5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)小鼠化療性腸黏膜炎模型的建立

譚婉賢，熊晏，賴?yán)蛎?，顏霞，陳超，瞿禮萍*，鄒文俊*

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都　611137； 2. 地奧集團(tuán)成都藥業(yè)股份有限公司，成都　610000)

化療性腸黏膜炎(chemotherapy-induced intestinal mucositis，CIM)是腫瘤患者化療時常見的劑量限制性不良反應(yīng)。歐洲腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)會(European Society for Medical Oncology，ESMO)將其定義為由腫瘤治療引起的腸道炎性病變，其病理特征為腸絨毛萎縮、隱窩破壞及炎性細(xì)胞浸潤，臨床癥狀主要表現(xiàn)為厭食、惡心、嘔吐、腹瀉和腹痛等[1]。CIM不僅直接影響化療效果，而且降低腫瘤患者的生存質(zhì)量。目前CIM發(fā)病機(jī)制尚不明確，且缺乏有效的臨床治療藥物。合適的動物模型對疾病研究和藥物篩選尤為重要。目前已有多篇化療誘導(dǎo)動物腸黏膜炎模型的研究報(bào)道[2]，其中，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)誘導(dǎo)建立小鼠腸黏膜炎模型方法簡便快速，且基本符合患者化療后胃腸黏膜炎的病理特點(diǎn)，為CIM研究常用動物模型。進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，5-FU誘導(dǎo)小鼠腸黏膜炎模型的造模方法主要涉及單次或連續(xù)腹腔注射，但其給藥劑量差異較大，其中，單次給藥劑量范圍為100～450 mg/kg[3-6]；連續(xù)給藥劑量范圍為30～150 mg/kg[7-11]。因此，為進(jìn)一步研究化療性腸黏膜炎動物模型，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M了5-FU在臨床應(yīng)用中單次大劑量及分次維持劑量的給藥方法[12-14]，觀察不同劑量5-FU單次或連續(xù)5 d腹腔注射對小鼠腸黏膜損傷的影響?？紤]文獻(xiàn)報(bào)道連續(xù)給藥周期多為5 d，因此本實(shí)驗(yàn)以5 d作為連續(xù)給藥的周期。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物

SPF級ICR小鼠96只，雄性，體重23～26 g，購買于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司【SCXK (川) 2015-030】。飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院動物觀察室【SYXK(川)2014-124】。動物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度 (25±1)℃，相對濕度 (60±5)%，12 h/12 h 明暗周期交替，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2試劑與儀器

5-FU(美國Sigma公司，批號WXBC2 167 V)；4%多聚甲醛固定液(北京Biosharp公司，批號1704464)；血細(xì)胞分析用溶血劑(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司，批號17060582)；血細(xì)胞分析用稀釋液(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司，批號17070830)等。

Sorvall ST-16R離心機(jī)(美國Thermo公司)；BS323S 電子天平(德國Sartorius公司)；全自動血液分析儀(日本光電公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon 公司)等。

1.2　方法

1.2.1造模方法

(1)動物分組

96只雄性ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按體重隨機(jī)分為8組，包括單次給藥造模和連續(xù)給藥造模實(shí)驗(yàn)各4組，每組12只。單次給藥造模實(shí)驗(yàn)分為正常組、5-FU 100 mg/kg組、5-FU 200 mg/kg組和5-FU 400 mg/kg組。連續(xù)給藥造模實(shí)驗(yàn)分為正常組、5-FU 30 mg/kg組、5-FU 50 mg/kg組和5-FU 100 mg/kg組。

(2)模型制作

單次給藥造模各組小鼠分別單次腹腔注射5-FU 100、200和400 mg/kg。連續(xù)給藥造模各組小鼠分別腹腔注射5-FU 30、50和100 mg/kg，連續(xù)5 d。正常組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，給藥體積為20 mL/kg。

1.2.2觀察指標(biāo)

(1)一般狀態(tài)觀察

5-FU給藥第1天起，每天觀察小鼠的體重、飲食、毛色、活動、精神狀態(tài)及死亡等情況。

(2)小鼠腹瀉情況

5-FU給藥第1天起，每天觀察小鼠腹瀉情況，并參考Akinobu Kurita[15]報(bào)道方法進(jìn)行評分：0 分，大便正?；驔]有；1 分，輕度腹瀉，大便可見輕微濕軟； 2 分，中度腹瀉，大便較濕且不成形并伴有輕度肛周污跡；3 分，重度腹瀉，水樣便并伴有重度肛周污跡。

(3)小鼠外周血象

單次給藥造模和連續(xù)給藥造模各組小鼠分別于末次給藥后72 h 和24 h，小鼠眼底靜脈叢取血20 μL，加入預(yù)裝2 mL稀釋液的EP管中，混勻，使用血細(xì)胞分析儀檢測各組小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板等血常規(guī)指標(biāo)。

(4)組織病理學(xué)觀察

單次給藥造模和連續(xù)給藥造模各組小鼠分別于末次給藥后72 h和24 h，各處死4只小鼠，剖開腹腔，取距回腸末端3 cm處的回腸2 cm，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片(4 μm)、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小腸組織結(jié)構(gòu)的病理變化。

1.3　統(tǒng)計(jì)方法

2　結(jié)果

2.1　一般狀態(tài)、體重和腹瀉觀察

正常組小鼠反應(yīng)靈敏、毛發(fā)光澤，飲食及活動均正常。單次或連續(xù)給予不同劑量5-FU后，小鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉、體重降低、進(jìn)食減少、毛發(fā)枯槁、精神萎靡及活動減少。單次給予5-FU，100、200 mg/kg組無動物死亡，400 mg/kg組小鼠死亡率為63%；連續(xù)給予5-FU 5 d后，30 mg/kg組無動物死亡，50、100 mg/kg組動物死亡率分別為38% 和100%。

體重方面，單次或連續(xù)給予5-FU后，與正常組比較，各劑量組小鼠體重在第2或3天出現(xiàn)明顯降低(P< 0.05或P< 0.01)，其中，單次給予5-FU，400、200 mg/kg組小鼠體重分別在給藥后第12或14天仍明顯低于正常組(P< 0.05或P< 0.01)；連續(xù)給予5-FU 5 d后，50 mg/kg組小鼠在給藥后第16天仍有顯著差異(P< 0.01)，100 mg/kg組小鼠體重一直持續(xù)下降，直至動物死亡。見圖1。

腹瀉方面，與正常組比較，單次給予5-FU后，100 mg/kg組未出現(xiàn)明顯腹瀉癥狀，200、400 mg/kg組小鼠在給藥后第3天出現(xiàn)明顯腹瀉(P< 0.05)，其中，400 mg/kg組腹瀉維持時間較長；連續(xù)給予5-FU 5 d，各劑量組小鼠在給藥第3或4天出現(xiàn)明顯腹瀉(P< 0.05)，50 mg/kg組腹瀉評分在給藥后第13天仍有顯著差異(P< 0.05)，100 mg/kg組小鼠腹瀉一直持續(xù)加重，直至動物死亡。見圖2。

注：A. 5-FU單次給藥對小鼠體重的影響；B. 5-FU連續(xù)給藥對小鼠體重影響。 與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖1　5-FU單次及連續(xù)給藥對小鼠體重的影響Note. A. Single administration of 5-FU. B. Continuous administration of 5-FU. Compared with the control group, *P<0.05; **P<0.01.Fig.1　Effect of single and continuous administration of 5-FU on the body weight of mice n=8)

注：A. 5-FU單次給藥對小鼠腹瀉評分的影響；B. 5-FU連續(xù)給藥對小鼠腹瀉評分的影響。與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2　5-FU單次及連續(xù)給藥對小鼠腹瀉評分的影響Note. A. Single administration of 5-FU. B. Continuous administration of 5-FU. Compared with the control group, *P< 0.05;**P< 0.01.Fig.2　Effect of single and continuous administration of 5-FU on scores of diarrhoea in the mice n=8)

2.2　不同劑量5-FU單次及連續(xù)給藥對小鼠外周血象的影響

結(jié)果見表1和表2。與正常組比較，單次給予5-FU，各劑量組小鼠白細(xì)胞和血小板水平均顯著降低(P< 0.05或P< 0.01)，紅細(xì)胞和血紅蛋白水平無明顯變化；連續(xù)給予5-FU 5 d，各劑量組小鼠血小板均明顯降低(P< 0.01)，50、100 mg/kg組小鼠白細(xì)胞顯著降低(P< 0.05或P< 0.01)，100 mg/kg組小鼠紅細(xì)胞和血紅蛋白水平出現(xiàn)明顯升高(P< 0.01)。

表1　5-FU單次給藥對小鼠外周血象的影響Tab.1　Effect of single administration of 5-FU on peripheral blood of the mice n=8)

注：與正常組比較，*P< 0.05;**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05;**P< 0.01.

表2　5-FU連續(xù)給藥對小鼠外周血象的影響Tab.2　Effect of continual administration of 5-FU on peripheral blood of the mice n=8)

注: 與正常組比較，*P< 0.05,**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：A. 正常組；B. 5-FU 100 mg/kg組；C. 5-FU 200 mg/kg組；D.5-FU 400 mg/kg組。圖3　5-FU單次給藥對小鼠小腸組織形態(tài)病理改變的影響(HE, ×200)Note. A. Control group. B. 5-FU 100 mg/kg group. C. 5-FU 200 mg/kg group. D. 5-FU 200 mg/kg group.Fig.3　Effect of single administration of 5-FU on pathological changes in the small intestinal tissues of the mice(HE, ×200)

2.3　不同劑量5-FU單次及連續(xù)給藥對小鼠小腸組織形態(tài)病理改變的影響

正常組小鼠腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，腺體形態(tài)完好，絨毛上皮細(xì)胞排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤。單次給予5-FU后，100 mg/kg組小鼠腸絨毛上皮細(xì)胞部分脫落；200 mg/kg組可見脫落的絨毛上皮細(xì)胞，腸腺結(jié)構(gòu)消失，少量炎性細(xì)胞浸潤；400 mg/kg組腸絨毛縮短、萎縮，腸腺結(jié)構(gòu)消失，結(jié)締組織增生，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。連續(xù)給予5-FU 5 d，30 mg/kg組腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞，隱窩細(xì)胞數(shù)量減少，伴有少量炎性細(xì)胞浸潤；50 mg/kg組腸絨毛上皮細(xì)胞脫落，隱窩結(jié)構(gòu)破壞，可見炎性細(xì)胞浸潤；100 mg/kg組大量腸絨毛及隱窩結(jié)構(gòu)消失，結(jié)締組織增生，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)果見圖3和圖4。

注：A. 正常組；B.5-FU 30 mg/kg組；C. 5-FU 50 mg/kg組；D. 5-FU 100 mg/kg組?！　D4　5-FU連續(xù)給藥對小鼠小腸組織形態(tài)病理改變的影響(HE, ×200)　　Note. A. Control group. B. 5-FU 30 mg/kg group. C. 5-FU 50 mg/kg group. D. 5-FU 100 mg/kg group.Fig.4　Effect of continual administration of 5-FU on pathological changes in the small intestinal tissues of the mice(HE, ×200)

3　討論

5- FU是臨床常用抗消化道腫瘤藥物，約80%患者在接受治療后出現(xiàn)腸黏膜炎[16]，是復(fù)制化療性腸黏膜炎的常見造模藥物。本研究前期文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)5-FU誘導(dǎo)小鼠腸黏膜炎模型的給藥劑量差異較大，因此本實(shí)驗(yàn)采用不同劑量的5-FU單次或連續(xù)5 d腹腔注射給予小鼠，并通過觀察小鼠體重、腹瀉、外周血象及病理組織形態(tài)改變等指標(biāo)進(jìn)行綜合評價。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單次或連續(xù)5 d給予不同劑量的5-FU，小鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉及體重下降。單次給予5-FU，100、200 mg/kg組小鼠腹瀉評分偏低，病理損傷較輕，未見或少見炎性細(xì)胞浸潤；400 mg/kg組小鼠出現(xiàn)明顯腹瀉，腸絨毛脫落，隱窩消失，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，符合腸黏膜炎病理特征。連續(xù)給予5-FU 5 d，30 mg/kg組小鼠未出現(xiàn)明顯腹瀉，病理損傷較輕，少見炎性細(xì)胞浸潤；50 mg/kg組小鼠腸絨毛上皮細(xì)胞脫落，隱窩結(jié)構(gòu)破壞，可見炎性細(xì)胞浸潤，且腹瀉維持時間較長；100 mg/kg組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，大量腸絨毛上皮細(xì)胞脫落，隱窩結(jié)構(gòu)消失，但由于劑量過大，動物死亡率高達(dá)100%。

此外，骨髓抑制也是化療常見的不良反應(yīng)之一，主要表現(xiàn)為白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞減少，嚴(yán)重時會引起血紅蛋白降低甚至全血細(xì)胞減少[17]。因而，本研究對外周血象也進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示，單次給藥各劑量組和連續(xù)給藥30、50 mg/kg組小鼠白細(xì)胞和血小板水平均明顯降低，紅細(xì)胞和血紅蛋白無明顯變化，連續(xù)給藥100 mg/kg組小鼠白細(xì)胞和血小板水平顯著降低，紅細(xì)胞和血紅蛋白水平卻明顯升高。血細(xì)胞中紅細(xì)胞平均壽命最長，血小板次之，白細(xì)胞最短，因而，當(dāng)骨髓造血功能受損后，白細(xì)胞及血小板首先受到影響，而對壽命較長的紅細(xì)胞影響相對滯后。本實(shí)驗(yàn)主要觀察到白細(xì)胞和血小板水平下降，推測可能與此有關(guān)。同時，本研究中連續(xù)給藥5-FU 100 mg/kg引起紅細(xì)胞升高，可能與白細(xì)胞和血小板急劇減少，造血干細(xì)胞更多分化為紅系祖細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞暫時升高有關(guān)，但還需進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，單次或連續(xù)5 d給予5-FU 誘導(dǎo)小鼠腸黏膜炎的作用呈劑量相關(guān)性，其中單次給藥以400 mg/kg為造模合適劑量，連續(xù)5 d給藥以50 mg/kg為造模合適劑量。