單倍型分析技術(shù)研究進(jìn)展

李雙雙，張迎新，范成明，陳宇紅，鄧傳良，胡贊民

1 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007

2 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101

3 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

單倍型 (Haplotype) 是重要的遺傳學(xué)概念，是指共存于單條染色體上的一系列遺傳變異位點(diǎn)的組合。每一條染色體都有自己獨(dú)特的單倍型，在減數(shù)分裂過程中，同源染色體非姐妹染色單體之間的重組可以產(chǎn)生新的單倍型[1]。單倍型包含了一套完整的遺傳信息，是描述個(gè)體基因組的基礎(chǔ)，也是基因組研究必不可少的一個(gè)重要方面[2-5]。同源染色體，一個(gè)來自母本，一個(gè)來自于父本。同源染色體之間不同遺傳位點(diǎn)的組合對(duì)生物表型有重要影響，如植物中的雜種優(yōu)勢、人類的遺傳病等。雖然高通量測序技術(shù)、高密度SNP芯片、全基因組測序和基因組外顯子測序等全基因組基因型分析技術(shù)能在全基因組水平上獲得較好的基因組信息，卻無法區(qū)分同源染色體等位基因的差異，忽略了等位基因間差異對(duì)基因表達(dá)、功能及其表型的影響[6]。而單倍型可以區(qū)分不同親本染色體的遺傳信息，深入了解單條染色體或特定單染色體區(qū)域不同遺傳位點(diǎn)的組合及遺傳，有助于雜種優(yōu)勢的探索及遺傳疾病的發(fā)病機(jī)理的理解和診斷[7]。

單倍型技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域包括：在醫(yī)學(xué)上探索致病機(jī)理，挖掘致病基因，尋找疾病治療新方法[8-10]；在群體遺傳學(xué)上分析等位基因間差異[2,11-12]，追蹤個(gè)體親緣關(guān)系[13]，了解生物遷徙模式和進(jìn)化歷史[14-16]；在農(nóng)業(yè)上發(fā)掘優(yōu)異等位基因變異，探索雜種優(yōu)勢理論等[17-18]。因此，單倍型的研究具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

本文簡要介紹了單倍型分析技術(shù)的進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了幾個(gè)重要技術(shù)的原理和應(yīng)用，對(duì)單倍型分析的應(yīng)用前景、存在的問題和未來發(fā)展進(jìn)行了討論。

1 單倍型分析技術(shù)研究進(jìn)展

單倍型分析技術(shù)主要分為兩大類型，間接推斷法和直接實(shí)驗(yàn)法。間接推斷法是借助計(jì)算機(jī)通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，從參考基因組中推斷出樣本單倍型[6]。隨著新一代測序技術(shù)的快速發(fā)展，人們可以比較容易獲得大量的基因組信息，這是間接推斷法的基礎(chǔ)。直接實(shí)驗(yàn)法是指用單分子稀釋、染色體微切割和流式分離法等特殊實(shí)驗(yàn)方法在一段有限的染色體區(qū)域或單染色體獲得精確的單倍型信息[3]。表1為重要單倍型分析技術(shù)的比較。

1.1 間接推斷法

間接推斷法根據(jù)研究對(duì)象的不同又可分為兩類：群體推斷法[19-20]和家族推斷法[21-22]。群體推斷法是通過構(gòu)建一些關(guān)聯(lián)群體的基因池并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行分析推斷樣本的單倍型。如果群體中存在一些突變頻率較低的個(gè)體，它受連鎖不平衡程度的影響往往會(huì)被遺漏而無法獲得其單倍型信息[23]。家族推斷法是根據(jù)同一家族眾多個(gè)體的基因型信息對(duì)待測樣本進(jìn)行推斷獲得其單倍型信息，在使用前要確保同一家族中這些樣本基因型信息的可靠性。家族推斷法在遺傳疾病的研究中有非常重要的作用[24-25]。研究者對(duì)一個(gè)家庭的父母及其子女四口人進(jìn)行全基因組測序，經(jīng)過序列分析可以得知子代基因組精確的重組位點(diǎn)和一些稀有的單核苷酸變異位點(diǎn)。更重要的是，發(fā)現(xiàn)該家庭兩子女含有米勒綜合癥和原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙性疾病兩個(gè)隱性致病基因，對(duì)尋找致病基因和疾病治療方法有重要作用[21]。

表1 重要單倍型分析技術(shù)方法比較Table 1 The comparison of mainly haplotype analysis techniques

經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道，單倍型推斷的方法也多種多樣，相繼出現(xiàn)了 Clark法[26]、最大期望 (Expectation-Maximization，EM) 算法[33]、相位 (Phase) 法[34]和快速相位 (fastPhase) 法[35]等推斷手段[36]，其中前3種技術(shù)是目前大家普遍使用的推斷方法。Clark法是最先產(chǎn)生的單倍型推斷技術(shù)，根據(jù)純合或雜合的基因型確定已知的單倍型，然后用這些已知的單倍型去和其他雜合待測樣本基因型比對(duì)，如果該雜合個(gè)體的單倍型中有一條和已知的單倍型相同，則相應(yīng)的另一條單倍型為新的單倍型，循環(huán)往復(fù)以至找不到新的單倍型為止。最大期望法是把樣本各種可能的單倍型都羅列出來并給出一個(gè)假定的出現(xiàn)概率，然后通過一步步檢測最終確定出待測樣本的單倍型。相位法是根據(jù)參考樣本基因型信息對(duì)任意個(gè)體通過吉布斯抽樣法(Gibbs) 逐步獲得雜合樣本的單倍型?？傮w來講這3種算法中相位算法準(zhǔn)確性最好，Clark算法其次，最大期望法居中。然而，它們雖然簡便，但根據(jù)算法的不同，錯(cuò)誤率高達(dá)19%-48%[37]。也并不是所有樣本的單倍型都能用推斷法獲得，一些特殊的樣本并不適用于這種方法[38]。例如，雜合樣本單染色體 SNPs差異的研究和同源染色體之間等位基因的差異分析等[11,28]。

1.2 直接實(shí)驗(yàn)法

根據(jù)樣本自身的特性，直接實(shí)驗(yàn)法又可分為兩大類：稠密位點(diǎn)單倍型 (Dense) 法[39-42]和稀疏位點(diǎn)單倍型 (Sparse) 法[43-45]。稠密位點(diǎn)單倍型法能精確檢測到單染色體局部區(qū)域的單倍型，組裝結(jié)果更完整，在染色體上的排布較密集，是目前最為常用的方法。然而，對(duì)于同一染色體上距離較遠(yuǎn)的單倍型就無法獲得。而稀疏位點(diǎn)單倍型法能獲得單染色體上幾乎所有區(qū)域的單倍型信息，但是位點(diǎn)在染色體上的排布比較稀疏，有時(shí)不能準(zhǔn)確定位該樣本單倍型在染色體上的物理位置，甚至?xí)z漏一些位點(diǎn)[3]。

1.2.1 稠密位點(diǎn)單倍型法

大量文獻(xiàn)報(bào)道，稠密位點(diǎn)單倍型法能獲得染色體上97%的單倍型信息，結(jié)果也更精確，應(yīng)用最普遍。它主要包括單分子稀釋法 (Single-molecule dilution)[46-48]、長片段插入克隆法 (Long-insert cloning)[49-50]、保留鄰近性轉(zhuǎn)座酶測序法(Contiguity-preserving transposition sequencing，CPT-seq)[51-52]、目標(biāo)位點(diǎn)擴(kuò)增 (Targeted locus amplification，TLA)[53]等。這些方法都需要先將樣本基因組DNA片段化，再用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測高分子量 (High-molecular-weight，HMW) 的DNA片段，最后運(yùn)用不同的單倍型測序方法獲得樣本的單倍型信息。以下具體介紹一下單分子稀釋法和保留鄰近性的轉(zhuǎn)座酶測序法這兩種最常用的方法。單分子稀釋法是把 HMW DNA隨機(jī)稀釋到 96孔板中組成許多單倍型亞池并對(duì)每個(gè)單倍型分子用多重置換擴(kuò)增法 (Multiple displacement amplification，MDA) 擴(kuò)增，再在所有擴(kuò)增片段兩端加上測序識(shí)別標(biāo)簽并進(jìn)行高通量測序，最后把測序結(jié)果按照識(shí)別標(biāo)簽序列進(jìn)行分選并根據(jù)參考基因組序列進(jìn)行拼接組裝，得到樣本的單倍型序列。它需要借助計(jì)算機(jī)把小的DNA片段組裝成較長的單倍型序列[48]。MDA法是Lizardi等于 2004年創(chuàng)建的一種基于環(huán)狀滾動(dòng)擴(kuò)增的鏈置換全基因組擴(kuò)增技術(shù)[54]。該技術(shù)利用φ29DNA聚合酶的強(qiáng)鏈置換活性和核酸外切酶活性，以短鏈寡核苷酸為引物，可對(duì)微量 DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，并獲得濃度達(dá)μg級(jí)的高質(zhì)量DNA產(chǎn)物。MDA法不僅擴(kuò)增效率高于傳統(tǒng)的兼并引物擴(kuò)增法，而且得到的DNA產(chǎn)物片段在kb級(jí)，長度也相對(duì)均一，能夠滿足高通量測序的要求。

單分子稀釋法由Paul和Apgar教授首次成功運(yùn)用于人類白細(xì)胞抗原位點(diǎn)的研究，對(duì)人類疾病的研究具有十分重要的意義，開創(chuàng)了單分子稀釋法單倍型測序的先河[28]。2013年，Kaper等用該方法對(duì)兩名杜氏肌萎縮癥患者進(jìn)行單倍型測序，找到了95%的SNP雜合位點(diǎn)[38]。2014年，Kuleshov教授等用統(tǒng)計(jì)學(xué)輔助的長序列單倍型測序技術(shù)(Statistically aided long read haplotyping，SLRH)對(duì)人類全基因組進(jìn)行單倍型測序，發(fā)現(xiàn)了99%的SNP雜合位點(diǎn)，對(duì)我們尋找人類基因組上未知的甲基化區(qū)域和其甲基化模式有潛在的應(yīng)用前景，同時(shí)對(duì)一些差異基因表達(dá)機(jī)制的研究也有重要作用[55]。然而，該方法也存在一些缺點(diǎn)，如工作量較大，每個(gè)亞池稀釋到相同的濃度難度很大，具有微弱的擴(kuò)增偏向性[3]。

保留鄰近性的轉(zhuǎn)座酶測序法是利用 Tn5轉(zhuǎn)座酶緊密結(jié)合在HMW DNA片段上的特性使短DNA 片段和接頭序列緊密結(jié)合。首先將帶有接頭和Tn5轉(zhuǎn)座酶的DNA片段隨機(jī)分配到96孔板中組成許多單倍型亞池，每個(gè)亞池大約含有5%-10%的DNA，然后通過蛋白變性去除Tn5轉(zhuǎn)座酶并通過PCR擴(kuò)增引入新的標(biāo)簽序列，再將它們混合起來重新分配到96孔板中，這樣就隨機(jī)生成了超過9 200個(gè)虛擬隔室，每一個(gè)亞池都代表著不同的亞單倍型并進(jìn)行高通量測序，測序結(jié)果按照識(shí)別標(biāo)簽序列進(jìn)行分選并根據(jù)參考基因組序列進(jìn)行拼接組裝，得到樣本的單倍型序列。該方法的先進(jìn)性主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：第一，它能通過Tn5轉(zhuǎn)座酶把特異的接頭和標(biāo)簽序列同時(shí)結(jié)合在長鏈DNA上，使DNA片段不被打亂并保留其鄰近序列；第二，它通過轉(zhuǎn)錄和PCR兩種方法相結(jié)合能將很長的單倍型片段分成上千個(gè)虛擬隔室，從而使測序結(jié)果更精確[29]。此外，該方法能將極短的 DNA片段連接起來并保留其鄰近序列，所得樣本DNA片段均一性較好，克服了MDA擴(kuò)增法引起的偏向性。2014年，Amini等首次在Nature Genetics雜志上提出了該方法，他們運(yùn)用該方法成功獲得了人類個(gè)體全基因組單倍型序列，由此開發(fā)了一種快速穩(wěn)定高效且操作簡便的單倍型測序新技術(shù)，為單倍型測序的發(fā)展開創(chuàng)了更廣闊的空間[29]。隨后，Adey教授等在該方法的基礎(chǔ)上又結(jié)合fragScaff程序把目的序列組裝成了更長的片段，N50增加了8–57倍。它能識(shí)別并錨定一些新的片段，同時(shí)又能剔除一些拼接錯(cuò)誤的片段，大大提高了測序的精確度[32]。然而該方法也存在一些弊端，如需要的 DNA量比長片段插入克隆法要多，單倍型組裝比較困難?？偠灾Ａ羿徑缘霓D(zhuǎn)座酶測序法以其快速、穩(wěn)定、節(jié)約成本的特點(diǎn)深受科學(xué)家們的青睞，在未來人類基因組測序和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有廣泛的發(fā)展空間。

1.2.2 稀疏位點(diǎn)單倍型法

稀疏位點(diǎn)單倍型法主要包括單染色體測序法(Single chromosome sequencing)[2,56]、單倍型測序法 (HaploSeq)[57]、乳液PCR法 (Emulsion PCR-based methods)[58-59]等。其中單染色體測序是最常見的方法。它是通過單染色體微切割、流式細(xì)胞儀分選和微流體分選這3種技術(shù)獲得樣本單染色體，然后用 MDA法進(jìn)行全基因組擴(kuò)增再測序，拼接和組裝就可得到樣本的單倍型信息。它的應(yīng)用也十分廣泛。2010年，Li等用單染色體微切割技術(shù)分離人單染色體并進(jìn)行長片段單倍型測序獲得了20 000多個(gè)雜合位點(diǎn)的單倍型，其準(zhǔn)確性高達(dá)98.85%，對(duì)檢測單染色體SNP變異位點(diǎn)有重要作用[30]；同年，F(xiàn)an等報(bào)道了一種新的單染色體分離技術(shù)，對(duì)人單細(xì)胞進(jìn)行微流體分選獲得單染色體，然后進(jìn)行單染色體單倍型測序獲得其單倍型信息，對(duì)檢測單染色體上SNP差異位點(diǎn)和基因重排有重要作用[2]；2011年，Yang等發(fā)表了另一種高效的單染色體分離技術(shù)，對(duì)人用單染色體流式分離技術(shù)獲得其單染色體，然后用 MDA法進(jìn)行全基因組擴(kuò)增再測序，拼接和組裝得到了幾乎完整的單倍型信息，對(duì)人類疾病的研究提供理論依據(jù)[56]?？偠灾∈栉稽c(diǎn)單倍型法能獲得單染色體上幾乎全部區(qū)域的單倍型信息，是一種較為常用的單倍型獲取方法。

1.3 單倍型組裝

無論是直接法還是間接法，都涉及到單倍型組裝。然而目前常規(guī)的單倍型測序技術(shù)所得的序列長度較短，不能滿足連鎖的SNP變異位點(diǎn)樣本的單倍型研究，單倍型組裝一直是一個(gè)難點(diǎn)[60]。圖1為個(gè)體單倍型組裝基本流程[61]。通常個(gè)體基因組測序所得的信息是來自于兩親本的，如果對(duì)同一SNP位點(diǎn)不同序列分析發(fā)現(xiàn)其等位基因信息不同，則它們是來自不同親本的染色體；反之，它們是來自相同親本的染色體。就這樣依次把所有的SNP位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，拼接組裝相互關(guān)聯(lián)起來就構(gòu)建成了個(gè)體單倍型。隨后，Bansal等提出了馬爾可夫鏈蒙特卡爾 (Markov chain Monte Carlo，MCMC) 單倍型組裝技術(shù)。該方法就是把樣本的單條或多條序列信息轉(zhuǎn)變?yōu)榧訖?quán)圖，然后用計(jì)算機(jī)計(jì)算最小和最大切點(diǎn)進(jìn)行組裝，精確性提高20%-25%[61]。同年，Bansal等又推出了一種新的單倍型組裝技術(shù)：超圖分割法 (Hypergraph approximation-Cut，HapCUT)。與馬爾可夫鏈蒙特卡爾方法相比，HapCUT單倍型組裝技術(shù)算法高效、更精確[62]。盡管該方法可以獲得精確組裝，但受序列長度的限制，對(duì)于一些較長的序列可能無法完全拼接和組裝，就不能獲得完整的單倍型信息。隨后又出現(xiàn)一種基于Hi-C交互信息組裝單倍型法，能解決傳統(tǒng)方法不能越過著絲粒組裝的問題，從而獲得更好更完整的單倍型信息[63]。2017年，Edge等在 HapCUT基礎(chǔ)上又提出了HapCUT2單倍型組裝技術(shù)。HapCUT2能對(duì)各種不同類型的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，與HapCUT相比顯著降低了組裝的錯(cuò)誤率，提高了序列組裝的精確性，是目前單倍型組裝效率最高的新技術(shù)[64]。

圖1 單倍型組裝流程圖[61]Fig. 1 Flow chart of haplotype assemble[61].

2 展望及應(yīng)用前景

目前，單倍型分析技術(shù)已成為基因組研究領(lǐng)域必不可少的一種重要的研究方法。隨著技術(shù)的發(fā)展，單倍型分析技術(shù)也在逐步完善，具有廣闊的應(yīng)用前景。然而每種單倍型分析技術(shù)所需的樣本類型、物理距離、精確度和實(shí)施難易程度等方面都不一樣，如間接推斷法雖然操作簡單，無需進(jìn)行繁瑣的實(shí)驗(yàn)，便宜又節(jié)省時(shí)間，但是準(zhǔn)確性較低，錯(cuò)誤率有時(shí)高達(dá)19%-48%；而直接實(shí)驗(yàn)法雖然準(zhǔn)確性較高，但是過程較繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期較長、費(fèi)用較高。因此，我們?cè)谑褂脮r(shí)要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要對(duì)各方面綜合考慮，選取最合適的單倍型測序方法。隨著長片段測序技術(shù)的逐漸成熟以及樣品擴(kuò)增方法的提高，我們預(yù)測間接單倍型分析法與直接實(shí)驗(yàn)法相結(jié)合的技術(shù)具有很大的發(fā)展空間，既能節(jié)約時(shí)間又能提高準(zhǔn)確性，在未來幾年可能被廣泛使用[3]。

如今，單倍型分析技術(shù)有廣泛的應(yīng)用前景。第一，單倍型技術(shù)在人類群體遺傳學(xué)的研究方面有重要應(yīng)用。我們通過低精確度的單倍型計(jì)算方法就可以獲得一些群體特異的單倍型信息，促進(jìn)人類遺傳進(jìn)化的研究[19]。Schiffels教授對(duì)來自不同地區(qū)9個(gè)人群的基因組進(jìn)行單倍型測序，最終發(fā)現(xiàn)南非人群祖先早在5萬年前就與非洲約魯巴人群發(fā)生分離。同時(shí)，他們也獲得了2 000年前美洲、非洲、東亞和歐洲人類之間的進(jìn)化關(guān)系[65]。Martin等用單倍型技術(shù)對(duì)來自不同國家人群的潛在致病等位基因進(jìn)行研究并發(fā)現(xiàn)這些致病基因的攜帶者大部分都是芬蘭人，而且它們的基因流動(dòng)性很大。該研究對(duì)單倍型法研究群體進(jìn)化歷史和疾病的研究具有很好參考價(jià)值[20]。

第二，單倍型分析技術(shù)在植物學(xué)領(lǐng)域也有應(yīng)用，尤其是在水稻[17,66]、玉米[67]和小麥[68]等主要農(nóng)作物的遺傳育種方面有非常重要的作用。楊教授等將高產(chǎn)與普通水稻品種單倍型比較分析發(fā)現(xiàn)兩者差異較大，高產(chǎn)品種單倍型富含亮氨酸的重復(fù)受體激酶基因簇，通過對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能分析表明該基因簇對(duì)優(yōu)良品種的選育有重要作用。同時(shí)，高教授等對(duì)不同玉米誘導(dǎo)系品種雜交產(chǎn)生不同基因型的單倍體玉米植株，獲得高效誘導(dǎo)玉米單倍體的方法，該方法是目前獲得玉米單倍體最為常用的方法[69]。Pozniak教授通過對(duì)控制硬粒小麥和普通小麥主干強(qiáng)度的基因進(jìn)行單倍型分析并精確定位，對(duì)小麥育種有重要作用[68]。此外，單倍型分析技術(shù)在大豆[18]、苦瓜[70]等植物中也有類似的應(yīng)用。

第三，單倍型技術(shù)還可用于生物理論及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究，探索一些生命現(xiàn)象的本質(zhì)，從生物學(xué)角度解釋這些現(xiàn)象并尋找疾病治療方法。研究者用單倍型技術(shù)分析皮膚起痘[71]、腦癱[72]和耳聾[73]等患者的致病根源，最終發(fā)現(xiàn)其都是一種由染色體上雜合變異引起的常染色體隱性遺傳疾病[74]。用同樣方法，研究者發(fā)現(xiàn)由于患者染色體上大量SNPs的交互作用而引起的孟德爾隱性遺傳疾病。單倍型技術(shù)還可以探索表觀遺傳與基因調(diào)控的相互關(guān)系。覃海媚等對(duì)鼻咽癌患者和健康人群RTN4基因進(jìn)行測序和單倍型分析找到了兩個(gè)致病的核苷酸變異位點(diǎn)，為鼻咽癌的治療提供理論依據(jù)[9]。另外胎兒的單倍型基因組測序檢測可用于檢測其是否存在潛在的遺傳疾病。Kitzman教授等用單倍型測序技術(shù)對(duì)親本血漿 DNA深度測序從而獲得胎兒單倍型基因組序列，準(zhǔn)確率高達(dá)99%[75]。

最后，單倍型分析技術(shù)有助于完成基因組的精細(xì)組裝，在基因組學(xué)領(lǐng)域有突出作用。例如，對(duì)于一些基因組組裝不完全的植物或動(dòng)物，用單倍型分析技術(shù)可以準(zhǔn)確預(yù)測它們的基因組，彌補(bǔ)目前一些領(lǐng)域基因組信息的空缺，對(duì)未來基因組學(xué)的發(fā)展有促進(jìn)作用[76-77]。隨著大規(guī)模測序技術(shù)的不斷發(fā)展，單倍型分析技術(shù)已取得長足的進(jìn)步，然而現(xiàn)有技術(shù)也存在一些問題，它們?cè)诰_度、物理距離以及實(shí)現(xiàn)的難易程度等方面并非完全一致，都有局限性。而且仍有很多工作要做，尤其需要探討的是在重組標(biāo)記、系譜更大更復(fù)雜、標(biāo)記更多的情況下，如何快速、準(zhǔn)確地推斷單倍型。更重要的是，目前為止植物領(lǐng)域有關(guān)單倍型的研究及應(yīng)用還很少。單倍型技術(shù)對(duì)挖掘植物優(yōu)異等位基因、研究雜種優(yōu)勢理論至關(guān)重要，希望未來在這方面能有所突破。

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