正交實驗法優(yōu)選益腎滌濁丸的制備工藝

1．廣東省肇慶市中醫(yī)院，廣東 肇慶 526060；2．廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；3.廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東 中山 528458

益腎滌濁丸是廣東省名老中醫(yī)梁宏正臨證多年的經(jīng)驗方，具有清熱解毒、通癃滌濁、祛瘀止痛、益腎補虛，主治急、慢性前列腺炎、性功能障礙等癥，在廣東省肇慶市中醫(yī)院臨床應(yīng)用多年，療效良好。方中黃柏有較好的清熱燥濕瀉火作用，《醫(yī)學(xué)啟源》引用《主治秘訣》云:“瀉膀胱龍火，利結(jié)小便，下焦?jié)衲[，臍中痛，補腎水不足”[1]。其主要有效成分為小檗堿，小檗堿有較好的抗菌、抗炎等藥理作用。丸劑的溶散時限已作為評價丸劑內(nèi)在品質(zhì)的重要手段之一，是對丸劑特有的檢查項目。因此本實驗以小檗堿含量和溶散時限為考察指標，用L9(34)正交試驗法[2]優(yōu)化益腎滌濁丸的制備工藝，可以較為全面的衡量工藝的合理性，得到療效穩(wěn)定、質(zhì)量可控的制劑。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國，Waters)，GZX-9246MBE數(shù)顯鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；B-220恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；BS-6G智能崩解試驗儀(上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司)；HWS26電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；BY-800型調(diào)速糖衣鍋(長沙湘勁機械)；UV1000紫外可見分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；CP225D萬分之一天平(德國Sartorus公司)。

1.2 材料 鹽酸小檗堿對照品(批號：100080-201409，中國食品藥品檢定研究院)；磷酸二氫鉀(AR,天津市福晨化學(xué)試劑廠)；乙腈(色譜純，天津市百世化工有限公司)；超純水(屈臣氏)。所用藥材經(jīng)廣東藥科大學(xué)田素英副教授鑒定均符合2015版中國藥典標準。

2 方法與結(jié)果

2.1 制丸和溶散時限的測定 將黃柏、苦參、虎杖、黃芪、淫羊藿、菟絲子6味藥加8倍水(浸泡10 min)回流2次，每次1 h，濾過，合并濾液并濃縮成相對密度為1.15～1.20(20℃)的清膏[3]，備用；粉萆薢等中藥粉碎過100目篩的藥粉，備用。用調(diào)速糖衣鍋噴灑少量水進行起模，加大成型時噴灑黏合劑，將丸粒制成黃豆粒大小，進行整粒，蓋面，干燥即得[4]。按照2015年版《中國藥典》(一部)丸劑溶散時限方法測定[5]。

2.2 鹽酸小檗堿含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相：乙腈∶0.1mol/L 磷酸二氫鉀水溶液(30 ∶70)，流速1.0 mL/min，波長345 nm，柱溫:室溫，進樣量 20μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液 精密稱取鹽酸小檗堿對照品2.44 mg，用上述流動相溶解并定容至50 mL，得濃度為0.0488 mg/mL的溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾備用。

2.2.2.2 供試品溶液 按處方量等比例縮減后稱取每份約為2.0g，加8倍量的蒸餾水，浸泡60 min，加熱回流1.0 h，提取3次，將提取的藥液濃縮并定容成50 mL。經(jīng)純化后精密量取5 mL用上述流動相定容成25 mL，充分搖勻后4000 r/min離心30 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾備用。

2.2.2.3 陰性對照溶液 取處方中去黃柏的其他藥材，按供試品溶液制備方法制成缺黃柏的陰性樣品。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 系統(tǒng)適用性實驗 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，理論塔板數(shù)不低于4000。色譜峰與相鄰峰之間分離度大于1.5(如圖1所示)。

圖1 鹽酸小檗堿圖表

2.2.3.2 制備標準曲線 精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8 mL，分別置于10mL容量瓶中，加流動相稀釋到刻度，在“2.2.1”項下方法分別測定，以對照品濃度(X)為橫坐標，相應(yīng)對照品峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為y=64389723.27x+218364.62，r=0.9993，結(jié)果表明鹽酸小檗堿含量在4.88～39.04μg的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.3.3 精密度試驗 精密取對照品溶液各20μL，按“2.2.1”項下方法重復(fù)進樣 6 次，計算鹽酸小檗堿的色譜峰面積。RSD為1.02%，表明本儀器精密度良好。

2.2.3.4 重復(fù)性試驗 精密稱取處方中藥材粉末共 6 份，各2 g，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備6份溶液，各取20 μL，在“2.2.1”項下方法測定鹽酸小檗堿的色譜峰面積。計算RSD為1.60%，表明此方法重現(xiàn)性良好。

2.2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h，在“2.2.1”項下方法測定鹽酸小檗堿色譜峰面積。計算RSD為2.58%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3.6 加樣回收試驗 精密稱取已知含量(11.7136 mg/g)供試品共 6 份，各1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試溶液，再分別精密加入鹽酸小檗堿對照品適量，適當稀釋后按“2.2.1”項下條件測定峰面積，計算加樣回收率[6-7]。平均回收率為99.45%，RSD為1.28%。結(jié)果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收試驗結(jié)果

2.3 正交試驗優(yōu)選工藝 根據(jù)單因素實驗結(jié)果分析得出清膏相對密度、起模的粉水比例、干燥溫度、干燥時間對溶散時限、小檗堿含量的影響更為顯著，故選擇這4個因素做正交試驗，以溶散時限、小檗堿含量為評價指標，按照L9(34)表進行正交實驗[8-9]，并按0.6∶0.4的權(quán)重系數(shù)對這 2個指標進行綜合評分。結(jié)果見表2、3、4。

表2 因素水平表

表3 正交實驗結(jié)果表

表4 方差分析表

由表3的結(jié)果可知，各考察因素對益腎滌濁丸制備工藝影響依次為：干燥時間>相對密度>干燥溫度>粉水比例，且干燥時間對工藝影響較大。從表4看出各因素影響不顯著(P>0.05)。從K值可知通過正交實驗優(yōu)選的益腎滌濁丸制備工藝的最優(yōu)水平搭配為A3B2C1D1，即干燥溫度為80℃，清膏相對密度為1.15，起模的粉水比例為1∶1，干燥時間為8h。

2.4 驗證實驗 按實驗所確定益腎滌濁丸的最優(yōu)制備工藝為干燥溫度為80℃，清膏相對密度為1.15，起模的粉水比例為1∶1，干燥時間8h的條件下進行驗證試驗，結(jié)果測溶散時限均符合2015版中國藥典規(guī)定，均在1h內(nèi)溶散，水丸光滑圓整，色澤鮮亮，大小均一，鹽酸小檗堿含量(mg·g-1)分別為11.8925、11.2398、12.0078，平均為11.7134，RSD為1.54%。

3 討論

泛丸的制備工序主要為粉碎、起模、成型、蓋面、干燥[10]。益腎滌濁丸的原制備工藝也是用此工序，制備的成品符合中國藥典中有關(guān)丸劑的規(guī)定，但沒有進行最佳工藝優(yōu)選研究，本次實驗用正交實驗篩選最佳工藝，以期得到高效實用的制備工藝。實驗以溶散時限為考察指標[11-12]，溶散時限是丸劑檢查的必要項目，合理的溶散時限既能保證丸劑的穩(wěn)定性，又能保證丸劑的吸收利用度。本次的實驗結(jié)果表明本次所制水丸的溶散時限全部符合規(guī)定。

從組方中可知小檗堿是其主要有效成分之一，其中黃柏中的小檗堿有抗病原微生物、抗炎、抗腫瘤、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)、抗心律失常等藥理作用。因此本實驗同時以小檗堿含量為考察指標。由驗證實驗可看出該工藝所得的小檗堿含量也較高。實驗結(jié)果表明益腎滌濁丸制備工藝的最優(yōu)水平搭配為A3B2C1D1，即粉水比例為1∶1，相對密度為1.15，干燥溫度為80 ℃，干燥時間8 h。且各考察因素對益腎滌濁丸制備工藝影響依次為：干燥時間>相對密度>干燥溫度>粉水比例。干燥時間與相對密度對工藝影響較大，二者有無相關(guān)性有待進一步研究。

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