檀香烯與檀香醇生物合成研究進(jìn)展

王雨辰，文孟良，李銘剛，趙江源，韓秀林

1 云南大學(xué) 云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西南微生物多樣性教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省微生物研究所，云南 昆明 650091

2云南省保山市中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，云南 保山 678000

萜類化合物是天然產(chǎn)物中種類最多、結(jié)構(gòu)多樣性最豐富的家族之一，目前已在動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)80 000余種[1]，萜類在生物個(gè)體或細(xì)胞間的交流、防御和適應(yīng)性演化過程中起重要作用，具有廣泛的抗菌、抗腫瘤和抗氧化等藥理活性，其中有些還具有特殊的香氣，因而在醫(yī)藥、食品、化妝品以及生物能源等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[2-3]。萜類主要從植物中提取獲得，普遍存在產(chǎn)率與純度低、成本高及易污染環(huán)境等許多問題；而萜類的立體選擇性合成難度大，導(dǎo)致萜類尚未大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用。近年來代謝工程與合成生物學(xué)的發(fā)展讓釀酒酵母Saccharomycescerevisiae和大腸桿菌Escherichia coli等微生物細(xì)胞工廠異源合成稀缺萜類成為可能[4-11]，這對(duì)于資源稀缺、成本昂貴的萜類提供了新的可持續(xù)的綠色生產(chǎn)途徑 (表 1)。

來源于檀香樹Santalum album的倍半萜檀香烯和檀香醇是檀香精油的主要成分，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但由于檀香樹生長條件苛刻、生長期長、精油含量低且市場需求旺盛，導(dǎo)致檀香樹被過度采伐，檀香精油產(chǎn)量下滑，價(jià)格上漲[12]。如果采用微生物細(xì)胞工廠異源生物合成檀香烯和檀香醇，則能提高效率、降低成本、打破自然條件限制而有效緩解檀香精油的供需矛盾。文中對(duì)檀香烯合酶 (Santalene synthase，SaSS) 和來源于檀香樹的細(xì)胞色素 P450單加氧酶 (Cytochrome P450 monooxygenase，CYP450) 進(jìn)行總結(jié)，同時(shí)對(duì)生物合成檀香烯的甲羥戊酸途徑 (Mevalonate pathway，MVA) 改造的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，分析蛋白質(zhì)工程在萜類合酶的成功案例，提出綜合利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)結(jié)合代謝路徑改造的方法對(duì)檀香烯生物合成進(jìn)行定向改造的思路，為檀香烯和檀香醇的優(yōu)產(chǎn)研究提供參考。

1 檀香精油主要成分及功用

市售檀香精油 (CAS No. 8006-87-9) 主要通過水蒸汽蒸餾印度檀香Santalum album、新喀里多尼亞檀香Santalumaustrocaledonicum和澳洲檀香Santalum spicatum的心材和根來獲得[13]。迄今已從S.album精油中鑒定出以倍半萜類為主的230多種香氣成分，其中 (Z)-(+)-α-檀香醇 (1) 和(Z)-(-)-β-檀香醇 (2) 是兩個(gè)最主要香氣成分；1的氣味類似雪松木和 α-雪松烯，2的豐度較低，但香氣更強(qiáng)烈，是S.album精油獨(dú)特香味的主要成分[14]；市售S.album精油中 1的含量在41%-55%，2的含量在16%-24%，主要成分結(jié)構(gòu)式及相對(duì)含量分別見圖1和表2[15-16]。

檀香精油在動(dòng)物體內(nèi)毒性較低，無致突變性，因此歐美多國均認(rèn)為是公認(rèn)安全的食品添加劑，雖然對(duì)人偶有刺激或致敏反應(yīng)，但未見其他副作用，推薦安全劑量 0.007 4 mg/(kg·d)[13]。除用于香料和化妝品外，檀香精油及其主要成分還有鎮(zhèn)靜安神[17]、抗炎鎮(zhèn)痛[18]、抗菌[19]、抗病毒[20]、抗氧化[21]、抗腫瘤[22-23]作用，對(duì)皮膚疾病、支氣管炎、黏膜炎、抑郁失眠等具有一定的療效。但目前只有德之馨 (Symrise)、國際香精香料 (IFF)、奇華頓 (Givaudan)、芬美意 (Firmenich) 等幾個(gè)香料寡頭公司以α-龍腦烯醛為原料化學(xué)合成8個(gè) (16–23)香氣接近檀香醇的替代品上市 (圖2)，而且生產(chǎn)工藝復(fù)雜，品質(zhì)還不能取代天然的檀香精油[24]。

2 檀香烯及檀香醇生物合成

植物中的萜類是通過位于細(xì)胞質(zhì)中的 MVA途徑和質(zhì)體中的 2-C-甲基赤蘚醇-4-磷酸 (2-C-methylerythritol-4-phosphate，MEP) 途徑合成異戊二烯 (Isoprene)，進(jìn)一步得到異戊烯基二磷酸

(Isopentenyl diphosphate，IPP) 和二甲基烯丙基二磷酸 (Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)，然后以 IPP和 DMAPP為單位生成香葉基二磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)、法尼烯二磷酸(Farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP) 和香葉基香葉烯二磷酸 (Geranylgeranyl diphosphate，GGPP) 等，根據(jù)異戊二烯 (C5) 的數(shù)量不同分為單萜 (C10)、倍半萜 (C15)、二萜 (C20)、三萜 (C30) 和四萜(C40) 等[25-26]。其中倍半萜檀香烯和檀香醇的生物合成途徑及參與合成的關(guān)鍵酶已基本清楚，首先S.album中的α-/β-檀香烯通過MVA途徑得到FPP，再經(jīng)SaSS酶環(huán)化及多重反應(yīng)合成α-、β-及epi-β-檀香烯，最后在CYP450和NADPH依賴型的細(xì)胞色素 P450還原酶 (Cytochrome P450 reductase，CPR) 協(xié)作下對(duì) C12羥基化形成檀香醇[27-28](圖 3)。

圖1 檀香精油主要成分的結(jié)構(gòu)式[15]Fig. 1 The structures of main components of sandalwood essential oils[15].

表2 市售檀香精油主要成分的相對(duì)含量 (%)Table 2 The relative concentration (%) of the main components of commercial sandalwood essential oils

圖2 化學(xué)合成檀香氣味的上市化合物[24]Fig. 2 Commercially available sandalwood odorant compounds by chemical synthesis[24].

因此，F(xiàn)PP作為合成檀香烯等倍半萜類及其他萜類 (C≥15) 的通用底物，其產(chǎn)率直接影響目標(biāo)萜類產(chǎn)量，由于目前對(duì)宿主MVA途徑的各種酶缺乏充足的酶動(dòng)力學(xué)信息，以及影響宿主代謝物質(zhì)通量的因素復(fù)雜多樣，所以很難建立一個(gè)高效、通用的系統(tǒng)來作為公共底盤細(xì)胞平臺(tái)生產(chǎn)FPP。盡管如此，朱發(fā)銀等利用大腸桿菌E.coli表達(dá)、純化來源于蘋果Malus x domestica的法尼烯合酶 (α-farnesene synthase，AFS) 及E.coli、釀酒酵母S.cerevisiaeMVA途徑中的8個(gè)關(guān)鍵酶，以乙酰-CoA為底物進(jìn)行體外催化實(shí)驗(yàn)，使法尼烯的產(chǎn)量達(dá) 1.1 g/L，并得知各種酶的最佳比例[29]；應(yīng)用該策略生產(chǎn)番茄紅素產(chǎn)量達(dá)1.44 g/L[30]。雖然通過該策略能鑒定出代謝路徑中各種酶的比例及重要性，并簡化關(guān)鍵路徑篩選，但體外實(shí)驗(yàn)無法真正模擬宿主體內(nèi)生理?xiàng)l件，只能作為代謝路徑優(yōu)化設(shè)計(jì)的參考；畢竟宿主的各條代謝路徑是錯(cuò)綜復(fù)雜、有機(jī)聯(lián)系的，目前技術(shù)上也不具備精確表達(dá)多種蛋白質(zhì)的能力，因此在宿主體內(nèi)建立一個(gè)能精確表達(dá)代謝路徑各種酶組成的系統(tǒng)尚待完成。

圖3 檀香烯與檀香醇的生物合成途徑Fig. 3 The bio-synthetic pathway of santalene and santalenol.

2.1 檀香烯合酶基因克隆及功能驗(yàn)證

Misra等最早報(bào)道S.album各組織 (愈傷組織、胚芽、種子、老樹、幼樹) 中均含有SaSS酶，提取的蛋白在體外實(shí)驗(yàn)中能催化FPP合成檀香烯等產(chǎn)物，這與精油中的主要成分相吻合[31-32]。此后從S.album、S.austrocaledonicum和S.spicatum中分別克隆到SaSS基因并進(jìn)行了序列測(cè)定、異源表達(dá)和功能驗(yàn)證[33-34]。除此之外，從野生多毛番茄Solanum habrochaites[35]、香根草Vetiver zizanioides[36]和黃皮Clausena lansium[37]中克隆到SaSS同源基因，并進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證(表 3)。

表3 從檀香樹等物種中得到的檀香烯合酶相關(guān)基因Table 3 The santalene synthase related genes from sandalwood and other species

2.2 宿主代謝途徑優(yōu)化對(duì)檀香烯生物合成的影響

微生物以其生長迅速、營養(yǎng)簡單以及基因工程操作方便和遺傳背景清晰的一系列優(yōu)點(diǎn)，適合作為生物合成的宿主，并且E.coli和S.cerevisiae等宿主天然含有萜類生物合成的途徑，因此多位學(xué)者利用S.cerevisiae和小立碗蘚Physcomitrella patens等作底盤細(xì)胞，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒來合成檀香烯[38-41]，但宿主本身的 MVA或 MEP途徑代謝效率并不高，因此需要對(duì)宿主代謝途徑的關(guān)鍵酶進(jìn)行優(yōu)化，提高檀香烯的產(chǎn)量。例如Chen等過表達(dá)宿主的乙醇脫氫酶基因ADH2和NADPH依賴型醛脫氫酶基因ALD6，使用葡萄糖調(diào)節(jié)的HXT7啟動(dòng)子，導(dǎo)入密碼子優(yōu)化的乙酰-CoA合成酶基因ACS，過表達(dá)乙酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶ERG10等步驟，使乙酰-CoA朝著乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)化，最終S.cerevisiae工程菌的 α-檀香烯產(chǎn)率從2.08 mg/L增加到8.29 mg/L[38]；Scalcinati等將S.cerevisiae鯊烯合酶基因ERG9自帶的啟動(dòng)子替換為葡萄糖敏感型啟動(dòng)子HXT1，減少 FPP合成鯊烯的物質(zhì)流量，同時(shí)敲除編碼FPP脫磷酸化的2個(gè)基因LPP1和DPP1，減少 FPP向法尼醇(Farnesol) 轉(zhuǎn)化；此外過表達(dá)ERG20基因以增加IPP產(chǎn)量，讓葡萄糖富集而固醇的合成減少，增加碳代謝流偏向α-檀香烯合成，最終使S.cerevisiae工程菌的α-檀香烯產(chǎn)量達(dá)到92 mg/L，比出發(fā)菌株提高3.4倍[39-40]。此外，Zhan等通過35S啟動(dòng)子調(diào)控HMGR基因表達(dá)后，使α/β-檀香烯在宿主P.patens中的產(chǎn)量達(dá)到0.039 mg/g干重，這是檀香烯在自養(yǎng)型宿主中異源表達(dá)的首次報(bào)道，開辟了光驅(qū)動(dòng)宿主生產(chǎn)高價(jià)值香料的道路[41]，優(yōu)化方法與結(jié)果見表4。

表4 檀香烯生物合成途徑的優(yōu)化結(jié)果Table 4 The Optimization of biosynthetic pathways for santalene

總之，α/β-檀香烯合酶表達(dá)優(yōu)化方法主要是：1) 替換啟動(dòng)子，使被調(diào)控基因具備更好的可調(diào)節(jié)性，通過改變培養(yǎng)條件調(diào)節(jié)表達(dá)量；2) 增加基因拷貝數(shù)過表達(dá)目標(biāo)酶，利用強(qiáng)啟動(dòng)子等過表達(dá)底物合成基因，增加底物量；3) 敲除或抑制代謝路徑分支點(diǎn)的基因，減少不必要的底物消耗；4) 對(duì)目的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，提高目的基因與宿主的協(xié)調(diào)適應(yīng)性；5) 改變宿主類型，利用自養(yǎng)型宿主作為底盤細(xì)胞工廠，降低生產(chǎn)成本。

2.3 檀香樹CY P450基因克隆及功能驗(yàn)證

CYP450能以各種萜類為底物對(duì)不同位置的 C羥基化，因此能催化檀香烯的C12位羥基化，形成檀香醇[42]。多位學(xué)者通過分析挖掘S.album轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息，從S.album克隆得到多個(gè)CYP450基因，大部分都能催化檀香烯得到檀香醇，其中Sa-CYP76F39v1的催化率接近 100%[28,43-44]。從S.album中得到的CYP450及其催化產(chǎn)物見表5。

表5 S. album中得到的P450單加氧酶Table 5 The cytochrome P450 monooxygenase from S. album

3 α-/β-檀香烯合酶基因定點(diǎn)突變探索

SaSS酶屬于植物萜類環(huán)化酶中的一種，根據(jù)目前報(bào)道的植物來源萜類合酶結(jié)構(gòu)，這類酶都包含相似的保守結(jié)構(gòu)，能把無環(huán)的 GPP、FPP或GGPP分別環(huán)化為單萜、倍半萜或二萜類化合物。Bohlmann等綜合28種植物的33個(gè)萜類合酶家族序列和其他萜類合酶蛋白三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)這類酶的活性部位是1個(gè)反平行α-螺旋構(gòu)成的大中央空腔，空腔內(nèi)壁相對(duì)位置有2個(gè)富含Asp的絕對(duì)保守結(jié)構(gòu)域 DDxxD (“x”表示任意氨基酸)，Asp的側(cè)鏈基團(tuán)通過與 Mg2+橋接后介導(dǎo)與底物上的磷酸結(jié)合，從而誘導(dǎo)酶構(gòu)象發(fā)生改變，在活性空腔其他側(cè)鏈基團(tuán)作用下，使底物 (GPP、FPP或GGPP) 上的二磷酸斷裂并從空腔逸出，脫下二磷酸的底物產(chǎn)生1個(gè)烯丙基碳正離子親電攻擊C＝C雙鍵，進(jìn)一步降低烴鏈對(duì)第1個(gè)環(huán)閉合的影響，促進(jìn)第1個(gè)環(huán)及更多的環(huán)產(chǎn)生，而酶蛋白N-端區(qū)域在空腔入口處形成的蓋子狀結(jié)構(gòu)能維持空腔疏水性作用，防止烴鏈逃逸[45-47]?；诖耍辔粚W(xué)者根據(jù)萜類合酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了定向突變研究，方法集中在以下幾個(gè)方面。

3.1 基于X-ray衍射單晶結(jié)構(gòu)的定向誘變

此方法利用 X-ray衍射技術(shù)，對(duì)比酶、酶結(jié)合底物類似物復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)起關(guān)鍵作用的基團(tuán)從而進(jìn)行定向突變，比如 Gennadios等以樹棉Gossypium arboreum的 (+)-δ-蓽澄茄烯合酶 ((+)-δ-Cadinene synthase，DCS) 為研究對(duì)象，對(duì) DDxxD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行定向突變 (D308A)，使該酶的Km值增加了 13倍[48]。同理把煙草Nicotiana tabacum的5-epi-馬兜鈴烯合酶(5-epi-aristolochene synthase，TEAS) 和天仙子Hyoscyamus muticus的 premnaspirodiene合酶(HPS) 的2個(gè)活性殘基進(jìn)行對(duì)調(diào)突變，結(jié)果使這2個(gè)酶的產(chǎn)物也發(fā)生了對(duì)調(diào)[49]。

3.2 基于分子進(jìn)化理論的定向突變

在缺乏相關(guān)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)情況下，可根據(jù)分子進(jìn)化分析數(shù)據(jù)及同源蛋白中氨基酸突變概率，對(duì)大量同源基因序列及中心代謝途徑相關(guān)酶氨基酸序列進(jìn)行分析，找到最保守的氨基酸殘基并對(duì)其進(jìn)行定向突變。如對(duì)宿主S.cerevisiae的羥甲基戊二酸單酰-CoA還原酶 (tHMGR) 和巨冷杉Abies grandis的γ-蛇麻烯合酶 (γ-humulene synthase，HUM) 分別進(jìn)行9個(gè)和6個(gè)位點(diǎn)定向突變，最終使宿主生長量翻了 3–4倍，γ-蛇麻烯產(chǎn)量提高近1 000倍[50]，而以PDB公布的5-epi-馬兜鈴烯合酶的晶體結(jié)構(gòu)作為依據(jù)，對(duì)HUM19個(gè)候選殘基定向突變，其中S484經(jīng)飽和誘變后與野生型比較產(chǎn)物提高 100–1 000倍[51]。另外，易錯(cuò)PCR (Error-prone PCR) 技術(shù)也能進(jìn)行定向突變，但文庫篩選工作量大，并且融合蛋白標(biāo)簽的活性并不一定能真實(shí)反映誘變蛋白活性[52]。

3.3 SaSS蛋白模擬建模及其定向突變思考

根據(jù) NCBI 中保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫 (Conserved Domain Database，CDD https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/) 公布的信息，SaSS酶 (Protein ID in NCBI：ADO87000，569aa) 屬于植物萜類環(huán)化酶 1類，預(yù)測(cè) SaSS酶三維結(jié)構(gòu)是由 α-螺旋通過短小的環(huán)和轉(zhuǎn)折連接組成，包含兩個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域：N-末端結(jié)構(gòu)與糖苷水解酶的一個(gè)未知功能結(jié)構(gòu)類似；C-末端結(jié)構(gòu)域是催化檀香烯合成的區(qū)域，該區(qū)域的 D-螺旋和 H-螺旋分別有 D321DGYD325基序和N463DIGT467SPDE471基序，這兩個(gè)基序位于活性空腔入口的相對(duì)位置，靠近入口位置還有2個(gè)無序的A-C環(huán)和J-K環(huán)。因此認(rèn)為D321DGYD325和N463DIGT467SPDE471這兩個(gè)基序在結(jié)合Mg2+后能固定底物FPP上的二磷酸基團(tuán)，在此基礎(chǔ)上，J-K環(huán)形成一個(gè)蓋子在活性空腔入口處，維持空腔疏水性防止烴鏈逃逸。而參與結(jié)合Mg2+的基序在植物倍半萜合酶中很保守，一旦突變則活性喪失，因此對(duì)于定向突變則應(yīng)關(guān)注疏水性空腔的殘基[46,53-54]。所以推測(cè)其構(gòu)成蓋子部位活性殘基可能是32–39，470–471，473–476，478–481，542–545；底物結(jié)合口袋的殘基可能是 284，293，314，316–318，321，325，396，460–461，463–464，467，471，539，543，545；底物-Mg2+結(jié)合部位殘基可能是 321、325、463、467、471；富 Asp殘基是 321–325和463–471，這些殘基可作為定向進(jìn)化參考位點(diǎn)[45-47](圖 4)。

此外，利用SWISS-MODEL在線工具 (https://swissmodel.expasy.org/) 對(duì) SaSS酶三級(jí)結(jié)構(gòu)建模，共搜索到已公布 X-ray衍射晶體結(jié)構(gòu)的相似酶 95個(gè)，相似度 10.42%-45.49%；利用 Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?i d=index) 進(jìn)行模擬建模，共搜索到同源蛋白99個(gè)，有3D模型的20個(gè)；根據(jù)CSA (Catalytic Site Atlas http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSA/)對(duì)已知萜類合酶的催化活性位點(diǎn)的標(biāo)注 (表 6)，得到與SaSS酶相似度最高的12個(gè)酶蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，可考慮用相似度最高的 (+)-limonene synthase蛋白分子三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)作為 SaSS酶定向突變的標(biāo)準(zhǔn)模板，并結(jié)合 CDD公布的保守殘基綜合考慮，決定定向突變位點(diǎn)。綜合比較數(shù)據(jù)得知SaSS酶序列中的293W、545F位點(diǎn)是潛在的保守催化活性位點(diǎn)，可嘗試對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變來檢測(cè)活性變化。

目前各數(shù)據(jù)庫公布了很多植物來源的萜類合酶三維結(jié)構(gòu) (表 6)，能利用這些數(shù)據(jù)為定向突變提供指導(dǎo)，可能采取的方法及思路主要是：基于 X-ray得到酶與底物類似物結(jié)合后的復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)，分析得知活性中心中的柔性殘基(與底物結(jié)合緊密，并對(duì)催化反應(yīng)起關(guān)鍵作用，具有定向突變潛力的氨基酸殘基)，然后對(duì)這些氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變；或者基于已知的同源蛋白三維結(jié)構(gòu)來模擬構(gòu)建目的蛋白三維結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步篩選活性位點(diǎn)的柔性殘基進(jìn)行突變；也可以搜索同源蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)建立數(shù)據(jù)庫，來與目的蛋白比對(duì)得到保守殘基位點(diǎn)，以此篩選柔性殘基并對(duì)其進(jìn)行突變。在以上方法中，如何確定柔性殘基位點(diǎn)以及突變成何種氨基酸是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。

圖4 CDD模擬SaSS未結(jié)合底物與結(jié)合底物的模型Fig. 4 The simulation model of SaSS unbound substrate and substrate binding from the CDD.

表6 與檀香烯合酶相似度最高的12種蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)Table 6 The 12 proteins data with the highest structural similarity to SaSS

4 總結(jié)與展望

綜上所述，目前檀香烯的生物合成方法主要是通過對(duì)底盤細(xì)胞 MVA途徑中關(guān)鍵基因的上調(diào)或者下調(diào)、替換或增加高效啟動(dòng)子元件、利用自養(yǎng)型宿主來替換S.cerevisiae降低資源消耗等方法，最終讓微生物細(xì)胞工廠合成檀香烯。但由于底物 FPP產(chǎn)率低及分支代謝太多使檀香烯產(chǎn)量低，改造 MVA代謝途徑也有其局限性，無論使用多高效率的調(diào)控元件來啟動(dòng)目的基因表達(dá)，宿主也不可能消耗過多能量及資源來合成它自身并不需要的異源產(chǎn)物；甚至某些目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)宿主有毒性，況且宿主的平衡調(diào)節(jié)機(jī)制也不允許自身過量表達(dá)異源產(chǎn)物。若要從根本上打破這個(gè)局限性而達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求，可從以下幾方面考慮：1) 在工程學(xué)思想的指導(dǎo)下構(gòu)建更為合理的表達(dá)模塊，結(jié)合酶動(dòng)力學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的輔助分析，了解宿主 MVA代謝途徑各酶表達(dá)水平和代謝中間物質(zhì)流規(guī)律，定向改造代謝途徑，盡可能提高通用底物表達(dá)水平，最終使構(gòu)建的表達(dá)模塊更為協(xié)調(diào)、高效而合理。2) 利用基因編輯技術(shù)如 CRISPR-Cas9系統(tǒng)來對(duì)宿主S.cerevisiae的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，增加宿主中表達(dá)模塊的拷貝數(shù)，以利于產(chǎn)物的累積。3) 利用冷凍電鏡解析關(guān)鍵酶蛋白分子結(jié)構(gòu)，結(jié)合人工智能和大數(shù)據(jù)來分析指導(dǎo)酶蛋白定向改造策略，以及從量子水平探索酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，從而對(duì)目標(biāo)酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和定向突變，這樣能從根本上打破單純改造代謝途徑的頂板效應(yīng)，大大提高酶活性甚至能得到一個(gè)全新的酶。4) 對(duì)S.cerevisiae的代謝組進(jìn)行立體研究，構(gòu)建高效、精準(zhǔn)表達(dá)各種酶的宿主，為其他萜類合酶基因?qū)胩峁┩ㄓ玫妆P細(xì)胞平臺(tái)。5) 選擇更廣泛的宿主，比如自養(yǎng)型微生物或者人造S.cerevisiae(人工設(shè)計(jì)合成基因組，遺傳背景清楚，敲除了冗余無效基因的S.cerevisiae) 作宿主，利于精確的整體表達(dá)調(diào)控及節(jié)省成本。

目前我們已經(jīng)優(yōu)化合成SaSS基因及體外功能驗(yàn)證，克隆到MVA途徑關(guān)鍵的ERG20和MVA基因，構(gòu)建了δ位點(diǎn)切割的CRISPR-Cas9系統(tǒng)及表達(dá)元件，為后續(xù)研究奠定了一定基礎(chǔ)。相信隨著量子生物學(xué)、功能基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝工程技術(shù)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)和組合合成生物學(xué)技術(shù)等多學(xué)科的發(fā)展和交融，越來越多重要萜類化合物會(huì)實(shí)現(xiàn)在微生物宿主中的高產(chǎn)并達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，開創(chuàng)微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)萜類化合物的綠色可持續(xù)發(fā)展的新型工業(yè)。

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