高表達(dá).本次研究結(jié)果顯示，Twist1蛋白在UC組織、ucCRC組織中均有高表達(dá)，且陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常結(jié)直腸組織.因此，推測(cè)Twist1可能在UC發(fā)展和UC惡化過(guò)程中起到某種重要的聯(lián)系或促進(jìn)作用.

3.2 Twsit1在UC細(xì)胞模型的表達(dá)

使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%DSS誘導(dǎo)人高分化結(jié)腸腺癌Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腸炎模型細(xì)胞研究UC及ucCRC已被廣泛應(yīng)用［9-10］.本研究通過(guò)參考上述造模方法，應(yīng)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%DSS作用于Caco-2細(xì)胞，成功誘導(dǎo)UC細(xì)胞模型的建立，并從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角度進(jìn)一步驗(yàn)證Twsit1的表達(dá)情況.應(yīng)用2%DSS分別刺激Caco-2細(xì)胞2 d和4 d后，Twist1的表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯升高.也從體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了Twist1在UC及ucCRC中也呈高表達(dá).

3.3 Bcl-2蛋白在UC細(xì)胞模型中的表達(dá)情況

有研究指出Twist1基因具有癌基因的特性，能夠編碼凋亡抑制蛋白，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡.目前Bcl-2是腫瘤治療的一個(gè)已知靶標(biāo)，可讓癌細(xì)胞通過(guò)抗細(xì)胞凋亡而逃避細(xì)胞死亡，其作用機(jī)理可能與抑制Caspase-3的活化或類(lèi)似蛋白酶的活性進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生［11］.本研究結(jié)果表明，在Twist1蛋白表達(dá)量提高的UC模型細(xì)胞中，抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2表達(dá)也明顯提高，提示著Twist1與細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)系.因此，Twist1可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路使UC細(xì)胞逃避死亡，從而進(jìn)一步促進(jìn)UC細(xì)胞的癌變.

綜上，Twist1蛋白在 UC、ucCRC組織和 UC模型細(xì)胞中均有高表達(dá)，Twist1在“UC→ucCRC”的癌變過(guò)程中起重要的聯(lián)系或促進(jìn)作用，有可能是今后臨床上預(yù)防 ucCRC的發(fā)生發(fā)展、篩選ucCRC患者腫瘤標(biāo)記物、提供藥物治療新靶點(diǎn)及預(yù)后評(píng)估的重要基因蛋白，但目前具體分子機(jī)制及其與其他相關(guān)基因的關(guān)系如何，有待進(jìn)一步研究.

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