HMGB1改善耐吉西他濱胰腺癌PANC1細胞化療敏感性的作用及其機制研究

陸德文 李先鵬 張波 姜玉華 許豐 郭世偉

胰腺癌化療敏感性低，容易產(chǎn)生耐藥性，因此探索其耐藥機制并尋求新的化療藥物對胰腺癌的治療具有重要的臨床意義[1-2]。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1, HMGB1)是細胞內(nèi)高豐度的染色體結(jié)合蛋白，在應(yīng)激狀態(tài)下的細胞DNA損傷修復(fù)中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)某些腫瘤通過高表達HMGB1及其晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)適應(yīng)不利的微環(huán)境，包括能量和供氧壓力、機體免疫系統(tǒng)的攻擊等[3-4]。本研究通過抑制胰腺癌耐吉西他濱細胞株HMGB1的表達，觀察其對吉西他濱敏感性的影響，并探討其可能機制。

材料與方法

一、耐吉西他濱胰腺癌PANC1細胞株的建立

人胰腺癌PANC1細胞株為鄞州人民醫(yī)院實驗室凍存，常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。通過濃度梯度遞增誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法建立耐吉西他濱胰腺癌PANC1細胞株(PANC1-GR)，即取對數(shù)生長期細胞接種于培養(yǎng)瓶中，以5 μmol/L吉西他濱誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，去除死亡細胞后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d，傳代后梯度增加吉西他濱濃度(10、20、30、50、75、100、150 μmol/L)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。確定細胞能夠存活并穩(wěn)定傳代的最高吉西他濱濃度，以獲得PANC1-GR細胞株。

二、靶向HMGB1的siRNA轉(zhuǎn)染PANC1細胞

分別取對數(shù)生長期PANC1和PANC1-GR細胞，以5×104/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，采用脂質(zhì)體法將靶向HMGB1的siRNA轉(zhuǎn)染細胞，按試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染后的細胞分別為siRNA-HMGB1-PANC1細胞及siRNA-HMGB1-PANC1-GR細胞。

三、吉西他濱對PANC1細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)和耐藥指數(shù)(resistance index, RI)檢測

取對數(shù)生長期的PANC1、PANC1-GR、siRNA-HMGB1-PANC1、siRNA-HMGB1-PANC1-GR細胞，以5×103/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，以含0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μmol/L吉西他濱的培養(yǎng)液處理PANC1細胞，以含50、100、150、200、300 μmol/L吉西他濱的培養(yǎng)液處理PANC1-GR細胞。每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，以未處理細胞作為對照。48 h后更換培養(yǎng)液，每孔加入10 μl的CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)3 h，置酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔450 nm波長的吸光度值(A450值)。繪制生長曲線獲取IC50值，通過公式計算RI。RI=PANC1-GR的IC50值/PANC1的IC50值。

四、蛋白質(zhì)印跡法檢測PANC1細胞HMGB1、Beclin1蛋白表達

取對數(shù)生長期的PANC1、PANC1-GR及siRNA-HMGB1-PANC1、siRNA-HMGB1-PANC1-GR細胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后分別用150 μmol/L吉西他濱誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h。收集各組細胞，通過RIPA裂解液獲取細胞總蛋白。經(jīng)BCA試劑盒定量后，取30 μg常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測HMGB1及自噬標志蛋白Beclin1的表達，以β-actin為內(nèi)參。小鼠抗人HMGB1、Beclin1單抗均1∶1 000稀釋，辣根過氧化物酶標記的二抗1∶2 000稀釋，最后經(jīng)ECL發(fā)光，在凝膠成像系統(tǒng)(ImageQuant, GE)成像，應(yīng)用Image J圖像分析軟件檢測各條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

五、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平

取上述4株對數(shù)生長期細胞，以5×105/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用150 μmol/L吉西他濱處理48 h。收集各組細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500 μl的Binding buffer懸浮細胞，依次加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI，混勻后置室溫避光反應(yīng)10 min，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、吉西他濱對4株P(guān)ANC1細胞的IC50值

PANC1細胞在100 μmol/L吉西他濱處理后能穩(wěn)定生長和傳代，從而建立了PANC1-GR細胞株。吉西他濱對PANC1和PANC1-GR的IC50值分別為(4.7±0.4)μmol/L和(166.5±13.6)μmol/L，PANC1-GR細胞顯著高于PANC1細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-25.826，P<0.01)；RI均值為35.4。siRNA-HMGB1-PANC1、siRNA-HMGB1-PANC1-GR細胞的IC50值分別為(3.2±0.3)、(52.4±8.4)μmol/L，顯著低于相應(yīng)的未轉(zhuǎn)染細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為8.257、14.524，P值均<0.01)；RI均值為16.4。

二、PANC1和PANC1-GR細胞HMGB1蛋白表達

PANC1和PANC1-GR細胞HMGB1蛋白相對表達量分別為0.17±0.08和0.38±0.11，PANC1-GR細胞中的表達量顯著高于PANC1細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.934，P<0.01，圖1)。

三、4株P(guān)ANC1細胞的Beclin1蛋白表達

PANC1、PANC1-GR、siRNA-HMGB1-PANC1、siRNA-HMGB1-PANC1-GR細胞Beclin1蛋白相對表達量分別為2.68±0.33、3.28±0.15、0.68±0.23、0.78±0.11，2株轉(zhuǎn)染細胞的Beclin1表達量顯著低于相應(yīng)的未轉(zhuǎn)染細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為9.853、14.62，P值均<0.01，圖2)。

圖1 HMGB1蛋白在PANC1(1)、PANC1-GR(2)細胞中的表達

圖2 Beclin1蛋白在PANC1(1)、siRNA-HMGB1-PANC1(2)、PANC1-GR(3)、siRNA-HMGB1-PANC1-GR(4)細胞中的表達

四、4株P(guān)ANC1細胞的凋亡率

PANC1、PANC1-GR、siRNA-HMGB1-PANC1、siRNA-HMGB1-PANC1-GR的細胞凋亡率分別為(34.58±3.14)%、(19.41±1.53)%、(79.56±3.58)%、(34.57±2.94)%，2株轉(zhuǎn)染細胞的凋亡率均顯著高于相應(yīng)的未轉(zhuǎn)染細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為-49.717、-24.753，P值均<0.01，圖3)。

討 論

細胞自噬是細胞在營養(yǎng)缺乏或應(yīng)激條件下，通過清除胞質(zhì)內(nèi)錯誤折疊的蛋白質(zhì)、脂類及受損細胞器，回收代謝物質(zhì)、降低活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)傷害的一種自救和質(zhì)控方式[5-6]。目前研究證實，放化療過程中一部分癌細胞能夠通過自噬的方式獲得耐藥性，從而逃避凋亡命運[7]。

胰腺癌細胞在基礎(chǔ)條件下表現(xiàn)出的組成性自噬被抑制時，ROS增加，引起DNA損傷和線粒體氧化磷酸化減少，進而使胰腺癌細胞生長抑制導(dǎo)致腫瘤消退[8-9]。而ROS過度會引起HMGB1的易位和釋放，二硫化物HMGB1與RAGE結(jié)合，誘導(dǎo)Beclin 1依賴性自噬，并增加腫瘤細胞對化療藥物或電離輻射的抗性[10-11]。HMGB1-RAGE途徑在誘導(dǎo)自噬中發(fā)揮關(guān)鍵作用， 抑制HMGB1-RAGE可導(dǎo)致胰腺癌細胞凋亡增加和自噬減少，而RAGE可通過p53抑制化療引起的細胞凋亡。核內(nèi)p53以轉(zhuǎn)錄依賴的方式刺激自噬，而胞質(zhì)內(nèi)p53以不依賴轉(zhuǎn)錄的方式抑制自噬體的形成[12-13]。RAGE還可通過降低雷帕霉素靶標(mTOR)的磷酸化或增加Beclin 1-Vps34相互作用，進而調(diào)節(jié)介導(dǎo)自噬體形成的某些分子，維持自噬水平[14]。因此，HMGB1的自噬調(diào)節(jié)作用可能是通過HMGB1-RAGE途徑介導(dǎo)的，內(nèi)源性HMGB1是增強細胞存活并限制程序性細胞凋亡的關(guān)鍵因子[15]。

圖3 PANC1(3A)、siRNA-HMGB1-PANC1(3B)、PANC1-GR(3C)、siRNA-HMGB1-PANC1-GR(3D)的細胞凋亡

本研究結(jié)果顯示，抑制HMGB1表達可下調(diào)自噬標志蛋白Beclin1，從而改善PANC1細胞對吉西他濱的敏感性。以HMGB1為靶標，利用HMGB1受體的單抗和轉(zhuǎn)染抑制劑，抑制HMGB1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并與其他抗癌藥物協(xié)同作用可能是克服腫瘤細胞抗藥性的有效策略。

參 考 文 獻

[1] Baines AT, Martin PM, Rorie CJ. Current and emerging targeting strategies for treatment of pancreatic cancer[J].Prog Mol Biol Transl Sci,2016,144:277-320.DOI:10.1016/bs.pmbts.2016.09.006.

[2] Fogel EL, Shahda S, Sandrasegaran K, et al. A multidisciplinary approach to pancreas cancer in 2016: A review[J].Am J Gastroenterol,2017,112(4):537-554.DOI:10.1038/ajg.2016.610.

[3] Kang R, Tang D, Lotze MT, et al. RAGE regulates autophagy and apoptosis following oxidative injury[J].Autophagy,2011,7(4):442-444.

[4] Sims GP, Rowe DC, Rietdijk ST, et al. HMGB1 and RAGE in inflammation and cancer[J].Annu Rev Immunol,2010,28:367-388.DOI: 10.1146/annurev.immunol.021908.132603.

[5] Auberger P, Puissant A. Autophagy, a key mechanism of oncogenesis and resistance in leukemia[J].Blood,2017,129(5):547-552.DOI:10.1182/blood-2016-07-692707.

[6] Gugnoni M, Sancisi V, Manzotti G, et al. Autophagy and epithelial-mesenchymal transition: an intricate interplay in cancer[J].Cell Death Dis,2016,7(12):e2520.DOI:10.1038/cddis.2016.415.

[7] Yang ZJ, Chee CE, Huang S, et al. The role of autophagy in cancer: therapeutic implications[J].Mol Cancer Ther,2011,10(9):1533-1541.DOI:10.1158/1535-7163.MCT-11-0047.

[8] Kang R, Tang D. Autophagy in pancreatic cancer pathogenesis and treatment[J].Am J Cancer Res,2012,2(4):383-396.

[9] Yang S, Wang X, Contino G, et al. Pancreatic cancers require autophagy for tumor growth[J].Genes Dev,2011,25(7):717-729.DOI: 10.1101/gad.2016111.

[10] Tang D, Loze MT, Zeh HJ, et al. The redox protein HMGB1 regulates cell death and survival in cancer treatment[J].Autophagy,2010,6(8):1181-1183.DOI:10.4161/auto.6.8.13367.

[11] Mou K, Liu W, Han D, et al. HMGB1/RAGE axis promotes autophagy and protects keratinocytes from ultraviolet radiation-induced cell death[J].J Dermatol Sci,2017,85(3):162-169.DOI: 10.1016/j.jdermsci.2016.12.011.

[12] Kang R, Tang D, Loze MT, et al. Apoptosis to autophagy switch triggered by the MHC class III-encoded receptor for advanced glycation endproducts (RAGE)[J].Autophagy,2011,7(1):91-93.DOI: 10.1038/cdd.2009.149.

[13] Livesey KM, Kang R, Vernon P, et al. p53/HMGB1 complexes regulate autophagy and apoptosis[J].Cancer Res,2012,72(8):1996-2005.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-11-2291.

[14] Kang R, Tang D, Schapiro NE, et al. The receptor for advanced glycation end products (RAGE) sustains autophagy and limits apoptosis, promoting pancreatic tumor cell survival[J].Cell Death Differ,2010,17(4):666-676.DOI: 10.1038/cdd.2009.149.

[15] Tang D, Kang R, Livesey KM, et al. Endogenous HMGB1 regulates autophagy[J].J Cell Biol,2010,190(5):881-892.DOI:10.1083/jcb.200911078.