四溴二苯醚與高氯酸鹽聯(lián)合暴露對成年斑馬魚肝臟抗氧化系統(tǒng)的影響

任 新，趙雪松，段小月，劉 萍，賈晨夢，龐蒙蒙

(吉林師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 四平 136000)

高氯酸鹽(Perchlorate，PER)是一種新型持久性無機(jī)污染物，常應(yīng)用于燃料氧化劑和易燃物，也應(yīng)用于化肥、皮革加工等生活領(lǐng)域[1]。PER極易溶于水，這一特性導(dǎo)致它在自然環(huán)境中具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，易遷移擴(kuò)散，同時它還具有顯著甲狀腺毒性、遺傳毒性、生殖毒性等，進(jìn)入生物體內(nèi)會影響生物體甲狀腺功能，對人體新陳代謝造成極大危害[2-5]。多溴聯(lián)苯醚(Poly brominated diphenyl ethers，PBDEs)是一組工業(yè)化學(xué)物，在人類活動中作為阻燃劑被廣泛使用[6]。PBDEs具有高度疏水親脂性、生物富集性和難降解性等特點，同時又具有典型的甲狀腺毒性、神經(jīng)毒性以及潛在的生殖毒性[7-9]，致使其成為了一種存在于各類環(huán)境介質(zhì)中甚至存在于人體組織中的環(huán)境污染物。PBDEs有209種同系物，其中目前在生物體包括人體組織中檢出率最高的是四溴二苯醚(BDE-47)[10]。

斑馬魚(Danio rerio)是一種熱帶淡水魚，身體細(xì)長，體型很小，長約4～6 cm，由于其本身個體小，少量花費(fèi)便足以支持對其的養(yǎng)殖，而且它繁殖能力強(qiáng)，適合大規(guī)模繁育。目前它作為脊椎動物的模型廣泛應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)育毒性的研究，同時也是研究胚胎發(fā)育分子機(jī)制的優(yōu)良資源。

多溴聯(lián)苯醚在自然環(huán)境中廣泛存在，無時無刻不在威脅著各類生物的生命和健康。現(xiàn)在對多溴聯(lián)苯醚的單一毒性研究較多，但在自然界中，污染物往往不是獨(dú)立存在的，而是多種污染物同時存在于一個環(huán)境體系內(nèi)影響著環(huán)境內(nèi)的各類生物，所以需要考察聯(lián)合污染物的復(fù)合毒性。本實驗選取BDE-47與PER為研究對象，以成年斑馬魚為受試生物，系統(tǒng)研究兩種物質(zhì)對斑馬魚的聯(lián)合毒性效應(yīng)，主要分析對斑馬魚肝臟抗氧化系統(tǒng)的影響，擬為完善復(fù)雜水環(huán)境的環(huán)境毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步進(jìn)行環(huán)境生態(tài)風(fēng)險評價奠定理論基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 斑馬魚的養(yǎng)殖

本實驗所用斑馬魚購自中國科學(xué)研究院武漢水生所，魚身長約3～4 cm。斑馬魚的養(yǎng)殖方法參照Yu等[8]介紹的養(yǎng)殖方法。將性成熟的斑馬魚養(yǎng)殖于自制的循環(huán)消毒系統(tǒng)中，如圖1所示，循環(huán)水中加入營養(yǎng)鹽(64.75 mg/L NaHCO3，5.75 mg/L KCl，123.25 mg/L MgSO4·7H2O和294 mg/L CaCl2·2H2O)，并維持水溫在28±1 ℃，pH值為6.85～7.0，光照周期為12 h明/12 h暗。每天兩次投喂經(jīng)紫外消毒的紅赤蟲，養(yǎng)殖1個月后可進(jìn)行實驗。

圖1 斑馬魚養(yǎng)殖裝置

1.2 暴露溶液的配制

BDE-47(2，2′，4，4′-tetrabromodi-phenyl ether，Wellington，加拿大，純度>99.9%)不溶于水，故選取二甲基亞楓(DMSO)對BDE-47粉末進(jìn)行溶解，配制1 mg/mL濃度的BDE-47儲備液，同時配制3.35 mg/L，33.5 mg/L，335 mg/L的PER(Invitrogen，美國，純度99%)溶液。分別在PER溶液中加入不同體積的BDE-47儲備液，稀釋至所需濃度，配制成3種不同濃度的BDE-47與PER的混合液，分別為(BDE-47 8.5+PER 335)mg/L，(BDE-47 0.85+PER 33.5)mg/L，(BDE-47 0.085+PER 3.35)mg/L。將所得的3種濃度的溶液分別裝瓶并標(biāo)注。稀釋水均為養(yǎng)殖斑馬魚的循環(huán)水。

1.3 暴露方法

將成年斑馬魚以每組雌雄各20條的搭配方式置于培養(yǎng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)濃度和成分的不同設(shè)置11組暴露溶液，分別為3組不同濃度的BDE-47溶液(8.5 mg/L，0.85 mg/L，0.085 mg/L)，3組不同濃度的PER溶液(335 mg/L，33.5 mg/L，3.35 mg/L)，3組不同濃度的聯(lián)合暴露溶液(BDE-47 8.5+PER 335)mg/L，(BDE-470.85+PER 33.5)mg/L，(BDE-470.085+PER 3.35)mg/L，實驗同時設(shè)置空白對照組以及0.3%的DMSO對照組。暴露14天后對雌雄斑馬魚進(jìn)行取樣，取樣后提取成年斑馬魚的肝臟，制成10%的組織勻漿進(jìn)行抗氧化系統(tǒng)的檢測。

1.4 抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)測定方法

在暴露14天后，從各濃度組中分別提取5條雌性成年斑馬魚及5條雄性成年斑馬魚并將其分別開，用MS-222進(jìn)行麻醉后，提取斑馬魚的肝臟。由于斑馬魚是彌散性肝臟，提取時要注意不能混入脂肪。然后，加入組織塊9倍重量的冷生理鹽水，通過機(jī)械勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，取上清液，得到10%的組織勻漿。

抗氧化系統(tǒng)的檢測主要測定斑馬魚肝臟內(nèi)的超氧化歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、谷胱甘肽(GSH)活性以及丙二醛(MDA)水平。所有抗氧化酶試劑盒均購自南京建成生物有限公司，測定流程按照說明書嚴(yán)格操作。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)使用Kolmogorov-Smirnov進(jìn)行檢驗分析，并應(yīng)用Levene’s檢驗分析方差的同質(zhì)性。所有統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件(SPSS，Chicago，USA)進(jìn)行操作。當(dāng)p<0.05時，判定存在顯著性差異。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)給出，所有數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 BDE-47與PER復(fù)合對成年斑馬魚肝臟SOD活性的影響

超氧化物歧化酶(Orgotein Superoxide Dismutase，SOD)能夠?qū)⑸矬w在新陳代謝中生成的有害物質(zhì)清除。根據(jù)與之結(jié)合的金屬離子的種類不同可以分為3種SOD：分別是含銅與鋅超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)、含鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和含錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)。這3種SOD都能起到催化超氧化物陰離子自由基的作用，并將之歧化為H2O2與O2。當(dāng)外源物質(zhì)刺激生物機(jī)體，導(dǎo)致生物機(jī)體自身的氧化機(jī)團(tuán)增加時，SOD會最先啟動，對氧化機(jī)團(tuán)所造成的損傷進(jìn)行抵抗[11]。

BDE-47與PER聯(lián)合暴露后斑馬魚肝臟SOD活性的變化如圖2所示。對于雌雄斑馬魚而言，PER單獨(dú)暴露組SOD的活性與對照組相比沒有顯著的變化，而BDE-47單獨(dú)暴露以及二者聯(lián)合暴露后雌雄斑馬魚肝臟內(nèi)的SOD活性均隨濃度的增加而增加，而且聯(lián)合暴露組SOD的活性高于兩種物質(zhì)單一暴露。由此可見，PER的加入能夠加劇BDE-47對SOD活性的誘導(dǎo)。同時，雌魚SOD的活性高于雄魚，說明BDE-47與PER聯(lián)合暴露對斑馬魚肝臟SOD活性的作用存在性別差異。吉貴祥等[12]對斑馬魚胚胎及幼魚的BDE-47急性毒性實驗也發(fā)現(xiàn)，隨著BDE-47暴露濃度的增加，SOD的活性也顯著增強(qiáng)。Albina等[13]研究了BDE-99對成年鼠肝臟與腎臟的氧化激，結(jié)果顯示BDE-99能顯著地誘導(dǎo)SOD的活性。

2.2 BDE-47與PER復(fù)合對成年斑馬魚肝臟CAT活性的影響

過氧化氫酶(Catelase，CAT)以在過氧化體中存在的形式存在于紅細(xì)胞及某些組織內(nèi)，主要作用是將H2O2催化分解為H2O與O2，使之無法與O2在鐵螯合物催化作用下發(fā)生反應(yīng)，從而避免生成有害的-OH[11]。

(a)雄魚肝臟 (b)雌魚肝臟圖2 BDE-47與PER聯(lián)合暴露后斑馬魚肝臟SOD活性的變化

說明：*p<0.05和**p<0.01表示暴露組與對照組相比差異顯著(下同)

圖3顯示了暴露14天后雌雄斑馬魚肝臟內(nèi)CAT的活性。由圖3可知PER暴露組CAT活性沒有顯著的變化，而BDE-47暴露組CAT活性呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，且8.5 mg/L處理組CAT的活性較對照組顯著增加。說明高濃度BDE-47暴露后，胚胎受到外源有毒物質(zhì)的刺激，胚胎細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)等ROS顯著增加，為了維持機(jī)體自由基的產(chǎn)率與抗氧化系統(tǒng)清除自由基的動態(tài)平衡，機(jī)體自身CAT啟動。由圖3還可以看出，聯(lián)合暴露組也呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，顯著上升出現(xiàn)在0.85 mg/L BDE-47+33.5 mg/L PER暴露組以及8.5 mg/L BDE-47+335 mg/L PER暴露組(p<0.05)。同時，雌性成年斑馬魚與雄性成年斑馬魚的CAT活性變化十分相似，初步判斷該現(xiàn)象與SOD活性同步變化有關(guān)，可能是由于CAT協(xié)同SOD抵抗氧化脅迫所造成的結(jié)果。與單獨(dú)暴露組相比，聯(lián)合暴露組呈現(xiàn)的高活性CAT表明二者聯(lián)合對斑馬魚產(chǎn)生的氧化脅迫程度更強(qiáng)，對CAT的誘導(dǎo)更強(qiáng)。

(a)雄魚肝臟 (b)雌魚肝臟圖3 BDE-47與PER聯(lián)合暴露后斑馬魚肝臟CAT活性的變化

2.3 BDE-47與PER復(fù)合對成年斑馬魚肝臟GSH活性的影響

谷胱甘肽(glutathione；GSH)是一種有抗氧化和整合解毒的三肽，能夠參與生物轉(zhuǎn)化，將侵入生物機(jī)體內(nèi)的有害毒物轉(zhuǎn)化并排出體外[11]。BDE-47與PER聯(lián)合暴露后斑馬魚肝臟GSH活性的變化如圖4所示，對于雌性而言，PER單獨(dú)暴露肝臟內(nèi)GSH活性沒有顯著變化，而8.5 mg/L BDE-47處理組中肝臟內(nèi)GSH的活性較對照組顯著降低(p<0.05)。表明PER加入后，機(jī)體產(chǎn)生多余的自由基由GSH抵消而導(dǎo)致GSH含量降低，說明此時雄性斑馬魚氧化脅迫較大。He等[14]發(fā)現(xiàn)，BDE-47暴露能夠使鼠海馬神經(jīng)元產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，隨著暴露劑量的增加，GSH濃度也呈現(xiàn)降低趨勢。

(a)雄魚肝臟 (b)雌魚肝臟圖4 BDE-47與PER聯(lián)合暴露后斑馬魚肝臟GSH活性的變化

2.4 BDE-47與PER復(fù)合對成年斑馬魚肝臟MDA水平的影響

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一。MDA的含量變化可以反映出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接反映出細(xì)胞損害的程度，相對于魚類模型而言，MDA常作為環(huán)境污染物毒性效應(yīng)的敏感指示物出現(xiàn)在毒理學(xué)實驗中。

圖5顯示了BDE-47與PER聯(lián)合暴露14天后雌雄魚肝臟內(nèi)MDA的水平。由圖5可知，對于雄性斑馬魚而言，PER單獨(dú)暴露肝臟內(nèi)的MDA水平均沒有顯著差異；而在BDE-47單一暴露組中，雌雄魚肝臟內(nèi)MDA的水平均上升且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，且在高濃度暴露組中MDA水平上升顯著。在聯(lián)合暴露組中，MDA均顯著上升并存在劑量效應(yīng)關(guān)系，且大于BDE-47單一暴露組。研究結(jié)果表明，BDE-47單一暴露組與聯(lián)合暴露組均能誘導(dǎo)肝臟發(fā)生脂質(zhì)過氧化，且聯(lián)合暴露組誘導(dǎo)性更強(qiáng)，說明PER能夠加劇BDE-47誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。在早期的BDE-47與PER對斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激的研究中也得出了類似結(jié)果[15]。吉貴祥等[12]通過實驗也得出了相似結(jié)論，MDA含量的變化與BDE-47濃度的變化呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

(a)雄魚肝臟 (b)雌魚肝臟圖5 BDE-47與PER聯(lián)合暴露后斑馬魚肝臟MDA水平的變化

3 結(jié)論

通過對BDE-47與PER聯(lián)合暴露后斑馬魚肝臟SOD，CAT，GSH與MDA抗氧化指標(biāo)的分析，可見PER加入后的聯(lián)合暴露組SOD，CAT的活性以及MDA水平顯著增加，GSH顯著降低，表明PER能加劇BDE-47對抗氧化系統(tǒng)的影響，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，加大氧化損傷。

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