紫花地丁與長萼堇菜的傅里葉變換紅外光譜鑒別

賀雨馨，孫志蓉，曲繼旭，程麗麗，朱南南

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102)

紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁(ViolayedoensisMakino)的干燥全草，其功效為清熱解毒、涼血消腫，用于疔瘡腫毒、癰疽發(fā)背、丹毒及毒蛇咬傷[1]。紫花地丁不僅是我國傳統(tǒng)中藥之一，其在四川白馬藏區(qū)和貴州侗族等少數(shù)民族區(qū)域常作為治療皮癬、腳氣等真菌性皮膚病的藥物?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)紫花地丁具有良好的抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等功效[2]。由于堇菜屬的一些植物從外觀形態(tài)上不好區(qū)分，所以藥材市場中的紫花地丁也存在來源混雜的問題。本課題組在貴州黔東南侗族聚居地采集的紫花地丁中?；煊虚L萼堇菜(Violainconspicua)，二者不僅外觀形態(tài)相似，且種內(nèi)變異現(xiàn)象普遍，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確區(qū)分。目前紫花地丁及其混淆品的鑒別方法研究主要集中在形態(tài)、顯微及色譜鑒別方面[3]。本課題組在顯微鑒別研究中發(fā)現(xiàn)，紫花地丁與長萼堇菜因親緣關(guān)系近，因而差別較小，而色譜分析鑒別方法要求精度高、操作復(fù)雜、分析所需時(shí)間長。有研究從分子水平對(duì)紫花地丁及其混淆品進(jìn)行了研究，確定了正品紫花地丁中8個(gè)特異性鑒別位點(diǎn)[4]，為紫花地丁的準(zhǔn)確鑒別提供了依據(jù)，但是分子鑒別在實(shí)際應(yīng)用中因成本高，不便于推廣，因此急需建立簡便的、準(zhǔn)確的鑒別方法，以保證紫花地丁用藥準(zhǔn)確。傅里葉變換紅外光譜法(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)是用于鑒別化合物和確定分子結(jié)構(gòu)的常用手段之一，其在中藥材鑒別中的應(yīng)用也在不斷深入[5-9]。本文采用一維紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)譜分析技術(shù)對(duì)紫花地丁和長萼堇菜的不同提取物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析及鑒定，建立鑒別紫花地丁與長萼堇菜的分析方法。

1 材 料

1.1 樣品來源

在貴州黔東南地區(qū)黎平縣海拔600m以上山區(qū)，采集生長良好的樣品植株全草，經(jīng)DNA條形碼技術(shù)鑒定為紫花地丁(Violayedoensis)和長萼堇菜(Violainconspicua)。

1.2 試 劑

溴化鉀(KBr，純度為99.9%)、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇均為分析純(北京化工廠)；水為二次蒸餾水。

1.3 儀 器

Spectrum GX FT-IR紅外光譜儀(美國Perkin Elmer公司)，測定范圍4 000～400 cm-1，含DTGS檢測器，光譜分辨率4 cm-1，掃描信號(hào)累加次數(shù)32次，掃描時(shí)實(shí)時(shí)扣除水和CO2的干擾。BS110S電子分析天平，BP211D電子分析天平(德國Sartorius公司)；G-20離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)。

2 方 法

2.1 樣品制備

2.1.1 50%乙醇提取物的制備 準(zhǔn)確稱取紫花地丁與長萼堇菜的細(xì)粉各2 g，加10倍量50%乙醇，加熱回流提取2 h，離心，回收上清液。藥渣以5倍量提取溶劑再次提取。合并上清液，減壓濃縮至浸膏狀，烘干即得提取物。

2.1.2 不同萃取部位的制備 稱取紫花地丁與長萼堇菜的細(xì)粉200 g，加10倍量50%乙醇，加熱回流提取2 h，離心，回收上清液。藥渣以5倍量提取溶劑再次提取。合并兩次上清液，減壓濃縮至溶液無醇味。分別用石油醚萃取，將溶液中色素盡數(shù)除去，再分別依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。得相應(yīng)的萃取部位，濃縮后即得不同萃取部位樣品。

2.1.3 圖譜掃描 將紫花地丁和長萼堇菜的提取物粉末和不同萃取部位粉末粉碎研磨過200目篩與KBr粉末混合研磨(藥材與KBr用量之比約為2∶100)壓片，紅外光譜測定，獲得樣品的紅外譜圖。

2.2 數(shù)據(jù)處理

紅外圖譜采用Spectrum V6.3.5操作軟件，對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和圖譜預(yù)處理，預(yù)處理過程包括基線校正(baseline automatic correction)和比對(duì)(compare)；二階導(dǎo)數(shù)譜采用Spectrum v6.3操作軟件，13點(diǎn)平滑。

3 結(jié) 果

3.1 紫花地丁與長萼堇菜乙醇提取物紅外光譜主體成分解析

將紫花地丁與長萼堇菜50%乙醇提取物一維紅外光譜進(jìn)行比對(duì)，兩者在3 382 cm-1附近出現(xiàn)O-H伸縮振動(dòng)峰，在2 928、2 856 cm-1處出現(xiàn)C-H鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，在該波數(shù)范圍內(nèi)兩者吸收峰形相似，無明顯差別。兩樣品均具有1 605、1 512 cm-1兩個(gè)吸收峰，為苯環(huán)的C=C吸收峰，說明紫花地丁與長萼堇菜均含有芳香類物質(zhì)。而兩者在一維紅外譜圖上的區(qū)別集中在1 384～1 605 cm-1范圍內(nèi)，在1 384 cm-1處吸收峰為C-H彎曲振動(dòng)或-OH彎曲振動(dòng)，紫花地丁在此為一個(gè)尖峰，而長萼堇菜的峰形較鈍，且在臨近1 384 cm-1處的1 400 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)小峰。1 384 cm-1附近的峰與1 605 cm-1附近的峰相對(duì)強(qiáng)度不同，紫花地丁在1 384 cm-1處的峰強(qiáng)度強(qiáng)于1 605 cm-1處，而長萼堇菜在1 384 cm-1處的峰強(qiáng)弱于1 605 cm- 1處。由于一維譜圖中存在重疊峰，故兩個(gè)樣品的差別相對(duì)較小，進(jìn)一步區(qū)別需要由二階導(dǎo)數(shù)譜將一維譜圖中的重疊峰分開，以提高譜圖的分辨率，再進(jìn)行分析。

從紫花地丁與長萼堇菜50%乙醇提取物的二階導(dǎo)數(shù)譜(圖1)可以看出，長萼堇菜在1 679 cm-1處和在1 176 cm-1處的峰強(qiáng)度均強(qiáng)于紫花地??；紫花地丁在1 384 cm-1處的峰強(qiáng)度強(qiáng)于長萼堇菜；兩樣品在1 629 cm-1附近的峰與1 603 cm-1附近的峰相對(duì)強(qiáng)度不同，長萼堇菜樣品在1 629 cm-1附近的峰強(qiáng)度強(qiáng)于1 603 cm-1附近的峰，而紫花地丁樣品在1 629 cm-1附近與1 603 cm-1附近的峰強(qiáng)度相當(dāng)。紫花地丁50%醇提取物最強(qiáng)峰出峰位置在1 384 cm-1處，而長萼堇菜在1 384 cm-1處和1 679 cm-1處的峰強(qiáng)度相當(dāng)。二者出峰位置相差波數(shù)在1～5個(gè)波數(shù)之間。二者在二階導(dǎo)數(shù)譜中，尤其是1 700～1 300 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的差別更為明顯，這個(gè)范圍內(nèi)主要是酰胺類及芳香族物質(zhì)的特征吸收帶，說明二者此類物質(zhì)的差別較大。

Figure1 Second derivative spectrum of the alcohol extract ofViolayedoensisMakino(A) andViolainconspicua(B)

3.2 紫花地丁與長萼堇菜石油醚萃取部位紅外光譜主體成分解析

紫花地丁與長萼堇菜石油醚萃取部位一維紅外光譜圖，與50%乙醇提取物相比較，譜圖的特征峰更為明顯，長萼堇菜在937、913、905 cm-1處有尖峰，而紫花地丁在937、913、905 cm-1處沒有明顯尖峰，紫花地丁樣品在1 076 cm-1附近的峰相對(duì)峰強(qiáng)度強(qiáng)于1 036 cm-1附近的峰，長萼堇菜在1 076 cm-1附近的峰相對(duì)峰強(qiáng)度弱于1 036 cm-1附近的峰。該波數(shù)范圍內(nèi)主要為醇、酚、酯和芳香族的特征吸收峰。紫花地丁與長萼堇菜具有豐富的揮發(fā)性物質(zhì)，根據(jù)這個(gè)波段吸收峰峰形及峰強(qiáng)的區(qū)別，可以推測紫花地丁與長萼堇菜所含揮發(fā)性物質(zhì)之間存在差別。

在相應(yīng)的二階導(dǎo)數(shù)譜(圖2)中可以看出兩者之間的差別，長萼堇菜在1 179、936、918、904、869、849 cm-1處的峰強(qiáng)度明顯高于紫花地丁在該處的峰強(qiáng)度。兩種樣品在1 129 cm-1附近的峰與1 076 cm-1附近的峰相對(duì)強(qiáng)度不同，紫花地丁樣品在1 076 cm-1附近的峰強(qiáng)度強(qiáng)于1 128 cm-1附近的峰，長萼堇菜樣品兩峰的峰強(qiáng)度相當(dāng)。紫花地丁在826 cm-1處的峰強(qiáng)度強(qiáng)于長萼堇菜。紫花地丁樣品和長萼堇菜樣品的最強(qiáng)峰出峰位置均在1 467 cm-1處，紫花地丁中強(qiáng)峰出峰位置在1 382 cm-1處，長萼堇菜中強(qiáng)峰出峰位置在1 377 cm-1處。

Figure2 Second derivative spectrum of the petroleum ether extraction site ofViolayedoensisMakino(A) andViolainconspicua(B)

3.3 紫花地丁與長萼堇菜氯仿萃取部位紅外光譜主體成分解析

將紫花地丁與長萼堇菜氯仿萃取部位一維紅外光譜進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，兩者均具有1 715 cm-1附近的C=O伸縮振動(dòng)峰，且具有1 602、1 514、1 463 cm-1的苯環(huán)振動(dòng)峰，猜測兩者均具有香豆素類或黃酮類物質(zhì)。長萼堇菜1 232、1 715 cm-1附近的峰峰強(qiáng)度強(qiáng)于紫花地丁在1 232、1 714 cm-1附近的峰峰強(qiáng)度，而紫花地丁在1 665 cm-1處峰強(qiáng)度強(qiáng)于長萼堇菜，紫花地丁在3 413、1 383、1 165、1 124、1 070、1 035 cm-1處出峰，長萼堇菜在 3 416、1 378、1 179、1 127、1 074處、1 033 cm-1處出峰，以上出峰位置紫花地丁與長萼堇菜存在不同，由于波數(shù)相差較大，說明該處各個(gè)峰中可能存在重疊峰的情況，故運(yùn)用二階導(dǎo)數(shù)譜圖進(jìn)行進(jìn)一步比較。

在二階導(dǎo)數(shù)圖譜(圖3)上對(duì)兩者的出峰位置及峰強(qiáng)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，紫花地丁樣品在1 383 cm-1處出峰，長萼堇菜在1 378 cm-1處出峰，且紫花地丁該處的峰強(qiáng)度強(qiáng)于長萼堇菜該處峰強(qiáng)度；紫花地丁樣品在1 739 cm-1處峰形較尖，長萼堇菜在1 740 cm-1處出峰，峰形較鈍；長萼堇菜在1 179、1 143 cm-1處的峰強(qiáng)度強(qiáng)于紫花地丁在此波數(shù)的峰強(qiáng)度。紫花地丁樣品和長萼堇菜樣品在1 712～1 600 cm-1波段內(nèi)及在970～800 cm-1波段內(nèi)的峰形明顯不同。紫花地丁樣品和長萼堇菜樣品的最強(qiáng)峰出峰位置均在1 466 cm-1處，紫花地丁樣品中強(qiáng)峰出峰位置在1 601、1 516、1 383 cm-1處，長萼堇菜樣品中強(qiáng)峰出峰位置在1 516 cm-1處。在970～800 cm-1波段內(nèi)，長萼堇菜出現(xiàn)了6個(gè)自動(dòng)峰，而紫花地丁則出現(xiàn)4個(gè)自動(dòng)峰，且在峰強(qiáng)，峰位以及峰形上存在差別。

3.4 紫花地丁及長萼堇菜乙酸乙酯萃取部位紅外光譜主體成分解析

通過分析紫花地丁與長萼堇菜乙酸乙酯萃取部位一維紅外譜圖發(fā)現(xiàn)紫花地丁在3 347 cm-1處出峰，峰形較鈍，長萼堇菜在3 418 cm-1處出峰，峰形較尖；長萼堇菜在1 652 cm-1和1 606 cm-1處峰強(qiáng)度明顯高于紫花地丁在1 655和1 604 cm-1處的峰強(qiáng)度。紫花地丁在1 074、974、913、840 cm-1處出現(xiàn)糖環(huán)振動(dòng)峰，而長萼堇菜只在1 074與840 cm-1處出峰，初步說明紫花地丁與長萼堇菜乙酸乙酯萃取部位所含的糖苷有所不同。

精密度更高的二階導(dǎo)數(shù)譜圖(圖4)顯示，1 739 cm-1附近的峰與1 710 cm-1附近的峰相對(duì)強(qiáng)度不同，紫花地丁1 739 cm-1相對(duì)峰強(qiáng)度強(qiáng)于1 710 cm-1，而長萼堇菜在兩處的峰相對(duì)峰強(qiáng)度相當(dāng)；長萼堇菜在1 384 cm-1處出峰，紫花地丁在1 381 cm-1處出峰，二者相差3個(gè)波數(shù)，且長萼堇菜在1 384 cm-1處出峰的峰強(qiáng)度強(qiáng)于紫花地丁在1 381 cm-1處出峰的峰強(qiáng)度；1 467 cm-1附近的峰與1 384 cm-1附近的峰相對(duì)強(qiáng)度不同，紫花地丁1 467 cm-1相對(duì)峰強(qiáng)度強(qiáng)于1 381 cm-1，長萼堇菜在該兩處的峰的峰強(qiáng)與紫花地丁相反。長萼堇菜在1 453 cm-1處出峰，紫花地丁在1 453 cm-1處未出峰。紫花地丁樣品和長萼堇菜樣品在950～800 cm-1波段內(nèi)有明顯的區(qū)別，紫花地丁出現(xiàn)6個(gè)自動(dòng)峰，而長萼堇菜出現(xiàn)4個(gè)自動(dòng)峰。紫花地丁樣品最強(qiáng)峰出峰位置在1 467 cm-1處，長萼堇菜樣品的最強(qiáng)峰出峰位置在1 384 cm-1處，紫花地丁樣品中強(qiáng)峰出峰位置在1 739、1 514 cm-1處，長萼堇菜樣品中強(qiáng)峰出峰位置在1 514、1 467 cm-1處。

Figure3 Second derivative spectrum of the chloroform extraction site ofViolayedoensisMakino(A) andViolainconspicua(B)

Figure4 Second derivative spectrum of the ethyl acetate extraction site ofViolayedoensisMakino(A) andViolainconspicua(B)

4 討 論

從紫花地丁與長萼堇菜提取物與不同萃取部位的一維紅外圖譜中，可以推測出兩者均含有揮發(fā)性物質(zhì)、芳香類物質(zhì)及糖苷類物質(zhì)，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[10-14]。紅外光譜能夠通過出峰位置，峰強(qiáng)以及峰數(shù)來區(qū)別不同的物質(zhì)。通過對(duì)兩者的一維光譜圖比較發(fā)現(xiàn)，二者的光譜差別并不明顯，這是因?yàn)樽匣ǖ囟『烷L萼堇菜為同屬植物，在化學(xué)成分上存在相似性。一維譜圖中兩者的區(qū)別主要集中在波數(shù)小于1 800 cm-1的范圍內(nèi)，故在對(duì)其進(jìn)行二階求導(dǎo)時(shí)，主要針對(duì)該區(qū)段進(jìn)行求導(dǎo)分析。二階導(dǎo)數(shù)譜中二者的區(qū)別更為明顯，主要是峰強(qiáng)和峰數(shù)之間的差別。在50%乙醇提取物的二階導(dǎo)數(shù)譜中，紫花地丁1 384 cm-1處的峰明顯強(qiáng)于1 679 cm-1處，而長萼堇菜在兩處的吸收峰強(qiáng)度相當(dāng)。在石油醚萃取部位二階導(dǎo)數(shù)譜圖中，紫花地丁在950～900 cm-1波段內(nèi)的峰強(qiáng)與吸收峰數(shù)量均小于長萼堇菜。在氯仿萃取二階導(dǎo)數(shù)譜圖中，二者在1 628～1 670 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰和970～850 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰峰強(qiáng)存在差別，尤其是在970～850 cm-1范圍內(nèi)，自動(dòng)峰的數(shù)量、出峰位置以及峰強(qiáng)都存在區(qū)別。通過乙酸乙酯萃取部位二階導(dǎo)數(shù)譜可以發(fā)現(xiàn)，紫花地丁最強(qiáng)峰出現(xiàn)在1 467 cm-1，而長萼堇菜的最強(qiáng)峰出現(xiàn)在1 384 cm-1。根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)紫花地丁與長萼堇菜乙酸乙酯萃取部位二階導(dǎo)數(shù)譜中最強(qiáng)峰的出峰位置有明顯區(qū)別，可以通過該部位對(duì)紫花地丁與長萼堇菜進(jìn)行準(zhǔn)確品種鑒別。一維紅外光譜與二階導(dǎo)數(shù)分析方法相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)紫花地丁與長萼堇菜的區(qū)分鑒別。

堇菜屬植物分布廣，種類眾多，形態(tài)變異復(fù)雜且具有普遍雜交現(xiàn)象，并且堇菜屬植物在地方藥上多作為紫花地丁使用，因此市場中常出現(xiàn)一些難以從形態(tài)上進(jìn)行辨別的紫花地丁混淆品，如早開堇菜、東北堇菜、白花堇菜、長萼堇菜、犁頭草、新疆堇菜等[15-16]。這些混淆品在外觀形狀上難以與正品紫花地丁相區(qū)別。本試驗(yàn)采用紅外光譜法結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)分析技術(shù)獲得紫花地丁與常見混淆品長萼堇菜的主體化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息，證明該鑒定方法在紫花地丁與長萼堇菜鑒別上的可行性，不僅為紫花地丁與其混淆品的鑒別提供新思路，也為其他基原相近、易混淆的中藥品鑒別提供了一個(gè)可發(fā)展的方向。

研究表明,不同產(chǎn)地的紫花地丁在總黃酮和微量元素上存在明顯差別[17],同時(shí)紅外光譜也存在差別[18]。后期本課題組將針對(duì)不同產(chǎn)區(qū)的紫花地丁和長萼堇菜的紅外光譜進(jìn)行研究，探討不同產(chǎn)區(qū)兩者揮發(fā)性物質(zhì)、芳香類物質(zhì)及糖苷類物質(zhì)之間的差別，建立更全面的紅外光譜鑒別方法。

參 考 文 獻(xiàn)

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