人胎盤生長(zhǎng)因子2在畢赤酵母中的表達(dá)和純化

梁小慶，閆鵬飛，劉 煜*

(1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，南京 210009；2中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009)

胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PIGF)屬于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族，是一種有效的促進(jìn)血管形成和增加血管通透性的誘導(dǎo)因子。PIGF最早從胎盤cDNA文庫(kù)中分離得到，通常在滋養(yǎng)層、正常甲狀腺以及在傷口愈合期間進(jìn)行表達(dá)。它能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化及存活，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的老化和凋亡。PIGF在胃癌、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和中耳膽脂瘤中明顯上升，可以作為這幾種腫瘤的指標(biāo)性物質(zhì)，說(shuō)明PIGF和部分腫瘤血管生成有著密切的關(guān)系。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于PIGF在促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞功能、加快缺血性疾病進(jìn)程及促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)等方面進(jìn)行了大量研究。PIGF是一種分泌性同二聚體糖蛋白，其基因定位于14q24-q31。根據(jù)編碼基因RNA不同的剪接方式，目前有4種異構(gòu)體：PIGF-1、PIGF-2、PIGF-3、PIGF-4，其中以PIGF-2在人體中表達(dá)最為豐富，活性最強(qiáng)，因此本研究采用畢赤酵母表達(dá)重組人PIGF-2蛋白，用于后續(xù)的抗體制備及活性研究。在制備中，由于PIGF蛋白具有肝素親和活性，因此采用Heparin-Sepharose CL6B肝素親和色譜進(jìn)行高效的分離純化。

1 材 料

1.1 質(zhì)粒、菌株和試劑

Taq酶、dNTP(中國(guó)上海翊圣生物科技有限公司)；T4 DNA連接酶、EcoR I、NotI、PMD-19T、SalI(日本Takara公司)；小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Lyticase(中國(guó)天根生化科技有限公司)；heparin-Sepharose CL4B(美國(guó)GE公司)；G418[生工生物工程上海(股份)有限公司]；無(wú)氨基酵母氮源(YNB，美國(guó)Difico公司)；生物素(美國(guó)Amresco公司)；PIGF抗體(美國(guó)Santa Cruzs公司)；胰蛋白胨、酵母粉(英國(guó)Oxoid公司)；人PIGF-2 cDNA (中國(guó)北京義翹神州生物技術(shù)公司)；pPIC9K、GS115、E.coliDH5α(本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.2 儀 器

電轉(zhuǎn)儀、PCR儀、酶聯(lián)免疫分析儀、蛋白電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(上海天能公司)；瓊脂糖水平電泳儀(北京六一儀器廠)；蛋白核酸檢測(cè)儀(南京大學(xué)儀器廠)；數(shù)顯橫流泵(上海滬西儀器公司)。

2 方 法

2.1 PIGF-2基因的TA克隆

采用Primer 5設(shè)計(jì)一對(duì)PIGF-2基因的特異性引物:PI5：5′-CGGAATTCATGCCGGTCATGAGGCTGTTC-3′和PI3：5′-AAATATGCGGCCGCTTACCTCCGGGGAACAG-3′,以購(gòu)得的人PIGF-2 cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR程序?yàn)?95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,切膠回收與預(yù)期大小一致的條帶,通過(guò)T-A克隆將其連接到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,均勻涂布在LB平板(含氨芐青霉素)上,37 ℃倒置培養(yǎng)12 h,經(jīng)菌落PCR檢測(cè)后挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

2.2 構(gòu)建pPIC9K-PIGF-2質(zhì)粒

將目的片段和pPIC9K質(zhì)粒分別用EcoR I和NotI酶切，37 ℃過(guò)夜酶切，經(jīng)割膠回收，T4 DNA 連接酶連接8 h，轉(zhuǎn)入DH5a中，挑取陽(yáng)性克隆酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證結(jié)果正確的菌株送去測(cè)序。

2.3 電轉(zhuǎn)化pPIC9K-PIGF-2

將測(cè)序正確的菌株接種培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以SalI酶切線性化，1.2%瓊脂糖電泳割膠回收，-20 ℃保存。設(shè)定電轉(zhuǎn)儀參數(shù)(電壓1 500 V，時(shí)間4 ms)，將SalI線性化的重組質(zhì)粒10 μL加入制備好的酵母細(xì)胞GS115 100 μL中，混勻，轉(zhuǎn)入0.2 cm電轉(zhuǎn)杯內(nèi)，置電轉(zhuǎn)儀，電擊后取出，迅速放回冰上加入預(yù)冷山梨醇1 mL，混勻，吸取200 μL涂布于MD平板上。30 ℃培養(yǎng)2 d，挑取陽(yáng)性克隆。

2.4 陽(yáng)性克隆的篩選

將MD平板上長(zhǎng)出的單菌落依次接種于濃度遞增的G418-YPD平板上(G418質(zhì)量濃度為0.25，0.5，2.0，4.0 mg/mL)，30 ℃培養(yǎng)2 d，挑取多拷貝陽(yáng)性克隆，采用Lyticase酶解及PCR法鑒定陽(yáng)性克隆。

2.5 陽(yáng)性克隆的誘導(dǎo)表達(dá)

隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆，依次接種于YPD培養(yǎng)液5 mL和BMGY培養(yǎng)基10 mL中，30 ℃分別培養(yǎng)過(guò)夜。第3天室溫下4 000 r/min離心10 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀重懸于BMMY培養(yǎng)液25 mL中，加入甲醇濃度為0.5%，30 ℃振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，連續(xù)7 d固定時(shí)間補(bǔ)加甲醇，第7天，8 000 r/min離心10 min，收獲上清液。取上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳和ELISA鑒定。

2.6 表達(dá)條件的優(yōu)化

2.6.1 甲醇誘導(dǎo)濃度的選擇 取50 mL滅菌錐形瓶6只，按上述方法接種等量的菌液，每天按以下濃度補(bǔ)加甲醇：0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%，2.0%，培養(yǎng)7 d收集培養(yǎng)基，采用ELISA法測(cè)定不同誘導(dǎo)濃度下目的蛋白的表達(dá)量。

2.6.2 誘導(dǎo)時(shí)間的選擇 取500 mL錐形瓶1只，接種菌液，每日按1%補(bǔ)加甲醇溶液，分別于誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后1，2，3，4，5，6，7 d取培養(yǎng)液1 mL留樣，采用ELISA法分別測(cè)定不同時(shí)間目的蛋白的表達(dá)量。

2.7 重組蛋白的分離純化及鑒定

酵母培養(yǎng)液8 000 r/min離心15 min，分離菌體，培養(yǎng)上清液在平衡液20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中透析平衡過(guò)夜后，過(guò)0.45 μm濾膜后上樣于Heparin-Sepharose CL6B親和柱，用平衡液和含1 mol/L NaCl的平衡液進(jìn)行0～1 mol/L線性梯度洗脫，收集洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE和ELISA檢測(cè)。

2.8 ELISA檢測(cè)

包被酶標(biāo)板，其中加入100 μL rhPIGF-2酵母發(fā)酵液或者純化后重組人PIGF-2樣品(1 μg/mL)和100 μL包被緩沖液，4 ℃過(guò)夜。PBST洗滌后，加入封閉液(3%BSA-PBST),37 ℃ 2 h。加入一抗(將抗體以1%BSA溶液稀釋)，37 ℃反應(yīng)1 h后，加入HRP標(biāo)記的抗鼠IgG，37 ℃反應(yīng)1 h后顯色。采用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定樣品吸收度。

3 結(jié) 果

3.1 PIGF-2基因的PCR結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到PIGF-2基因，經(jīng)瓊脂糖電泳顯示，條帶位置在500 bp左右，與理論預(yù)期大小相符(圖1)。

Figure1 Detection of the amplification product of human placental growth factor 2 (PIGF-2) gene by PCR

3.2 載體構(gòu)建圖

PIGF基因經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切后條帶位置正確，測(cè)序檢查證明PIGF基因已成功重組于載體的多克隆位點(diǎn)，載體構(gòu)建成功(圖2)。

3.3 轉(zhuǎn)化克隆的PCR檢測(cè)

經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化克隆均有500 bp的陽(yáng)性條帶。PCR方法檢測(cè)Mut+/Muts結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，用AOX1引物(5AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′3AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)進(jìn)行PCR，1、2、3、5、6、7、8號(hào)菌株均產(chǎn)生了1 000 bp左右和2 000 bp左右兩條帶，此為Mut+型菌株，而4號(hào)菌株在2 000 bp沒(méi)有條帶，即為Muts型菌株。

由于Mut+基因型菌株中含有AOX1基因，因此可以以甲醇為碳源，在MM平板上正常生長(zhǎng)，而因外源基因的插入發(fā)生交換導(dǎo)致AOX1基因缺失的Muts卻不能在MM平板上正常生長(zhǎng)，雖然存在與AOX1具有97%同源性的AOX2基因，但其利用甲醇作為碳源的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AOX1。

Figure2 Map of recombinant pPIC9K-PIGF-2

Figure3 Detection of recombinant plasmid pPIC9K-PIGF-2 Line 1- 8：Sample 1- 8；Line 9：Marker

3.4 表達(dá)條件的優(yōu)化

3.4.1 甲醇濃度的影響 由圖4可見(jiàn)，甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最高。

Figure4 Influence of concentration of methanol on the expression of PIGF-2 inPichiapastoris

3.4.2 誘導(dǎo)時(shí)間的影響 由圖5可見(jiàn)，誘導(dǎo)后7 d內(nèi)表達(dá)量不斷增加，所以將誘導(dǎo)時(shí)間定為7 d。

Figure5Influence of the induction period on the expression of human PIGF-2 inPichiapastoris

3.5 重組蛋白的純化鑒定結(jié)果

由圖6和圖7可見(jiàn)，親和色譜只有一個(gè)洗脫峰，由相對(duì)分子質(zhì)量大小及Western blot結(jié)果可知，該洗脫峰為目的蛋白峰，其穩(wěn)定態(tài)為二聚體，并且有少量單體存在。

Figure6 Elution curve of recombinant human PIGF-2

Figure7 SDS-PAGE and Western blot of recombinant human PIGF-2 expressed inPichiapastoris

A:Reduced;B:Non-reduced

4 討 論

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)既具有原核細(xì)胞的易操作性，也有真核細(xì)胞翻譯后的加工能力，是重組糖蛋白比較理想的表達(dá)體系。pPIC9K載體全長(zhǎng)9 276 bp，含有一個(gè)ColE1復(fù)制起點(diǎn)和兩個(gè)抗性基因(Amp、Kan)，它是一個(gè)穿梭載體，既可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，又能在真核細(xì)胞中表達(dá)，且有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子AOX1，能在甲醇的誘導(dǎo)下高效表達(dá)外源蛋白。所用表達(dá)菌株為GS115畢赤酵母，具有組氨酸脫氫酶缺陷型基因His4，可接受含His4的載體pPIC9K而使其具有His+表型以篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，因此可在組氨酸缺陷的MD平板上篩選。

由于Mut+基因型菌株中含有AOX1基因，因此可以以甲醇為碳源，在MM平板上正常生長(zhǎng)，而因外源基因的插入發(fā)生交換導(dǎo)致AOX1基因缺失的Muts卻不能在MM平板上正常生長(zhǎng)，雖然存在與AOX1具有97%同源性的AOX2基因，但其利用甲醇作為碳源的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AOX1。在篩選Mut+基因型菌株時(shí)，曾按照文獻(xiàn)方法，從高濃度G418平板上挑取高拷貝菌株于MM和MD平板上，再觀測(cè)其在平板上的生長(zhǎng)情況，挑選在兩種板子上生長(zhǎng)一樣快的為Mut+基因型。但實(shí)際情況是在挑取菌落過(guò)程中，用牙簽很難把握挑取的菌量，這就很難判斷菌在MM和MD平板上生長(zhǎng)情況。因此本研究通過(guò)AOX1引物鑒定酵母染色體的基因組，由于Mut+基因型中外源重組子是通過(guò)單交換以插入的方式整合到酵母染色體中的，PCR結(jié)果應(yīng)該出現(xiàn)酵母自身的AOX1基因條帶，以及插入片段中AOX1一部分序列所產(chǎn)生的條帶。而Muts型基因型外源基因是通過(guò)雙交換的方式替換掉酵母基因組自身的AOX1基因，結(jié)果應(yīng)該只出現(xiàn)插入片段PCR所產(chǎn)生的一條條帶，鑒于此特征可以篩選Mut+基因型菌株。

SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示，表達(dá)的PIGF蛋白大部分以二聚體形式存在，少量以單體形式存在。所有陽(yáng)性酵母菌株的蛋白產(chǎn)量都很低，探究其原因，可能是由于稀有密碼子過(guò)多。如果要大量表達(dá)蛋白則需要改造基因，使其更適合酵母體系表達(dá)。

參 考 文 獻(xiàn)

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