廣西產(chǎn)多花黃精不同炮制工藝研究

廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530000

黃精為合百科植物滇黃精(PoιygonatumkingianumCoLL.et HemsL.)、黃精(PolygonatumsibiricumRed.)或多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua.)的干燥根莖。黃精屬于藥食兩用中藥材，其化學(xué)成分主要為低聚糖、單糖和多糖，多種氨基酸、多種甾體皂苷和人體必需微量元素、生物堿等[1]。黃精歷代入藥生制兼用，但傳統(tǒng)以黃精生用“刺人咽喉”，故多炮制后入藥[2]。黃精炮制淵源已久，歷代以來黃精炮制方法有：九蒸九曝法、蔓荊子水蒸法、酒熬法、焙制法、黑豆煮法、酒蒸法、乳浸曬法、熟地制等[3]。目前對黃精的研究大多數(shù)為黃精及滇黃精，炮制方法為酒制法，而主產(chǎn)在廣西的多花黃精的研究還處于空白，據(jù)筆者調(diào)查，廣西民間百姓多用黑豆炮制法炮制生黃精，而黑豆制法也分為黑豆汁制、黑豆、蜜、酒制，黑豆、生姜、蜜制等。筆者主要研究廣西產(chǎn)多花黃精的酒制、黑豆制、清蒸、蔓荊子制、熟地制等不同炮制工藝，旨在為廣西產(chǎn)多花黃精炮制工藝提供理論參考，為今后黃精黑豆制法規(guī)范化研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-L5紫外可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)，KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DFT-200C萬能高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)，SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)。

1.2 材料 人參皂苷Rb1(批號：wkq16060402，四川省維克奇生物科技有限公司)，無水葡萄糖(批號wkq16082202，四川省維克奇生物科技有限公司)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的炮制與制備

2.1.1 生黃精 取黃精500 g，除去雜質(zhì)，洗凈，切厚片，曬干[4]。

2.1.2 九蒸九曝法制黃精 取黃精500 g，除去雜質(zhì)，洗凈。①拌黃酒：與適量(約10 %用量)黃酒與凈黃精拌勻，并悶潤至酒吸盡。②第1次蒸制、曬干：要求第1次“蒸至黃精中央發(fā)虛為度”(蒸制過程中注意收集黃精汁)，取出“曬至外皮微干”，然后將黃精拌入黃精汁和適量黃酒，并“悶潤至輔料吸盡”。③反復(fù)蒸制、曬干：按第1次蒸制、曬干方法；再蒸，曬至外皮微干，再拌入黃精汁，適量黃精，如此反復(fù)，蒸制曬8次。第2次至第8次制需要使用黃酒的70 %用量。④第9次蒸制、曬干：最后將剩余(20 %用量)黃酒及黃精汁一起拌入，“蒸至外表棕黑色，有光澤，中心深褐色，質(zhì)柔軟，味甜為度”；最后曬至八成干，然后切成片狀[5-6]。

2.1.3 黑豆制黃精 取黃精500 g，除去雜質(zhì)，洗凈，加米泔水泡透心，淘凈，取黑豆100 g熬取濃汁，與黃精共入鍋中，加水與藥平；煮沸后，用微火煮至微干，取出，篩去黑豆，曬至半干，又入蒸鍋蒸至上氣，取出日曬夜露，隔天又蒸至上氣，再曬再露，每次蒸前，加入前次的蒸出液于盛裝器皿中與黃精一起蒸，反復(fù)5次，曬干[7]。

2.1.4 黑豆、蜜、酒制黃精 取黃精500 g，除去雜質(zhì)，洗凈，浸泡2 d，每日換水1次，取出。取黑豆50 g水煮，取汁，與黃精合煎12 h，取出，曬至半干，再加熟蜜25 g及白酒25 g，共兌化拌勻后，蒸24 h，蒸至黑色，無麻味，曬干，即可[7]。

2.1.5 黑豆、生姜、蜜制黃精 取黃精500 g，除去雜質(zhì)，洗凈，加水泡透后，再加水煮沸，去水，加生姜250 g，黑豆50 g煮2 h，曬半干，加蜂蜜75 g與水拌勻，蒸至黑亮為度，取出，曬干[7]。

2.1.6 熟地制黃精 取黃精500 g,除去雜質(zhì)，洗凈，切厚片，蒸至略帶黑色，曬半干，露一夜。如此反復(fù)3次，至第4次與熟地膏120 g拌勻，潤一夜，次日蒸至里面黑透，再曬、露一次，曬干[7]。

2.1.7 酒制黃精 取黃精500 g，除去雜質(zhì)，洗凈，加酒拌勻，置蒸籠內(nèi)，密閉，隔水加熱蒸至黑透，取出，稍晾，曬干[7]。

2.1.8 清蒸黃精 取黃精500 g，除去雜質(zhì)，洗凈，蒸6 h，曬八成干，加蒸出液浸潤，再蒸6 h，至內(nèi)心成黑色，曬半干，再加蒸出液拌勻，曬至六成干，在悶潤均勻。蒸格上墊編織袋，蒸一夜，悶一夜(12 h)，次日取出剖視，以內(nèi)外發(fā)黑為度，切片，曬干[7]。

2.1.9 蔓荊子制黃精 取黃精500 g，除去雜質(zhì)，洗凈，置適宜的容器內(nèi)，加入蔓荊子汁及適量水拌勻，浸潤過夜，置蒸制容器內(nèi)蒸24 h，取出，曬干[7]。

2.2 浸出物的含量測定 取粉碎過篩后的黃精樣品4 g，精密稱定，按2015版《中國藥典》四部附錄通則2201項(xiàng)下熱浸法[8]，用稀乙醇、蒸餾水作溶劑，測定醇溶性浸出物、水溶性浸出物，結(jié)果見表1。

表1 多花黃精不同炮制品糖類成分含量測定結(jié)果 (n=3)

注：括號內(nèi)為歸一化處理。

2.3 供試品溶液的制備 取黃精樣品各200 g，60℃干燥至恒重，粉碎，過80目篩，備用。取黃精樣品粉末各1.00 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加80%乙醇100 mL，水浴回流提取1 h，趁熱過濾，濾渣用80 %乙醇洗3次，每次10 mL，取濾液，揮盡乙醇，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻后用于小分子總糖和還原糖含量測定[1]。將藥渣與濾紙置圓底燒瓶中，加蒸餾水100 mL，水浴加熱回流提取1 h，趁熱過濾，濾渣用水洗3次，將濾液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，用于總多糖的含量測定[1]。

2.4 還原糖的含量測定

2.4.1 葡萄糖對照溶液的制備 取經(jīng)105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品55.0 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得[1]。

2.4.2 DNS溶液的配制 取0.650 g 3,5-二硝基水楊酸，精密稱定，加水50 mL溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，加入32.5 mL的2 mol/mL的NaOH溶液，再加入4.5 g丙三醇，加水至刻度，搖勻，即得[9]。

2.4.3 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置10 mL具塞刻度試管中，各加水至4 mL，再各加入5 mL DNS溶液，搖勻后置沸水浴中加熱6 min，冰浴冷卻至室溫，加水至刻度，以空白管為對照，照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在540 nm處測定吸光度[9-10]。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸處理，得回歸方程：Y=0.0067X+0.0353(r=0.9997),表明無水葡萄糖對照品溶液在22～132 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，用于DNS法測定還原糖含量。

2.4.4 樣品的測定 精密量取“2.3”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液各1.0 mL稀釋到50 mL，精密量取4 mL，分別置10 mL具塞試管中，按照“2.4.3”項(xiàng)下方法自“再加入5 mL DNS溶液”起操作，測定吸光度，計(jì)算還原糖含量。結(jié)果見表2。

2.5 多糖、總糖的含量測定

2.5.1 苯酚溶液的制備 取2.5 g苯酚，精密稱定，加水溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中[10]。

2.5.2 多糖、總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取葡萄糖對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，然后分別精密量取上述稀釋后的葡萄糖對照品溶液各1 mL，置10 mL具塞試管中，加水至2mL，搖勻，再加1 mL的5%苯酚溶液和7 mL濃硫酸溶液，混勻，靜置5 min,水浴加熱20 min，并與冷卻至室溫，以空白管為對照，照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在490 nm處測定吸光度[9-10]。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸處理，得回歸方程：Y=0.0696X-0.0223(r=0.9998), 表明無水葡萄糖對照品溶液在2.2～13.2 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，用于苯酚-硫酸法測定多糖、總糖含量。

2.5.3 樣品的測定 精密量取2.3項(xiàng)下方法制備的供試品溶液各0.5 mL，置10 mL具塞試管中，按照“2.5.2”項(xiàng)下方法自“加水至2 mL”起操作，測定吸光度，計(jì)算多糖含量，結(jié)果見表1。

精密量取2.3項(xiàng)下方法制備的供試品溶液各1.0 mL稀釋到50 mL，精密量取1 mL，置10 mL具塞試管中，按照“2.5.2”項(xiàng)下方法自“加水至2 mL”起操作，測定吸光度，計(jì)算小分子總糖含量，結(jié)果見表2。

表2 多花黃精不同炮制品糖類成分含量測定結(jié)果 (n=3)

注：總糖=多糖+小分子總糖，非還原性低聚糖=小分子總糖-還原糖

2.6 總皂苷含量測定

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取人參皂苷Rb1對照品11.3 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中。取人參皂苷Rb1對照品溶液40、80、120、160、200 μL，置10 mL具塞試管中，揮盡溶劑，加0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液(新鮮配制)，冰浴時(shí)加0.8 mL高氯酸，混勻，60℃水浴加熱15 min，再冰浴2 min，加5 mL冰醋酸，混勻，靜置5 min，照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在550 nm處測定吸光度[9]。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，人參皂苷Rb1的質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸處理，得回歸方程：Y=0.0039X+0.0305(r=0.9997),結(jié)果表明人參皂苷對照品溶液在45.2～226 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.6.2 樣品的測定 取黃精樣品粉末各1.00 g，精密稱定，加14倍量水飽和正丁醇，40℃超聲提取50 min，過濾，濾渣再提取1次，合并兩次濾液，置25 mL容量瓶中，加水飽和正丁醇至刻度，搖勻[11]。取上述供試品溶液各100 μL，按照“2.6.1”項(xiàng)下方法自“置10 mL具塞試管中”起操作，測定吸光度，計(jì)算總皂苷含量。結(jié)果見表1。

2.7 數(shù)據(jù)處理及綜合評分 以多花黃精不同炮制品的浸出物、還原糖、多糖、小分子總糖、總皂苷含量為指標(biāo)，采用綜合評分法評定。評分時(shí)以各指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)最大值作為參照，將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，再根據(jù)各指標(biāo)的炮制工藝特性和成分重要性，給予糖類成分含量加權(quán)系數(shù)為0.4，總皂苷含量加權(quán)系數(shù)為0.3，浸出物加權(quán)系數(shù)為0.3，以行歸一化處理后的數(shù)值加權(quán)求和，即得綜合評分，其關(guān)系式為：(還原糖含量/還原糖含量最大值+多糖含量/多糖含量最大值+小分子總糖含量/小分子總糖含量最大值)/3×40+(總皂苷含量/總皂苷含量最大值)×30+(醇溶性浸出物含量/醇溶性浸出物含量最大值+水溶性浸出物含量/水溶性浸出物含量最大值)/2×30[1],結(jié)果見表1。

3 討論

糖類是多花黃精中含量最高的成分，歷代以來黃精炮制方法有九蒸九曝法、蔓荊子水蒸法、酒熬法、焙制法、黑豆煮法、酒蒸法、乳浸曬法、熟地制等，研究不同炮制工藝對廣西產(chǎn)多花黃精成分含量的影響，優(yōu)選出最佳炮制工藝，為廣西產(chǎn)多花黃精制法規(guī)范化研究提供參考依據(jù)。且在2015版《中國藥典》中對黃精藥材及飲片檢查項(xiàng)皆有要求“含黃精多糖以無水葡萄糖(C6H12O6)計(jì)，不得少于4.0%”[4]。不同炮制品與生品對照，多糖含量均有所增加，還原糖含量除熟地制多花黃精有所降低外，其它炮制品還原糖含量均有所增加；而不同炮制品的總糖、小分子總糖、非還原性低聚糖含量均比生品低。不同炮制工藝炮制的多花黃精之間的含量有所不同，其質(zhì)量也存在一定差異，其功效是否也存在一定的差異，有待于進(jìn)一步的深入研究。甾體皂苷是多花黃精的主要活性成分之一，初步研究表明，不同炮制工藝炮制的多花黃精之間的總皂苷含量差異不大，但與生品總皂苷含量對比，均比生品總皂苷含量高，其中以蔓荊子制多花黃精含總皂苷量最高。

采用多指標(biāo)綜合評價(jià)，蔓荊子制多花黃精得分最高為87.47，其它炮制品依次為：清蒸(86.67)>九蒸九曝法(83.08)>酒制(81.31)>黑豆、蜜、酒制(77.07)>黑豆、姜、蜜制(72.36)>熟地制(70.55)>生品(66.16)>黑豆制(64.35)。根據(jù)多花黃精有效成分及綜合評分考察，蔓荊子制法為廣西產(chǎn)多花黃精的最佳炮制工藝，其次為清蒸、九蒸九曝法，酒制。

廣西產(chǎn)多花黃精經(jīng)不同炮制工藝炮制后，其水溶性浸出物、醇溶性浸出、糖類、總皂苷等成分含量均與生品有所差異，其中以水溶性浸出物、醇溶性浸出物及非還原型低聚糖尤甚；且黑豆制多花黃精取自《現(xiàn)代中藥炮制手冊》記載，但其結(jié)果與生品比較，差異尤甚，故有待于對多花黃精炮制工藝做進(jìn)一步的深入研究。

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