羅漢果苷ⅢE的酶法合成

陳 玲，陳依軍，王淑珍，吳旭日

(中國藥科大學生命科學與技術學院化學生物學研究室，南京 210009)

羅漢果(Siraitiagrosvenorii)是一種葫蘆科多年生草本植物，其成熟果實是治療咽炎、咽痛和咳嗽等的傳統(tǒng)中藥，也是開發(fā)天然低熱量甜味劑的重要來源之一[1-2]。自1983年Takemoto等[3]從S.grosvenorii果實中分離出甜味化合物羅漢果苷(mogroside,MG)Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ后，已有超過30種同系列化合物被陸續(xù)分離鑒定，它們均為羅漢果苷元[10α-cucurbit-5-ene-3β,11α,24(R),25-tetraol]連接2～6個葡萄糖單元形成的四環(huán)三萜皂苷。通過對羅漢果苷結(jié)構(gòu)及其甜味的構(gòu)效關系研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)中含3個葡萄糖單元的羅漢果苷均具有較好的甜味，但口味存在一定差別[1]。例如，羅漢果苷Ⅳ、Ⅴ和賽門苷Ⅰ的甜度分別是5%蔗糖的350倍、425倍和500倍以上，且口感相對純正[4]。在全球倡導低熱量健康飲食的大背景下，羅漢果苷無疑成為各大食品和飲料生產(chǎn)企業(yè)開發(fā)低(無)熱量非糖類甜味劑的熱點。

羅漢果苷作為羅漢果生長成熟過程中合成的次級代謝產(chǎn)物，獲得性受到季節(jié)的限制，且絕大多數(shù)羅漢果苷的天然含量較低，難以通過提取分離實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，嚴重阻礙了其被開發(fā)為優(yōu)質(zhì)天然甜味劑的可能性[5]。據(jù)報道，羅漢果苷Ⅴ(MG V)是羅漢果苷元3位和24位羥基分別β-連接2個和3個葡萄糖單元的皂苷，在羅漢果成熟果實中含量最高，也是目前唯一可產(chǎn)業(yè)化提取制備的羅漢果苷類化合物[6]。研究人員利用比較轉(zhuǎn)錄組學和體外活性驗證手段初步闡釋了羅漢果苷Ⅴ的完整生物合成途徑[7-8]。從該途徑中可以看出，羅漢果苷ⅢE(MG IIIE)是羅漢果苷Ⅴ生物合成的關鍵中間體，同樣也是多種高甜度羅漢果苷Ⅳ、異羅漢果苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ的生物合成前體，但其在羅漢果中的含量甚微，無法提取制備。如圖1所示，選擇性水解羅漢果苷Ⅴ結(jié)構(gòu)中3位和24位以β-1,6-糖苷鍵連接的葡萄糖單元即可獲得羅漢果苷ⅢE。但是，目前化學方法基本無法實現(xiàn)鍵專一性地水解羅漢果苷Ⅴ的2個β-1,6-糖苷鍵，因此，采用專一性強的糖苷水解酶建立綠色化酶法合成工藝成為最佳選擇[9-11]。本研究以價低易得的羅漢果苷Ⅴ作為底物，篩選酶庫獲得了特異性合成羅漢果苷ⅢE的糖苷水解酶CPU-GH117，通過誘導表達條件和催化反應條件的系統(tǒng)優(yōu)化，建立了羅漢果苷Ⅴ選擇性水解制備羅漢果苷ⅢE的酶法合成新工藝，為其他高甜度羅漢果苷的制備和甜味劑開發(fā)提供了物質(zhì)基礎。

Figure1 Enzymatic synthesis of mogroside IIIE (MG IIIE) from mogroside V (MG V)

1 材 料

1.1 藥品與試劑

羅漢果苷Ⅴ和ⅢE(成都德思特生物技術有限公司)；卡那霉素、異丙基硫肽半乳糖苷(IPTG)(上海生工生物工程有限公司)；三羥甲基胺基甲烷、丙烯酰胺、N′,N′-甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、四甲基乙二胺(南京生興生物技術有限公司)；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準(美國Fermentas公司)；乙腈和甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(江蘇凱基生物技術有限公司)；蛋白胨和酵母粉(英國Oxoid公司)；其余試劑均為市售分析純。糖苷水解酶庫(共有57種酶)由中國藥科大學化學生物學研究室前期創(chuàng)建。

1.2 儀 器

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6224液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(美國Agilent科技有限公司)；YMC-Pack ODS-A C18色譜柱和C18硅膠填料(日本YMC股份有限公司)；pH計(瑞士梅特勒公司)；高壓細胞破碎儀(英國Constant Systems公司)；蛋白質(zhì)電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凍干機(上海Christ儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 羅漢果苷Ⅴ和ⅢE的HPLC分析

色譜條件：色譜柱為Agilent C18反相柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相A為超純水(含0.1%甲酸)，流動相B為乙腈(含0.1% 甲酸)，洗脫梯度為10%～90% B，梯度洗脫時間為25 min，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為210 nm；流速為1 mL/min。在該色譜條件下，羅漢果Ⅴ和ⅢE的保留時間分別為10.0 min和11.3 min。

2.2 糖苷水解酶庫的誘導表達和篩選

糖苷水解酶庫中所有酶采用相同條件在24孔板中進行誘導表達：0.2 mmol/L IPTG、誘導溫度15 ℃和誘導時間12 h。誘導表達完成后向菌液中加入羅漢果苷Ⅴ至0.5 mg/mL，于室溫反應12 h，然后用等體積的甲醇停止反應，12 000 r/min離心10 min，上清液過濾后進行HPLC分析，以羅漢果苷ⅢE的生成情況篩選鍵專一性水解羅漢果苷Ⅴ的糖苷水解酶。

2.3 糖苷水解酶活性測定

以羅漢果苷Ⅴ的峰面積(A)對其質(zhì)量濃度 (c,mg/mL) 線性回歸制作標準曲線：A=1 212c+44.977,r2=0.999 2，線性范圍為0.1～5 mg/mL。本研究以測定反應體系中羅漢果苷Ⅴ的減少量計算糖苷水解酶的活力。含糖苷水解酶的粗酶液為重組表達菌體經(jīng)高壓破碎和冷凍離心所得。酶活力測定體系為1 mL，含羅漢果苷Ⅴ 1 mg和0.1 mol/L NaOAc-HAc緩沖液(pH 7.0)。1個酶活單位(U)指在35 ℃條件下每分鐘消耗1 μmol/L羅漢果苷Ⅴ所需的酶量。比活力為每毫克總蛋白所含有的活力單位數(shù)(U/mg)。

2.4 糖苷水解酶誘導表達條件考察

在0.2 mmol/L IPTG和誘導12 h條件下，分別考察誘導溫度為15、20、25、30、35 ℃時糖苷水解酶的可溶性表達量。在15 ℃和誘導12 h條件下，分別考察IPTG用量為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L時糖苷水解酶的可溶性表達量。利用最優(yōu)誘導溫度和IPTG用量考察4～24 h誘導時間條件下的糖苷水解酶可溶性表達量。

2.5 羅漢果苷ⅢE的生物合成反應條件考察

利用單因素分析方法考察了糖苷水解酶選擇性水解羅漢果苷Ⅴ制備ⅢE的pH、溫度、酶用量和底物濃度。pH考察范圍為3.0～8.0，緩沖液種類為0.1 mol/L Tris-HCl(7.5～8.0)、0.05 mol/L NaOAc-HAc(4.5～6.0)以及0.05 mol/L Na2HPO4-檸檬酸(3.0～4.0,6.5～7.0)；反應溫度考察范圍為25～65 ℃；酶量考察范圍為0.5～5 U/mL；底物濃度范圍為1～10 mg/mL。上述所有反應的體積均為1 mL，pH和溫度考察的反應時間為8 h，酶用量和底物濃度考察的反應時間為24 h。

2.6 反應體系的放大驗證

利用最優(yōu)反應條件將水解羅漢果苷Ⅴ制備ⅢE的反應體系擴大至500 mL，并于不同反應時間點取樣監(jiān)測反應進程。反應結(jié)束后，反應液煮沸5～10 min，離心去除變性蛋白質(zhì)，上清液冷凍干燥制備羅漢果苷ⅢE粗品。利用C18反相柱(內(nèi)徑2 cm，長度50 cm)分離純化羅漢果苷ⅢE，洗脫液為含45%乙腈的水溶液。HPLC監(jiān)測純化過程，收集含羅漢果苷ⅢE的洗脫液，干燥后獲得羅漢果苷ⅢE，最后利用HPLC檢測樣品純度。

3 結(jié) 果

3.1 糖苷水解酶的篩選

本課題組前期建立了由57種糖苷水解酶組成的酶庫，酶的來源涉及植物、真菌和細菌。本研究采用統(tǒng)一的誘導表達條件對所有酶進行了大腸埃希菌的異源表達，然后構(gòu)建全細胞生物催化體系用于篩選鍵專一性水解羅漢果苷Ⅴ合成羅漢果苷ⅢE的糖苷水解酶。結(jié)果顯示，表達Saccharomycescerevisiae糖苷水解酶CPU-GH17的大腸埃希菌細胞在實驗條件下能夠催化羅漢果苷Ⅴ水解生成單一產(chǎn)物MG-X，而其他全細胞催化劑水解羅漢果苷Ⅴ所得產(chǎn)物多為混合物(圖2-A)。如圖2-B所示，MG-X與羅漢果苷ⅢE對照品的保留時間完全相同，且其實測相對分子質(zhì)量[M-H]-m/z=961.538 0與羅漢果苷ⅢE的相對分子質(zhì)量的計算值961.545 0一致。上述結(jié)果表明，MG-X即為羅漢果苷Ⅴ選擇性水解2個β-1,6糖苷鍵產(chǎn)生的ⅢE。因此，本研究選擇糖苷水解酶CPU-GH17作為生物催化劑，以建立綠色高效的羅漢果苷ⅢE酶法合成新工藝。

3.2 CPU-GH17的可溶性表達

為提高糖苷水解酶CPU-GH17的可溶性表達量，以便于后續(xù)的反應條件考察，本研究對影響大腸埃希菌中重組蛋白可溶性表達的主要因素如IPTG用量、誘導溫度和誘導時間進行了系統(tǒng)考察[12]。如圖3-A所示，CPU-GH17在SDS-PAGE中測定的相對分子質(zhì)量約為50 kD，與計算的相對分子質(zhì)量51.6 kD基本一致。IPTG作為一種高效的乳糖啟動子誘導劑，其濃度是影響重組蛋白表達的重要因素。如圖3-B所示，CPU-GH17的可溶性表達量在IPTG摩爾濃度為0.4 mmol/L時達到最高值，約占可溶性總蛋白的16.5%，并隨著IPTG用量增加逐漸降低。誘導溫度過高，重組蛋白容易錯誤折疊形成包涵體。溫度過低則會導致菌體生長緩慢，重組蛋白的總量減少[13]。從圖3-C中可以看出，低溫更利于CPU-GH17的可溶性表達，15 ℃的表達量可達到22.1%。在0.4 mmol/L IPTG和15℃條件下，CPU-GH17的表達量隨著誘導時間延長逐漸增加，并在12 h時達到最高值22.8%(圖3-D)。因此，CPU-GH17可溶性表達的最佳條件最終確定為：0.4 mmol/L IPTG、15℃和12 h。在該誘導條件下，CPU-GH27的比活力為0.049 U/mg。

Figure2 Selected CPU-GH17 for the biosynthesis of MG IIIE

A：HPLC analysis of (1) MG IIIE standard,(2) hydrolysis of MG V with CPU-GH17,(3) hydrolysis of MG V with CPU-GH24 and (4) MG V standard;B：LC/MS analysis of MG-X

Figure3 Optimization of expression conditions for CPU-GH17

3.3 CPU-GH17生物合成羅漢果苷ⅢE的最佳條件

3.3.1 最佳反應溫度 酶催化的反應速率與溫度密切有關，反應溫度越高越有利于反應的啟動和進行，但溫度過高會導致酶蛋白的變性失活[14]，因此溫度的選擇對CPU-GH17水解羅漢果苷Ⅴ合成羅漢果苷ⅢE至關重要。本研究考察了25～65 ℃條件下羅漢果苷ⅢE的生成效率，結(jié)果顯示，隨著反應溫度上升羅漢果苷ⅢE的生成率逐漸增加，并在45 ℃時達到最大值(圖4-A)。此外，在45 ℃條件下孵育12 h，CPU-GH17酶活力降低不超過20%。因此，最終選擇45 ℃作為最佳反應溫度進行后續(xù)反應條件的優(yōu)化。

3.3.2 最佳反應pH 反應pH的不匹配可能會導致酶變性失活以及延緩催化殘基的質(zhì)子化，從而降低反應效率[14]。如圖4-B所示，糖苷水解酶CPU-GH17對反應pH變化較為敏感，其水解羅漢果苷Ⅴ的最佳pH為6.0，過高或過低都會導致反應效率的明顯降低。

3.3.3 最佳酶用量和底物濃度 由于底物抑制和產(chǎn)物抑制的存在，生物催化反應中的酶的用量和底物濃度一般相互關聯(lián)，互相影響[15]。為獲得CPU-GH17催化合成羅漢果苷ⅢE的最佳底物濃度，本研究在反應溫度45 ℃和pH 6.0的條件下綜合考察了底物濃度和酶用量的相互關系。如圖4-C所示，隨著酶用量的增加，底物濃度可逐漸升高，且羅漢果苷Ⅴ可完全選擇性轉(zhuǎn)化為ⅢE。但是當質(zhì)量濃度超過7.5 mg/mL水平時，底物濃度的增加會造成羅漢果苷ⅢE的產(chǎn)率逐漸下降，這可能是由于酶失活、底物抑制以及產(chǎn)物抑制等影響因素中的一種或多種綜合作用所致。因此，最終確定制備羅漢果苷ⅢE的最佳條件確定為：45 ℃、pH 6.0、底物質(zhì)量濃度為5 mg/mL、酶濃度為3 U/mL。

Figure4 Optimization of reaction conditions for CPU-GH17

3.4 羅漢果苷ⅢE的制備

在確定最佳反應條件后，本研究在500 mL規(guī)模(2.5 g)對其穩(wěn)定性和放大可行性進行了考察，并用HPLC監(jiān)測反應過程以確定最佳反應時間。如圖5-A所示，反應進行20 h后羅漢果苷Ⅴ即可完全水解轉(zhuǎn)化為羅漢果苷ⅢE，且隨著反應時間的推移并未出現(xiàn)羅漢果苷ⅢE的降解。在反應完成后，反應液經(jīng)過加熱變性、離心去蛋白和凍干，獲得羅漢果苷ⅢE的粗品2.52 g。粗品經(jīng)過C18反向柱一步純化和洗脫液濃縮凍干，最終獲得了白色粉末狀羅漢果苷ⅢE純品1.96 g，計算回收率約為77.8%，HPLC檢測純度為97.8%(圖5-B)。由此可見，本研究利用糖苷水解酶CPU-GH17建立了一種有望規(guī)?；苽淞_漢果苷ⅢE的酶法合成新工藝，可為羅漢果苷甜味劑開發(fā)提供了重要合成前體。

Figure5 Bio-preparation of MG IIIE at 500 mL-scale

4 討 論

羅漢果苷ⅢE作為多種高甜度羅漢果苷化合物合成的關鍵前體，其規(guī)?；苽鋵α_漢果苷類甜味劑的開發(fā)產(chǎn)生重大影響[16]。在前期創(chuàng)建的糖苷水解酶酶庫基礎上，本研究利用可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的羅漢果苷Ⅴ作為底物，篩選得到能夠鍵專一性水解羅漢果苷Ⅴ制備ⅢE的糖苷水解酶CPU-GH17。以蛋白質(zhì)可溶性表達量為評價指標，確定了CPU-GH17在大腸埃希菌中的最佳誘導表達條件：0.4 mmol/L IPTG、15 ℃和誘導12 h。然后，在確定CPU-GH17催化合成羅漢果苷ⅢE的最佳反應條件(45 ℃、pH 6.0、5 mg/mL底物和3 U/mL CPU-GH17)后，反應體系被放大至500 mL，驗證了工藝的穩(wěn)定性和可行性。因此，羅漢果苷ⅢE的酶法合成新工藝已基本建立，為規(guī)?；苽淦渌咛鸲攘_漢果苷提供了可能。雖然目前該工藝的底物質(zhì)量濃度僅能達到5 mg/mL，但是本研究正在利用定向進化手段改造CPU-GH17，以期提高其底物和產(chǎn)物耐受性以及催化效率，從而大幅度提升生物合成羅漢果苷ⅢE的底物濃度并降低成本。

參 考 文 獻

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