小麥小花細(xì)胞核蛋白質(zhì)雙向電泳體系的優(yōu)化

宋歸華，張迎新,2，侯澤豪，孫坤坤，方正武，馬東方，張改生，王書平

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/湖北省澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北荊州 434025；2. 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所, 北京 100101；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/小麥育種教育部工程研究中心，陜西楊凌 712100)

在真核細(xì)胞當(dāng)中，細(xì)胞核是一個(gè)重要的亞細(xì)胞器，更是遺傳信息的主要儲(chǔ)存場(chǎng)所，包含著絕大多數(shù)DNA，是細(xì)胞遺傳與代謝的活動(dòng)中心[1]。而細(xì)胞核蛋白質(zhì)在基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等方面具有決定性的作用[2]。全細(xì)胞蛋白質(zhì)中約10%～20%的蛋白質(zhì)位于細(xì)胞核當(dāng)中，在復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)和生理過程中扮演著重要的角色，暗示著細(xì)胞核具有的功能多樣性與這些蛋白質(zhì)密切相關(guān)[3-4]。此外，高等植物中，除韌皮部成熟的篩管等極少數(shù)細(xì)胞外，其他細(xì)胞都具有細(xì)胞核[5]。因此，研究細(xì)胞核的蛋白質(zhì)組成及其動(dòng)態(tài)變化，對(duì)于深入解析植物生長(zhǎng)發(fā)育與逆境脅迫應(yīng)答過程中基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制具有至關(guān)重要的意義。

蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)于廣泛分析蛋白質(zhì)表達(dá)、轉(zhuǎn)錄后翻譯以及蛋白質(zhì)之間的相互作用具有主導(dǎo)性作用。但由于高等真核細(xì)胞的復(fù)雜性，對(duì)其全細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，受到諸多因素的限制，例如蛋白質(zhì)豐度、大小、疏水性及其他電泳特性等。而將全細(xì)胞蛋白質(zhì)組依據(jù)細(xì)胞的大分子結(jié)構(gòu)(包括亞細(xì)胞隔室、亞細(xì)胞器、大分子結(jié)構(gòu)、多蛋白復(fù)合物等)分解成一系列亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組[6]，這不僅降低了全細(xì)胞分析的復(fù)雜性，而且為我們提供了蛋白質(zhì)定位及通路劃分方面的重要信息[7]，目前已經(jīng)在小麥線粒體[8-9]、葉綠體[10]、質(zhì)膜[11]等亞細(xì)胞器中得到了廣泛的應(yīng)用。近年來，隨著植物蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的日趨成熟、各類植物基因組測(cè)序工作的不斷完成以及細(xì)胞核蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的逐漸完善，極大地促進(jìn)了細(xì)胞核蛋白質(zhì)組學(xué)在植物中的應(yīng)用。目前，有關(guān)植物細(xì)胞核蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要集中在雙子葉植物的擬南芥(Arabidopsisthaliana)[12-14]、蘋果(Maluspumila)[15]、鷹嘴豆(Cicerarietinum)[16-18]、大豆(Glycinemax)[19]、番茄(Solanumlycopersicum)[20]以及單子葉植物的水稻(Oryzasativa)[2, 21-23]、洋蔥(Alliumcepa)[24]、維柯薩(Xerophytaviscosa)[25-27]、玉米(Zeamays)[28]等，而在其他植物上，尤其是小麥細(xì)胞核蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究鮮見報(bào)道。眾所周知，針對(duì)于亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)，如何獲得高純度、完整性好的細(xì)胞核是進(jìn)行其蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提之一。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道并建立了擬南芥[12-13]、水稻[2, 21-22]、維柯薩[25-27]等細(xì)胞核蛋白質(zhì)雙向電泳體系，涉及懸浮細(xì)胞[13, 21-22]、葉片[12, 15, 25-27]、幼苗[2, 16-18]、根尖分生組織[2]等不同的組織器官。由于植物間細(xì)胞核在細(xì)胞大小、蛋白質(zhì)含量、次生代謝物、亞細(xì)胞組分相關(guān)聯(lián)程度等方面存在顯著的差異，因此探索不同植物細(xì)胞核及其蛋白質(zhì)的最佳提取方法，建立和優(yōu)化蛋白質(zhì)2-DE技術(shù)對(duì)提高特異組織細(xì)胞核的分辨率仍是亟待解決的問題[9]。

本研究以小麥三核期小花為材料，對(duì)細(xì)胞核蛋白質(zhì)組學(xué)中細(xì)胞核的分離與純化、蛋白質(zhì)提取方法、SDS-PAGE膠濃度、上樣量等方面進(jìn)行了優(yōu)化，探索出一套適合于小麥小花細(xì)胞核分離及純度鑒定的方法，建立了分辨率高和重復(fù)性好的細(xì)胞核蛋白質(zhì)2-DE的分析體系，以期對(duì)今后開展小麥細(xì)胞核蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供理論和技術(shù)支撐，也為其他同科、屬植物的細(xì)胞核2-DE蛋白質(zhì)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料與處理

供試材料為正常發(fā)育小麥品種西農(nóng)1376，在散粉前，通過株型、穗型結(jié)合鏡檢來判斷花藥小孢子發(fā)育時(shí)期，4 ℃剝?nèi)∪似谛』?去芒和穎片)。

1.2 細(xì)胞核的分離與純化

稱取小麥小花(去芒和穎片)60 g，于含有0.3% PVP的液氮中快速研磨成粉末。將研磨好的粉末置于600 mL預(yù)冷的蔗糖緩沖液(0.5 mol·L-1蔗糖, 80 mmol·L-1KCl, 10 mmol·L-1EDTA, 1 mmol·L-1亞精胺, 1 mmol·L-1精胺, 10 mmol·L-1Tris-HCl, pH 9.5)中，冰浴20 min；輕柔混勻后加入0.15% β-Me和0.5% Triton X-100，4 ℃下裂解20 min，每隔2 min輕柔攪拌一次，每次20 s。均勻后，用2層紗布和1層Miracloth過濾，濾液于4 ℃下1 800 r·min-1離心20 min。棄上清，沉淀用軟毛筆懸浮于150 mL蔗糖緩沖液中；2層Mirocloth過濾，4 ℃、57 r·min-1離心2 min。取上清，4 ℃、1 800 r·min-1離心15 min；沉淀經(jīng)懸浮后，4 ℃、1 800 r·min-1離心10 min。棄上清，最后得到的沉淀即為細(xì)胞核。

1.3 細(xì)胞核蛋白質(zhì)的制備、定量及SDS-PAGE檢測(cè)

依據(jù)陳 征等[9]和宋齊魯?shù)萚11]的方法，略有改動(dòng)，提取蛋白質(zhì)樣品。在細(xì)胞核樣品中加入預(yù)冷的TCA-丙酮溶液(10% TCA，0.07% β-ME，1 mmol·L-1PMSF)，在-20 ℃下過夜沉淀蛋白質(zhì)。4 ℃下25 000 r·min-1離心30 min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的丙酮溶液(0.07% β-ME， 1 mmol·L-1PMSF)洗滌，-20 ℃下靜置1 h后，4 ℃下25 000 r·min-1離心30 min，重復(fù)離心、洗滌至沉淀物為純白色。加入預(yù)冷的80%丙酮，重懸沉淀，-20 ℃下靜置1 h；4 ℃下25 000 r·min-1離心30 min，沉淀冷凍成干粉。

將細(xì)胞核蛋白質(zhì)干粉溶解于裂解緩沖液[9 mol·L-1尿素，4% CHAPS，65 mmol·L-1DTT，0.5% IPG(pH 4～7)緩沖液，0.001%溴酚藍(lán)]中，分別于液氮與32 ℃水浴中交替凍融3次，22 ℃下25 000 r·min-1離心15 min，上清液為蛋白質(zhì)樣品，Bradford法[29]測(cè)定樣品液蛋白質(zhì)含量。

1.4 細(xì)胞核純度檢測(cè)

分別在細(xì)胞器和蛋白質(zhì)水平上對(duì)分離到的細(xì)胞核進(jìn)行純度檢測(cè)。細(xì)胞核的顯微觀察采用DAPI熒光染色法[30]。分離過程中各個(gè)組分葉綠素含量的測(cè)定參考Dean和Miskiewicz的方法[31]進(jìn)行，包括勻漿液、首次沉淀、最終的上清液及細(xì)胞核沉淀。在1 mL懸浮樣品中分別加入8 mL丙酮和1 mL ddH2O，室溫下避光萃取過夜，1 000 r·min-1離心5 min，立即在652 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

細(xì)胞核蛋白質(zhì)經(jīng)12%的PAGE-SDS電泳分離后進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜，以TBST(含5% BSA)溶液封閉后，依次經(jīng)一抗(Anti-histone core antibody；Abcam公司，ab7832)和二抗(Abcam公司)孵育后，最后用堿性磷酸酶底物顯色試劑盒顯色。

1.5 固相pH梯度雙向電泳

參照宋齊魯?shù)萚11]的方法進(jìn)行。取適量蛋白質(zhì)樣品與水化液共350 μL充分混勻后，加入聚焦槽內(nèi)。將17 cm(pH 4～7) IPG膠條膠面朝下置于樣品溶液上，被動(dòng)吸收1 h后，加3 mL礦物油覆蓋膠條，置于IPG-phor等電聚焦儀進(jìn)行等電聚焦，設(shè)置極限電流為50 μA。等電聚焦結(jié)束后，依次用含2% DTT和2.5%碘乙酰胺的平衡緩沖液(6.0 mol·L-1尿素，2%SDS，0.375 mol·L-1Tris-HCl pH 8.8，20%甘油)分別平衡15 min。然后將IPG膠條轉(zhuǎn)移到SDS-PAGE凝膠上，用低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液密封排除氣泡，電流20 mA。其中，上樣量參考陳 征等[9]和王書平等[10]的方法進(jìn)行，分別為200 μg、230 μg和250 μg；膠濃度設(shè)定為11%、12%和13%[11]。待溴酚藍(lán)前沿距玻璃板下緣0.5 cm時(shí)停止電泳，凝膠染色按改良后的硝酸銀染方法操作，見表1。

表1 蛋白質(zhì)硝酸銀染步驟Table 1 Sliver staining protocol for proteins

1.6 凝膠圖像分析

銀染后的2-DE凝膠用光密度掃描儀UMAX PowerLook 2100XL掃描。在PDQuest 2DE 8.0.1分析軟件的輔助下，對(duì)圖像進(jìn)行背景扣除、強(qiáng)度校正、標(biāo)準(zhǔn)化、斑點(diǎn)檢測(cè)、獲取斑點(diǎn)位置坐標(biāo)等分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和表格繪制，采用OriginPro 2017軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥小花細(xì)胞核的分離純度

利用高滲蔗糖緩沖液分離出了小麥小花細(xì)胞核，并通過反復(fù)的差速離心技術(shù)去除了其他細(xì)胞器的污染，富集到了高濃度的細(xì)胞核。通過對(duì)葉綠素含量的測(cè)定和比較，葉綠素在其他分離組分中含量較高，為99.8%，而在富集純化后的細(xì)胞核中僅為1.8%(圖1A)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后，呈現(xiàn)出較為均勻、清晰的細(xì)胞輪廓，細(xì)胞核完整性較高。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，完整細(xì)胞核的分離效率達(dá)到95%以上(圖1B)。為了進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞核蛋白質(zhì)的富集情況進(jìn)行分析，采用梯度SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離(圖1C)及用細(xì)胞核組蛋白特異性抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)(圖1D)。結(jié)果表明，所制備的細(xì)胞核蛋白質(zhì)條帶分布均勻、清晰，組蛋白H1、H3、H2B顯示全面完整。綜合以上結(jié)果，分離獲得的細(xì)胞核污染少，純度較高，所制備的細(xì)胞核蛋白質(zhì)組次生代謝物質(zhì)含量較低，且較為完整。

A：不同分離純化階段葉綠素含量測(cè)定；1：粗提液；2：沉淀；3：上清液；4：細(xì)胞核；B：細(xì)胞核DAPI染色；C：細(xì)胞核蛋白質(zhì)SDS-PAGE(12%)；M：Marker；N：細(xì)胞核蛋白質(zhì)；D：組蛋白免疫印跡分析。

A:Determination of chlorophyll content at different stages of purification; 1:Crude homogenate; 2:Pellet; 3:Supernatant; 4:Nuclear fraction; B:The purified nuclear fraction was stained with DAPI; C:SDS-PAGE(12%) Silver-stained image of extracted nuclear proteins;M:Marker; N:Nuclear fraction;D:Western blot analysis of extracted nuclear proteins with anti-histone core.

圖1細(xì)胞核的分離提取及純度鑒定

Fig.1Isolationandpuritydeterminationofthenuclearfraction

2.2 不同SDS-PAGE凝膠濃度對(duì)2-DE圖譜的影響

SDS-PAGE凝膠濃度決定了細(xì)胞核蛋白質(zhì)組的分離效果，并有效確保高、低分子量蛋白質(zhì)點(diǎn)在2-DE圖譜上的均勻分布。從圖2來看，當(dāng)凝膠濃度為11%時(shí)，高分子量蛋白質(zhì)點(diǎn)(>26 kD)得到了相對(duì)較好的分離，但低分子量蛋白質(zhì)點(diǎn)(<20 kD)由于超出了凝膠的分離范圍，部分蛋白質(zhì)點(diǎn)未能在圖譜上檢測(cè)到，此時(shí)檢測(cè)到細(xì)胞核蛋白質(zhì)組數(shù)量為241個(gè)(圖2A)。改用13%的凝膠后，蛋白質(zhì)點(diǎn)在圖譜上的分布情況恰恰相反，表現(xiàn)為高分子量蛋白質(zhì)點(diǎn)高度凝聚，部分蛋白質(zhì)點(diǎn)不能有效識(shí)別，進(jìn)而降低了分辨率(圖2C)，共檢測(cè)到223個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。而經(jīng)12%凝膠進(jìn)行分離后，整個(gè)細(xì)胞核蛋白質(zhì)組得到了較好的分離效果(圖2B)，蛋白質(zhì)點(diǎn)分布均勻且清晰圓潤(rùn)，共檢測(cè)獲得264個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。這表明采用凝膠濃度為12%更能對(duì)細(xì)胞核蛋白質(zhì)組進(jìn)行有效地分離。

A:11% SDS-PAGE;B:12% SDS-PAGE;C:13% SDS-PAGE. 圖2 不同SDS-PAGE凝膠濃度的2-DE圖譜比較分析Fig.2 Comparison of 2-DE maps of different SDS-PAGE gel concentration

2.3 不同上樣量對(duì)2-DE圖譜的影響

蛋白質(zhì)的上樣量大小直接決定了2-DE圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)量。結(jié)果表明，上樣量為200 μg時(shí)，2-DE圖譜上低豐度蛋白質(zhì)較弱或無顯示，蛋白點(diǎn)數(shù)量較少，共檢測(cè)到212個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(圖3A)。隨著上樣量的增加，蛋白點(diǎn)的數(shù)量呈上升趨勢(shì)。當(dāng)上樣量增至250 μg時(shí)，高豐度蛋白質(zhì)明顯聚集，堿性端出現(xiàn)過飽和重疊現(xiàn)象，2-DE圖譜上縱橫條紋明顯，背景加深，點(diǎn)與點(diǎn)之間難以分離，不利于后期檢測(cè)和分析，此時(shí)，共檢測(cè)到241個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(圖3C)。上樣量為230 μg時(shí)，低豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)增加，無橫條紋干擾，圖譜清晰，蛋白質(zhì)點(diǎn)獨(dú)立清晰，共檢測(cè)到264個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(圖3B)。

2.4 小麥小花細(xì)胞核蛋白質(zhì)組在2-DE圖譜上的分布特征

等電點(diǎn)分析結(jié)果表明，在pI 4.0～4.5區(qū)域內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)最少，為16±1個(gè)，pI 6.0～6.5區(qū)域內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)最多，為71±5個(gè)，其他等電點(diǎn)區(qū)域表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)分別為43±4個(gè)(pI 4.5～5.0)、50±3個(gè)(pI 5.0～5.5)、55±4個(gè)(pI 5.5～6.0)、29±2個(gè)(pI 6.5-7.0)(圖4A)。在分子量方面，14.4 kD以下區(qū)域內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)最少，為3±1個(gè)，45.0～66.2 kD區(qū)域內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)最多，為85±4個(gè)，其他分子量區(qū)域內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)分別為20±2個(gè)(14.4～20.0 kD)、16±2個(gè)(20.0～26.0 kD)、10±1個(gè)(26.0～33.0 kD)、42±3個(gè)(33.0～45.0 kD)、38±2個(gè)(66.2～94.0 kD)、50±3個(gè)(>94.0 kD)(圖4B)。

A：上樣量為200 μg的2-DE圖譜；B：上樣量為230 μg的2-DE圖譜；C：上樣量為250 μg的2-DE圖譜。

A:2-DE maps obtained with loading proteins samples of 200 μg; B:2-DE maps obtained with loading proteins samples of 230 μg;C:2-DE maps obtained with loading proteins samples of 250 μg.

圖3不同上樣量的2-DE圖譜比較

Fig.3Comparisonof2-DEmapsofdifferentloadingquantity

A：蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)分布特征；B：蛋白質(zhì)的分子量分布特征。

A:Distribution of protein spots according to isoelectric point(pI);B:Distribution of protein spots according to and molecular weight(MW).

圖4細(xì)胞核蛋白質(zhì)點(diǎn)的分布特征

Fig.4Distributionofnuclearproteinsspots

3 討 論

植物與動(dòng)物和微生物相比，具有細(xì)胞壁、葉綠體、次生代謝物多等特點(diǎn)，因此植物的細(xì)胞核提取也就相對(duì)較為困難。亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的上游研究技術(shù)是亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的提取和純化即細(xì)胞的分級(jí)分離，一般葉綠體沉降系數(shù)為3×105 s，密度為1.21 g·cm-3；線粒體沉降系數(shù)為1～1.7×104s，密度為1.18～1.19 g/cm3；而細(xì)胞核沉降系數(shù)為7×106s左右，密度為1.3 g·cm-3[10]。因此，各細(xì)胞組分依據(jù)浮力密度的不同可逐級(jí)有效分離。目前的植物細(xì)胞核蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要是從植物葉片、幼苗或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中提取細(xì)胞核，再利用勻漿機(jī)破碎或細(xì)胞壁水解酶除去細(xì)胞壁，然后通過改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓破碎原生質(zhì)體，并利用不同的離心方式以富集細(xì)胞核[1]。本研究中，通過在小麥小花研磨過程中加入0.3% PVP，不僅有效去除了多糖多酚等次生代謝物的污染，同時(shí)也減少了細(xì)胞核蛋白質(zhì)的修飾。而在蔗糖溶液中加入適當(dāng)濃度的Triton X-100(0.5%)，能夠在短時(shí)間內(nèi)裂解細(xì)胞膜，避免了對(duì)核膜的損傷。在細(xì)胞核分離過程中，本研究采用的差速離心法簡(jiǎn)單快捷，已經(jīng)在其他作物上得到了應(yīng)用[2,16-20, 24, 28]。就小麥三核期小花而言，其含有更多的多糖、淀粉粒及部分未破裂的花粉粒等物質(zhì)。依據(jù)這一特性，本研究在離心過程中適當(dāng)?shù)倪M(jìn)行了優(yōu)化，在增加過濾次數(shù)(2次)的同時(shí)也相應(yīng)增加了離心洗滌次數(shù)，通過不同的離心速率最大程度地去除了質(zhì)膜、葉綠體、線粒體、細(xì)胞質(zhì)等的污染。

亞細(xì)胞純度鑒定是確保后續(xù)研究順利實(shí)施的前提。本研究分別采用三種方法來進(jìn)行細(xì)胞核純度檢測(cè)，首先測(cè)定細(xì)胞核制備液中葉綠素含量，以確定葉綠體在細(xì)胞核中的污染程度；其次通過對(duì)獲取的細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色，經(jīng)顯微鏡觀察以直觀的判斷亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)特征，觀察是否有其他組分的存在及研究對(duì)象的完整性；最后制備細(xì)胞核蛋白質(zhì)，以組蛋白為細(xì)胞核標(biāo)記蛋白質(zhì)，通過免疫印跡技術(shù)來檢測(cè)細(xì)胞核蛋白質(zhì)的純度。經(jīng)比較分析，本研究所提取的細(xì)胞核純度較高，所制備的細(xì)胞核蛋白質(zhì)組次生代謝物質(zhì)含量較少，較完整。這為雙向電泳的順利開展奠定了材料基礎(chǔ)。

植物細(xì)胞核是儲(chǔ)藏遺傳信息的主要場(chǎng)所，其蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化直接影響基因的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育與環(huán)境應(yīng)答過程[4-5]。因此，建立和健全細(xì)胞核蛋白質(zhì)組學(xué)研究的方法和體系將為解析植物發(fā)育與逆境應(yīng)答的分子機(jī)制提供重要信息。而為了獲得更多的蛋白質(zhì)信息，要求在進(jìn)行植物蛋白質(zhì)樣品制備時(shí)，盡量提高樣品蛋白質(zhì)的溶解性并減少蛋白質(zhì)的損失和降解，盡可能保留較多的蛋白質(zhì)種類。樣品質(zhì)量的好壞直接決定雙向電泳的分辨率、重復(fù)性和蛋白質(zhì)質(zhì)譜的結(jié)果[9]。在前期的研究過程中，已經(jīng)采用TCA-丙酮法對(duì)小麥小花葉綠體、線粒體以及葉片質(zhì)膜的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，構(gòu)建并優(yōu)化了相應(yīng)的蛋白質(zhì)雙向電泳體系。本研究在這些研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，繼續(xù)采用成熟的TCA-丙酮法來制備細(xì)胞核蛋白質(zhì)，同時(shí)結(jié)合細(xì)胞核中核酸含量高、疏水性核膜蛋白質(zhì)難以溶解等特點(diǎn)，對(duì)該制備方法進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化。利用超聲波對(duì)細(xì)胞核裂解液進(jìn)行間隔冰浴破碎，使大量核酸分子形成小片段，降低蛋白質(zhì)樣品的粘度，有助于細(xì)胞核蛋白質(zhì)的溶解。離心時(shí)加大轉(zhuǎn)速，有效去除蛋白樣品中的鹽分，減少2-DE圖譜中橫豎條紋干擾的現(xiàn)象。此外，聚焦過程中，通過在聚焦槽陽(yáng)極端架設(shè)鹽橋，不僅可以避免因鹽離子過高造成的燒膠條現(xiàn)象，同時(shí)還可以減少2-DE圖譜上的橫條紋。

凝膠濃度和上樣量直接影響雙向電泳的分辨率和重復(fù)性[9,11]。因此，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的不同，應(yīng)對(duì)分離膠的濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。本研究中11% SDS-PAGE的凝膠孔隙較大，凝膠阻力小，蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)速度較快，2-DE圖譜上部產(chǎn)生空白；13% SDS-PAGE的凝膠孔隙相對(duì)較小，凝膠阻力變大，高分子量的蛋白質(zhì)在中上部凝聚，不利于蛋白質(zhì)有效的分離；12% SDS-PAGE凝膠濃度對(duì)小麥細(xì)胞核蛋白質(zhì)的分離效果最佳，條帶清晰，無拖尾、條紋等現(xiàn)象發(fā)生。上樣量的大小是直接影響2-DE圖譜質(zhì)量和可靠性的重要因素之一，過低的上樣量不利于低豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)，過高時(shí)則高豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)易于掩蓋其他蛋白質(zhì)點(diǎn)，且橫條紋和拖尾較嚴(yán)重。本研究通過對(duì)不同上樣量的比較分析，確定在230 μg時(shí)，能獲得很好的2-DE圖譜效果，2-DE膠背景干凈，大大地提高了細(xì)胞核蛋白質(zhì)的分離效率和分辨率。

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