氧化石墨烯的多色發(fā)光及其在熒光成像中的應(yīng)用

陳 健，孟文潮，凌 梟，鄧勝松，梅青松

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

1 引 言

2004年，Geim等人發(fā)現(xiàn)了單原子層厚度的石墨烯納米片，這一發(fā)現(xiàn)徹底顛覆了科學(xué)界的認知，單層石墨在一定的條件下熱力學(xué)不穩(wěn)定且容易卷曲成富勒烯、碳納米管等結(jié)構(gòu)[1]。石墨烯的發(fā)現(xiàn)極大地增加了研究者的興趣，6年后，Geim和Novoselov由于在石墨烯方面開創(chuàng)性的研究被授予了2010年的諾貝爾物理學(xué)獎。這種開創(chuàng)性的二維材料在過去的十年里因其良好的導(dǎo)電性、機械柔韌性、導(dǎo)熱性等特性給物理、化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域的研究人員帶來了巨大的研究熱情[2-10]。然而，作為碳的同素異形體，石墨烯納米片是由碳原子密集排列組成的零帶隙單層材料，具有巨大的sp2結(jié)構(gòu)[11]，因此，直接觀察到石墨烯納米片的發(fā)光是不可能的。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)石墨烯的帶隙可以通過對其尺寸或官能團的變化進行調(diào)節(jié)。最有效的方法是將氧化官能團引入石墨烯晶格中以形成氧化石墨烯(GO)，實際上是sp3碳原子作為一種缺陷嵌入到sp2碳原子的晶格中，這些缺陷包含含氧官能團，例如，暴露在石墨烯邊緣上的羧基官能團和平面上的羥基及環(huán)氧官能團[12]。

隨著氧化程度的改變，GO被賦予優(yōu)良的水溶性和優(yōu)異的光學(xué)性能[13]，此外它還具有熒光猝滅的能力，主要是因為它具有從可見光到近紅外寬的吸收波段[14]。2009年，Yang等人第一次報道了石墨烯及其衍生物在熒光受體方面具有廣泛的應(yīng)用[15]，其能量共振轉(zhuǎn)移的距離可達30 nm[16-17]，大量的熒光分子例如有機分子[18]、量子點[19]、上轉(zhuǎn)換納米顆粒[20]、金屬簇[21]、熒光共軛聚合物[22]可以作為熒光供體對眾多的分析物包括金屬離子[23]、小分子[24]、蛋白質(zhì)[25]、核酸[26]等進行傳感或成像。這種常見的傳感檢測機制是利用石墨烯剛性的π共軛結(jié)構(gòu)很容易地結(jié)合上各種各樣的熒光供體和檢測物。另一方面，由于受其剛性的π共軛結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，研究者在致力于氧化石墨烯發(fā)光方面付出了越來越多的努力。為了完成這一目標(biāo)，在改變其帶狀結(jié)構(gòu)方面進行了大量的研究，希望可以得到新的光學(xué)現(xiàn)象，例如將二維結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯納米片轉(zhuǎn)換成零維的氧化石墨烯量子點，在氧化石墨烯上耦合邊緣官能團以創(chuàng)造離散的能級等。因此，越來越多的研究向我們展示了單層或多層氧化石墨烯納米片及其衍生物可以發(fā)射出多種顏色的熒光。

由于GO優(yōu)異的光學(xué)性能，例如光的穩(wěn)定性、低毒性、發(fā)射波長的可調(diào)節(jié)性等，越來越多的熒光氧化石墨烯及其衍生物被廣泛的應(yīng)用于生物傳感、生物成像和生物醫(yī)學(xué)治療，并且有大量的文獻對其性能和應(yīng)用做出了總結(jié)[27]。然而，在這之前少有文章去系統(tǒng)地總結(jié)如何使得氧化石墨烯納米材料發(fā)光。本文著重論述了近期各種GO及其衍生物在熒光發(fā)射和光學(xué)成像方面的一些進展。我們期望讀者能通過這一綜述全面地了解GO不同的熒光發(fā)射，以便能夠進一步探索GO納米材料新的發(fā)光性質(zhì)，并擴大其應(yīng)用范圍。

2 熒光性質(zhì)的調(diào)控

2.1 氧化石墨烯納米片的熒光

2.1.1 原始氧化石墨烯的熒光

與碳原子sp2雜化的石墨烯相反，GO含有共價鍵耦聯(lián)含氧官能團上的sp3雜化碳原子，GO的HOMO(已占有電子的能級最高的軌道)和LUMO(未占有電子的能級最低的軌道)被分離，導(dǎo)致GO納米材料具有一定的帶隙，并且?guī)吨惦S著氧密度即O/C比的增加而增加[28]。理論計算表明，其帶隙取決于碳鍵與含氧官能團的比例及其分布，例如 ，GO中2.5～6 nm大小的sp2碳簇，帶隙可以從0.58變化到0.24 eV[51]。因此，GO的微弱熒光可以歸因于限域在局部sp2結(jié)構(gòu)中的π電子所引起[29]。

受單層碳納米管的啟發(fā)[30]，Dai及其同事在2008年首次報道了關(guān)于GO的熒光。他們采用了一種與密度梯度相關(guān)的超速離心方法，將尺寸小于10 nm的超小GO納米片(NGO)分離，發(fā)現(xiàn)在400 nm激發(fā)光激發(fā)時，NGO溶液產(chǎn)生的熒光在570 nm[31]。用氨基化聚乙二醇(PEG)改性后，得到的NGO-PEG熒光發(fā)射峰值藍移至520 nm(如圖1A～1C)。Zhang等人使用碳納米角作為原材料，通過氧化剝離的方法制備了小尺寸且均勻的GO(S-GO)納米片[32]。當(dāng)激發(fā)波長從345 nm增加到440 nm時，得到的S-GO的熒光峰位置在560 nm處，當(dāng)激發(fā)光波長從460 nm增加到600 nm時，其熒光峰位置逐漸紅移至660 nm處。對于尺寸較大的GO納米片，其原始熒光也已被廣泛報道。例如，Kikkawa等人報道了液態(tài)和固態(tài)兩種GO納米片在500 nm激發(fā)光激發(fā)時發(fā)射750 nm的熒光[33]。Yan研究小組報道了在450 nm激發(fā)光激發(fā)下GO膠體溶液發(fā)射峰在650 nm，并且認為它是由嵌入sp3基質(zhì)中小的sp2碳結(jié)構(gòu)域內(nèi)的電子空穴對輻射復(fù)合產(chǎn)生[34](如圖1D)。這種獨特的近紅外熒光對離子強度和pH值顯示出可逆和敏感的反應(yīng)，作者通過光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移機制開發(fā)了一種基于多巴胺的生物傳感器。同樣，Shang等人也從GO的水溶液中發(fā)現(xiàn)pH值對熒光的決定性作用[35]。GO懸浮液在440 nm激發(fā)光激發(fā)下發(fā)射出668 nm的寬峰，隨著溶液pH從酸性向中性的變化，觀察到該發(fā)射峰強度單調(diào)降低。隨著pH值的逐漸增加，在668 nm處的發(fā)射消失，在482 nm和506 nm附近出現(xiàn)了兩個相對尖銳的峰。有趣的是，用氧等離子體對石墨烯片進行短時間處理獲得的GO也可以呈現(xiàn)出以700 nm為中心的單一寬峰(圖1E)[36]。功率超過1 mW的強激光激發(fā)會導(dǎo)致光漂白和較大的藍移。對于多層石墨烯而言，經(jīng)過這樣的處理后不能觀察到熒光發(fā)射，這是由于在氧等離子體逐層刻蝕石墨烯之前，只有最上層受到相應(yīng)的影響。因此，最上層的發(fā)射可以被下層的未被處理層猝滅。作者認為氧等離子體刻蝕會連續(xù)地除去碳原子以形成sp2島，并且和熒光發(fā)射相關(guān)的局部電子來自于氧化位點處。

圖1 (A)NGO-PEG與anti-CD20抗體(利妥昔單抗)選擇性的結(jié)合及其細胞成像示意圖[31]；(B)用NGO-PEG-Rituxan復(fù)合物處理CD20陽性表達的B淋巴細胞的NIR熒光圖像[31]；(C)用NGO-PEG-Rituxan復(fù)合物處理CD20陰性表達的人T細胞白血病細胞的NIR熒光圖像[31]；(D)GO膠體的紫外吸收和熒光發(fā)射光譜(插圖：365 nm激發(fā)GO膠體的發(fā)光圖像)[34]；(E)石墨烯樣品被氧化5秒后在473 nm激發(fā)光激發(fā)下的共聚焦熒光圖像。有意地進行強激光照射從而產(chǎn)生光漂白現(xiàn)象，如位置3所示[36] Fig.1 (A)A schematic drawing illustrating the selective binding and cellular imaging of NGO-PEG conjugated with anti-CD20 antibody(Rituxan) [31]; (B)NIR fluorescence image of CD20 positive Raji B-cells treated with the NGO-PEG-Rituxan conjugate[31]; (C)NIR fluorescence image of CD20 negative CEM T-Cells treated with NGO-PEG-Rituxan conjugate[31]; (D)Typical absorption and fluorescence emission spectra of the as-prepared GO colloid(inset:photograph for GO colloids excited by 365 nm) [34]; (E)Confocal PL image excited at 473 nm for a graphene sample oxidized for 5 s. PL at position 3 is bleached intentionally by intense laser irradiation[36]

圖2 (A)GO被還原后超快的光致發(fā)光光譜遷移示意圖[41]。(B)空間異質(zhì)性單層GO還原動力學(xué)示意圖[42] Fig.2 (A)Schematic illustration of ultrafast spectral migration of photoluminescence in GO after reduction[41]. (B)Schematic illustration of direct observation of spatially heterogeneous single-layer GO reduction kinetics[42]

除了近紅外熒光發(fā)射，經(jīng)過化學(xué)處理的氧化石墨烯納米片也可以發(fā)射藍色熒光。在我們以前的工作中報道了用丁胺修飾后的氧化石墨烯納米片在350 nm激發(fā)下能夠發(fā)射出峰位在430 nm處的熒光，其量子產(chǎn)率為13%，相比較于原始的氧化石墨烯納米片，其熒光強度得到了顯著的增強[37]。當(dāng)氧化石墨烯被其他的烷基胺類例如1-6己二胺、辛胺、十二烷胺、聚二胺(乙二醇)等修飾也能夠得到相似的熒光特性。此外，我們使用熒光氧化石墨烯納米片構(gòu)建的傳感試紙可用于三硝基甲苯殘留或氟離子的示蹤[38]和細胞內(nèi)鐵離子的生物傳感成像[39]。Eda等人也觀察到當(dāng)沉積物暴露于肼蒸汽后剝離得到的懸浮的薄膜樣品其綠色的熒光峰位主要在390 nm處[40]。通過適當(dāng)?shù)倪€原反應(yīng)處理，控制碳-氧sp3基質(zhì)中分離的sp2簇的濃度和電子-空穴對的定位，有利于輻射復(fù)合，所得到的熒光強度比之前合成的物質(zhì)提高10倍左右。此外，Kikkawa團隊發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)的氙燈曝光后，熒光從主要的紅色發(fā)射轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色發(fā)射[41](圖2A)。通過減少在氙燈下的曝光時間，增加了非輻射載體的弛豫率，產(chǎn)生了一種快速淬滅的過程，在未經(jīng)過還原的氧化石墨烯中可以觀察到光譜的弛豫和紅移。借助于對氧化石墨烯薄片的熒光猝滅和藍移的表征，McDonald等人首次觀察了氧化石墨烯含氧官能團光解還原的過程[42](圖2B)。氧化石墨烯的還原來自于光誘導(dǎo)遷移和隨后在其基底平面內(nèi)羥基的解離。

對于熒光的起源，應(yīng)考慮氧化石墨烯的電子帶隙結(jié)構(gòu)和氧化石墨烯費米能級的密度狀態(tài)，碳鍵與氧化官能團的比例及其不同的位置可以使其帶隙從零調(diào)節(jié)到幾個電子伏特[36]。根據(jù)帶隙結(jié)構(gòu)和密度狀態(tài)，Chien和Eda等人提出原始的氧化石墨烯的熒光可能起源于sp2位點紊亂的π-π*間隙引起的光學(xué)轉(zhuǎn)變[43]。Gurzadyan認為C-O、C=O和O=C-OH這三種官能團均與氧化石墨烯的發(fā)光有關(guān)[44]。他們發(fā)現(xiàn)水中的氧化石墨烯通過時間分辨熒光測量法表現(xiàn)出從1 ps到2 ns的多指數(shù)衰減動力學(xué)過程。通過引入分子軌道概念，發(fā)現(xiàn)熒光主要源于非氧化碳區(qū)域和氧化碳原子區(qū)域邊界之間的電子躍遷。

為了解釋GO在強激發(fā)光下產(chǎn)生熒光的原因，Wu等人提出了“巨形紅邊效應(yīng)”機制[45]。他們認為GO薄片在極性溶劑中顯示了光激發(fā)電子的溶劑化動力學(xué)作用，并在非極性溶劑中消失。GO在HNO3和KOH溶液中進行化學(xué)處理后分別產(chǎn)生了富含羧基的GO和富含羥基的GO。富含羥基的GO具有以500 nm為中心的發(fā)射峰。然而，含羧基的GO在630 nm處顯示出寬的發(fā)射峰。GO熒光的變化主要是由納米片上含羧基和含羥基的熒光疊加造成的。因此，熒光是由羧基的激發(fā)態(tài)質(zhì)子化作用和來自依賴于激發(fā)光波長的極性基團的熒光組成，例如GO納米片中的羥基部分。兩種組分相結(jié)合，在酸性條件下產(chǎn)生寬的熒光發(fā)射。在堿性條件下或在KOH溶液中化學(xué)還原GO后，極性基團如羥基部分以激發(fā)光波長依賴性的熒光發(fā)射。

此外，一些研究人員認為，GO靈敏的熒光性質(zhì)是由于吸附在GO納米片上的氧化碎片(OD)造成的。Rourke的研究小組發(fā)現(xiàn)，用NaOH處理GO可將材料分成兩個部分：無色但高熒光的OD和含有類似于GO的片狀暗色無熒光物質(zhì)[46-47]。原始的GO顯示出弱的熒光，而OD發(fā)射出更強烈地?zé)晒?，并相對于原始的GO藍移，隨著激發(fā)光波長的減小，發(fā)射光譜轉(zhuǎn)移到較短的波長。因此，他們認為這些OD對GO的光學(xué)性能有影響。然而，Naumov最近的研究發(fā)現(xiàn)，通過分析吸收和發(fā)射光譜以及對其壽命的測量，證實了這種獨特的光學(xué)性質(zhì)是受其內(nèi)部結(jié)構(gòu)決定的，而與OD的存在無關(guān)[48]。

2.1.2 氧化石墨烯納米片的多色熒光調(diào)制

上述總結(jié)的GO納米片的熒光局限于單一的顏色，盡管這些研究提出的GO發(fā)射峰依賴于激發(fā)光波長的變化，但是當(dāng)激發(fā)光波長轉(zhuǎn)變到較長波長區(qū)域時，其強度顯著降低，因此這種發(fā)射熒光峰位的位移不能被認為是真正可調(diào)的多色熒光。

迄今為止，大量的研究工作報道了將GO的發(fā)射光由近紅外區(qū)域調(diào)節(jié)到可見光區(qū)域且具備較高量子產(chǎn)率的方法。例如，借助于固體電解質(zhì)薄膜的氧化還原反應(yīng)，可以簡單地通過將DC(直流電)電壓施加在如圖3A所示的全固態(tài)器件中，使GO的帶隙能夠被原位調(diào)節(jié)[49-50]。將熒光峰波長從393 nm調(diào)節(jié)到712 nm可以通過改變直流電壓(-3.5～2.5 V)實現(xiàn)，如圖3B所示。當(dāng)GO被氧化時，電壓的極性被定義為正；當(dāng)被還原時，電壓的極性被定義為負。對于原始GO，觀察到在676 nm處的寬發(fā)射峰變?nèi)?，并且?dāng)DC偏壓為-2.5 V時，在544 nm處出現(xiàn)另一個峰。隨后施加相反的DC偏置電壓(1.5 V)，電化學(xué)氧化引發(fā)從rGO到GO的過程，熒光峰從544 nm轉(zhuǎn)移到690 nm。另外，Chen課題組也提出了一種可控的方法，通過在穩(wěn)態(tài)氙燈照射下，控制曝光時間，實現(xiàn)了從GO到rGO的熒光轉(zhuǎn)化[51]。原始GO的熒光主要由兩個峰組成，一個以600 nm為中心，另一個以約470 nm為中心。增加還原時間會引起600 nm的發(fā)射峰逐漸降低，470 nm發(fā)射峰相應(yīng)增加，經(jīng)過3個小時的還原反應(yīng)后發(fā)射峰位會移到450 nm處(圖3C)。 Maiti等人還采用紅外線照射的方法，通過光熱還原來研究單個含氧官能團的改性與GO所得熒光光學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系[52]。結(jié)果表明，隨著還原時間和功率密度的增加，sp3基團中sp2簇逐漸恢復(fù)。作者認為，黃色-紅色發(fā)射(～610 nm)是由GO中環(huán)氧/羥基官能團引起的局部缺陷狀態(tài)所致，藍色發(fā)射(～500 nm)是由于羰基的局部電子狀態(tài)所致。隨著還原時間的改變和紅外輻射功率密度的增加，發(fā)現(xiàn)黃-紅發(fā)射強度下降，藍色發(fā)射突出。

圖3 (A)GO和介孔二氧化硅薄膜的全固態(tài)熒光源示意圖[49]。(B)通過在1200 s范圍內(nèi)調(diào)整直流偏置電壓進而得到不同的PL光譜[50]。(C)對氧化石墨烯懸浮液進行在不同曝光時間(0～180 min)光熱還原處理后的熒光光譜圖[51]。(D)氧化石墨烯納米片在365 nm 紫外燈照射下熒光發(fā)射圖[53] Fig.3 (A)Schematic illustration of all-solid-state PL source made of GO and mesoporous SiO2 thin film[49]. (B)DC bias dependence of normalized PL spectra tuned by application of various DC bias voltages for 1 200 s[50]. (C)Normalized PL spectra of the GO suspensions after different exposure times(0～180 min) to photothermal reduction treatment[51]. (D)Photographs of the as-prepared luminescent GO nanosheets under 365 nm UV lamp irradiations[53]

氧化處理和金屬離子摻雜法同樣也可以很好地調(diào)節(jié)GO的熒光顏色。本課題組最近報道了關(guān)于合成具有多色發(fā)射的GO納米片的新方法[53]，通過簡單地調(diào)節(jié)GO在食人魚溶液中的氧化時間，GO發(fā)射的熒光可以從深棕色到青色進行調(diào)節(jié)，發(fā)射峰位從590 nm移動到490 nm(圖3D)。這是因為食人魚溶液中產(chǎn)生的原子氧可以將GO納米片中芳香環(huán)上的碳碳雙鍵轉(zhuǎn)化成環(huán)氧基團，再進一步地氧化成羥基或羰基對。因此，隨著反應(yīng)時間的延長，sp2碳簇的尺寸逐漸減小，π→π*能隙逐漸擴展，相應(yīng)的熒光發(fā)射峰藍移。Chu等人合成的Mn2+螯合的GO，可以在400～550 nm的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)熒光峰位[54]。將GO和KMnO4分散在去離子水中，然后將上清液轉(zhuǎn)移至高壓釜中并加熱形成Mn2+鍵合的rGO，隨著激發(fā)波長從320 nm變化到490 nm，熒光峰位置從430 nm變化到550 nm。由于Mn2+的引入，導(dǎo)致長波長熒光(480～550 nm)的強度比430 nm處的藍色發(fā)射光強高，這主要是由與sp2簇尺寸相關(guān)的量子限制效應(yīng)引起的。由于Mn2+與sp2簇結(jié)合，短距離和能級重疊導(dǎo)致Mn2+的能量有效的轉(zhuǎn)移到sp2簇上，使得輻射復(fù)合率顯著增加，熒光增強。

2.1.3 發(fā)光團修飾的氧化石墨烯納米片

由于共振能量轉(zhuǎn)移機制的限制，發(fā)光團直接耦聯(lián)在GO納米片上并不能賦予其發(fā)射熒光的能力。然而，利用一些巧妙的設(shè)計可以將熒光素錨定在GO納米片上，并能有效地防止其熒光猝滅。例如，Huang課題組報道，PEG2000能夠和GO的羥基和羧基官能團共價結(jié)合[55]，然后，熒光素進一步與PEG修飾的GO綴合。PEG可以作為熒光素和GO納米片之間結(jié)合的橋梁，起到防止熒光猝滅的作用。與游離熒光素的光譜相比，在Fluo-G的光譜中可以觀察到5 nm的紅移，這表明GO通過聚合物鏈PEG2000共價結(jié)合熒光素改變了熒光素的熒光性質(zhì)。由于能量轉(zhuǎn)移機制，量子點直接共軛到GO的方法也不能使其發(fā)光[56-57]。為了克服這個問題，Hun等人通過對GO表面修飾上具有改善其分散性的兩親性物質(zhì)多肽(poly(L-賴氨酸))，GO表面的吸附性得到改變，具有了良好的粘附性功能[58]。

2.2 氧化石墨烯量子點的熒光

2.2.1 通過還原法切割氧化石墨烯以制備量子點(GQDs)

圖4 (A)利用水熱法將GO切割成GQDs的機制及其熒光光譜[59]；(B)氨基功能化的GQDs的制備程序示意圖及其熒光光譜圖像[62] Fig.4 (A)Mechanism for the hydrothermal cutting of GO sheets into GQDs and its photoluminescent spectra[59]; (B)schematic illustration of the preparative strategy for amino-functionalized GQDs, and the emission images as well as their photoluminescence spectra[62]

將二維的納米片轉(zhuǎn)換為零維的量子點同樣也可以有效地調(diào)整GO的帶寬。氧化石墨烯熒光量子點主要通過還原法或者是氧化法從GO納米片中切割得到的。Pan的課題組報告了一種簡單的水熱法，將微米級的氧化石墨烯單片切割成表面具有功能化官能團的QDs，其平均直徑為9.6 nm[59]。他們發(fā)現(xiàn)，在320 nm激發(fā)光激發(fā)下，所獲得的QDs會發(fā)出明亮的藍光，在430 nm激發(fā)光激發(fā)時，其量子產(chǎn)率為6.9%。他們提出，在水熱法還原過程中，氧化石墨烯納米片上的環(huán)氧基和羰基逐漸斷裂，最終形成QDs，并產(chǎn)生具有類似三線態(tài)卡賓的結(jié)構(gòu)，發(fā)出很強的藍色熒光(如圖4A所示)。Kin等人還通過水熱法將GO納米片切割、過濾、透析以制備成一系列特殊尺寸的QDs[60]。他們所報道的這些量子點在直徑小于17 nm時，是帶有之字形和椅形邊緣的圓形；當(dāng)其直徑大于17 nm時，大多數(shù)為椅形邊緣的多邊形形狀。當(dāng)QD的大小增加時，這些PL的特征主要是由圓形到多邊形形狀的改變和相應(yīng)的邊緣到整體的變化造成的。除了溶劑熱法，光還原法也可以將GO納米片切割成量子點。Sun等人用異丙醇作為還原劑，在紫外線照射的協(xié)助下，制備出在440 nm處有藍色發(fā)射光的QDs[61]。當(dāng)被紫外線照射時，異丙醇被光解水直接產(chǎn)生的H·/OH·氧化，產(chǎn)生的(CH3)2·可以還原GO納米片上的氧化基團。在光化學(xué)還原后，產(chǎn)生的無序化狀態(tài)減少，新的、小的和孤立的sp2結(jié)構(gòu)域逐漸形成。在這些sp2簇中的電子空穴復(fù)合顯示出較短波長的藍色熒光。

盡管基于氧化石墨烯量子點的合成已經(jīng)做出了很多研究，但大多數(shù)的最大發(fā)射峰是在420 nm處的藍色熒光。Tetsuka等人最近報道了一種基于GO納米片的GQDs合成的新型水熱法，胺與石墨烯核心的有效軌道共振來系統(tǒng)地修飾電子結(jié)構(gòu)[62]。通過改變氨的初始濃度和氨基熱液處理的溫度(圖4B)，可以將GQDs的熒光從紫色調(diào)節(jié)到黃色區(qū)域。在邊緣處的伯胺顯著改變了GQDs的整個電子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了帶隙的縮小。因此，邊緣處理主導(dǎo)的離子化的π軌道與氨基分子軌道之間的共振是光學(xué)可調(diào)性和高量子產(chǎn)率的起源。Jeon的團隊還將基于GO得到的有無胺基官能團的QDs的熒光進行了比較[63]。在他們的工作中，GO首先在H2SO4/HNO3混合物中被氧化，然后在N2H4中進一步還原。為了制備具有胺基官能團的GQDs，在利用N2H4使得環(huán)氧基發(fā)生開環(huán)的還原反應(yīng)之前，將氧化的GO與聚乙二醇二胺(PEG-二胺)反應(yīng)。獲得的QDs發(fā)射出一種藍綠色的熒光，其最大的熒光峰位置在500 nm，而QDs-NHR則發(fā)射出一種黃色的熒光，其發(fā)射峰則紅移至528 nm。為了從根本上了解基于GO的QDs的強熒光發(fā)射的起源，Rao等人通過溶劑熱法合成了兩種量子點[64]。一種是在二甲基甲酰胺中制備的，另一種是在NaOH中得到的。從QDs中觀察到的熒光來看，他們發(fā)現(xiàn)表面具有鈍化作用的官能團或其他與表面結(jié)合影響其發(fā)射的物質(zhì)，都不是其熒光發(fā)射的起源。QDs的邊緣類型是隨機的，并且暗示在QDs中沒有一個優(yōu)先的邊緣結(jié)構(gòu)。這些無序的邊緣有助于從碳納米物質(zhì)中觀察到發(fā)光現(xiàn)象。他們提出QDs的熒光是由苯環(huán)系統(tǒng)中高度共軛的離散的HUMO-LUMO能級之間的電子躍遷所產(chǎn)生的。從這些樣品相似的熒光光譜中可以發(fā)現(xiàn)，官能團并不是熒光產(chǎn)生的根本原因。經(jīng)過一系列的退火實驗，導(dǎo)致了QDs產(chǎn)生隨機邊緣，觀察到熒光似乎源自QDs的邊緣狀態(tài)，退火引起的邊緣鈍化導(dǎo)致熒光信號的猝滅。

2.2.2 通過氧化法切割氧化石墨烯以制備石墨烯量子點(GQDs)

圖5 (A)GO納米片的photo-Fenton反應(yīng)原理示意圖[65];(B)碳纖維氧化切割成GQDs示意圖[66];(C)b-GQDs的合成示意圖，含氧的位置有紅色標(biāo)記[67](彩圖見電子版) Fig.5 (A)Schematic representation of a proposed mechanism for the photo-Fenton reaction of the GO sheets[65]. (B)Representation scheme of oxidation cutting of carbon fiber into GQDs[66]. (C)Schematic illustration of the synthesis of b-GQDs. Oxygenated sites are shown in red[67](colour figures are available in electro-version)

氧化法是基于GO制備QDs的另一種有效的方法。Zhang課題組展示了一種在紫外線照射和芬頓試劑共同作用下將微米大小的GO納米片進行氧化切割[65](如圖5A)。光-芬頓反應(yīng)從GO的含氧基團連接的碳原子上開始，隨后C-C鍵斷裂。所產(chǎn)生的量子點具有均勻的結(jié)晶度，因為在光-芬頓反應(yīng)期間已經(jīng)除去與羥基和環(huán)氧基團連接的碳原子，并且450 nm為中心的熒光發(fā)射是由激發(fā)光決定的。Peng等人報道了一種酸性刻蝕的方法，將傳統(tǒng)的基于瀝青基團的碳纖維切割成尺寸為1～4 nm的QDs[66](如圖5B)?？梢酝ㄟ^更改流程參數(shù)來改變QDs的大小，進而控制QDs的熒光顏色為藍色、綠色和黃色。QDs的光學(xué)性質(zhì)也隨著尺寸的變化而變化，這也可能導(dǎo)致sp2位點密度和性質(zhì)的變化，并且可以通過改變QDs的尺寸來調(diào)節(jié)帶隙能。Tour課題組開發(fā)了一種簡單的方法，可以從不同的煤中得到不同納米尺寸的QDs，并確定了煤的獨特結(jié)構(gòu)有利于制備QDs[67-68](如圖5C)。GQDs是從一種名為b-GQDs的瀝青煤中所產(chǎn)生的，其直徑為(2.96±0.96) nm。來自焦炭(c-GQDs)和無煙煤(a-GQDs)的GQDs的大小分別為(5.8±1.7) nm和(29±11) nm。在345 nm激發(fā)光激發(fā)下，a-GQDs、c-GQDs和b-GQDs的最大發(fā)射波長分別為530、480和460 nm。此外，由無煙煤合成的GQDs的能帶隙也可以由氧化過程中的反應(yīng)溫度來控制，從而合成不同大小的GQDs，以及獲得覆蓋可見光譜的熒光發(fā)射。正如預(yù)期的那樣，當(dāng)GQDs的尺寸從4.5增加到70 nm時，熒光發(fā)射峰值將從520 nm紅移至620 nm，這與量子限制效應(yīng)是一致的。Qu等人報道了一種電化學(xué)方法，制備基于GO的尺寸為3-5 nm均勻的QDs，其呈現(xiàn)綠色發(fā)光并且可以穩(wěn)定地保持在水中幾個月而沒有任何變化[69]。

2.2.3 氧化石墨烯量子點與石墨烯量子點的熒光差異

為了研究氧化石墨烯量子點與石墨烯量子點熒光的不同，很多研究工作都報道了氧化石墨烯量子點(GOQDs)和石墨烯量子點(GQDs)的具體熒光特性。例如，Liu等人成功合成了高度均勻的GQDs，將石墨納米顆粒和乙醇與水的混合物放在旋渦混合器中攪拌，并且將GOQDs從石墨懸浮液中離心出來[70]。以較高的產(chǎn)率得到直徑為4 nm的單層和圓形的GQDs和GOQD。GOQD的表面富含各種含氧官能團，GQD仍具有純的sp2碳晶體結(jié)構(gòu)，且無氧化缺陷，為深入研究納米級石墨烯的熒光起源提供了理想的平臺。還進一步展示了GQDs藍色的和GOQDs綠色的發(fā)射光。通過對GQDs和GOQDs光學(xué)特性的描述，揭示了GOQDs綠色發(fā)射光是由含氧官能團的缺陷產(chǎn)生的，而GQDs的藍色發(fā)射光則是由高結(jié)晶結(jié)構(gòu)的內(nèi)在狀態(tài)所主導(dǎo)的。另外，GQDs藍色熒光表現(xiàn)出比GOQDs綠色熒光更快的復(fù)合壽命。

Seo等人采用了直徑為4 nm的GNPs作為一種起始材料，可以合成單層的GQDs和帶有圓形形狀的GOQDs[71]。GQD是將GNPs和乙醇與水的混合物緩慢攪拌制得的，而GOQDs是通過改進的Hummers方法獲得。盡管GOQDs的濃度大約是GQDs的10倍，但GQDs的熒光強度大約是GOQDs的3.5倍。GQDs的藍色熒光峰(480 nm)波長比GOQDs(420 nm) 的綠色熒光峰波長短。GQDs的PLE峰值在290 nm左右，以及肩峰(從320 nm到400 nm)，而GOQDs的最大PLE強度在350 nm。

2.3 氧化石墨烯的多光子熒光

除了被廣泛報道的熒光外，GO納米片還展示了許多其他有趣的發(fā)光特性，如多光子發(fā)光。自從Li課題組報道了水合肼還原GO-PEG的上轉(zhuǎn)換發(fā)光(UCL)現(xiàn)象后，其他的一些期刊也陸續(xù)的報道了有關(guān)GO衍生物的上轉(zhuǎn)換發(fā)光[72]。例如，當(dāng)激發(fā)光從600 nm改變到900 nm時，烷基胺改性的GQDs發(fā)射波長發(fā)生了紅移，這是由兩個或多光子造成的[73]。Li和他的合作者報道了一種水熱法制備直徑為1～7 nm的含氮的GQDs，用這種方法制備的GQDs具有優(yōu)異的UCL特性。當(dāng)激發(fā)光波長從560 nm改變到900 nm時，上轉(zhuǎn)換發(fā)射峰值從415 nm轉(zhuǎn)變?yōu)?16 nm。當(dāng)激發(fā)光波長為640 nm時，最大的熒光強度出現(xiàn)在425 nm處。然而，正如許多文獻報道的那樣，中間狀態(tài)對于上轉(zhuǎn)換載體是至關(guān)重要的，而激發(fā)光通常是來自于激光的相干光子。Tan等人最近發(fā)表的評論，解釋了關(guān)于由λ/2的二次衍射光激發(fā)得到的普遍發(fā)光作為UCL的證據(jù)時可能存在錯誤[74]。Gan等人還觀察到GQDs發(fā)射強度對溫度和激發(fā)光強度具有一定的依賴性，與正常的PL相比具有相同的特征[75]。PL的熒光壽命證實了在640 nm激發(fā)下的發(fā)射衰減幾乎等同于在320 nm激發(fā)下的發(fā)射衰減。所有的研究結(jié)果表明，在氙燈激發(fā)下GQDs所謂的“UCL”應(yīng)該是在波長λ的激發(fā)光中共存的λ/2二次衍射的作用。而在脈沖激光激發(fā)下GQDs發(fā)射出的光譜才是真正的UCL。

Li及其同事開發(fā)出了一種雙光子發(fā)光的GO納米顆粒，其最大的發(fā)射峰位于590 nm，并可用于細胞成像[76]。被轉(zhuǎn)鐵蛋白(Trf)和聚乙二醇(PEG)分子修飾的GO納米顆粒對癌細胞具有靶向作用，并在細胞培養(yǎng)緩沖液中起穩(wěn)定粒子的作用。由PL強度與入射功率的擬合曲線斜率接近于2，表明該PL是由雙光子激發(fā)產(chǎn)生的。另外，7 mW低功率的超快脈沖激光足以使得活細胞中的GO納米顆粒發(fā)射出強的PL，而進過Trf改性的FITC染料則需要30 mW的功率。與此同時，Li課題組還發(fā)現(xiàn)了飛秒激光激發(fā)下的雙光子和三光子誘發(fā)的GO納米顆粒的PL[77]。當(dāng)使用飛秒脈沖激光器發(fā)射810 nm激發(fā)光時，在400～700 nm范圍內(nèi)觀察到一個雙光子發(fā)光光譜，其最大發(fā)射峰為550 nm。他們發(fā)現(xiàn)在雙光子誘發(fā)下的發(fā)射強度與飛秒激光器入射強度的平方成正比，證實其為雙光子過程。同樣地，當(dāng)GO材料被波長為1 260 nm的脈沖激光激發(fā)時，也會觀察到三光子發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)GO納米顆粒與PEG分子結(jié)合后，該材料從尾部靜脈注射入小鼠體內(nèi)，再利用一種具有深入穿透能力的雙光子成像技術(shù)觀察它們在血管中的流動、分布和清除過程。此外，GO-PEG納米顆粒也被顯微注射到轉(zhuǎn)基因小鼠的腦中，并且在位于小鼠腦中300 μm深度的納米顆粒任然可以被清楚地區(qū)分開。Gong課題組報道了一種使用二甲基甲酰胺作為溶劑和氮源的溶劑熱法，制備具有雙光子發(fā)光特性的N-GQDs[78]。在這項研究中，1 mW低功率的激光足以激發(fā)細胞中N-GQDs發(fā)射出強烈的雙光子熒光。更重要的是，N-GQD的雙光子吸收截面測量值高達48 000 GM，在組織體中使用N-GQD作為雙光子探針可以實現(xiàn)1 800 μm深度的熒光成像，這顯著的提高了雙光子成像的深度極限。

3 氧化石墨烯的熒光成像應(yīng)用

在實際的熒光成像研究中，熒光探針應(yīng)滿足一些特定條件，例如：易于激發(fā)；具有足夠高的量子產(chǎn)率；在生物體中長時間存在時應(yīng)維持其原始特性；能夠防止光漂白；具有較低的細胞毒性；具備能夠與其他分子結(jié)合的官能團，從而實現(xiàn)對目標(biāo)的靶向作用，等等。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)石墨烯衍生物作為一種新型的熒光探針能滿足這些要求，可用于生物醫(yī)學(xué)成像。

3.1 跟蹤靶向藥物和基因傳遞

伴隨著各種基于石墨烯平臺的開發(fā)，藥物的傳遞方法和直接利用光熱治療腫瘤細胞的方法逐漸被開發(fā)出來。雖然大量的研究展示了藥物遞送/治療的原位成像，但這其中的大多數(shù)研究主要是利用涂覆的無機量子點和附著在石墨烯材料上的其他熒光分子來成像的。2013年，Nahain等人提出了利用基于石墨烯的兩種rGOs和GQDs制備抗癌藥物的方法[79-80]。在平均尺寸為200 nm左右的rGO-HA(透明質(zhì)酸)共軛系統(tǒng)中，螺吡喃作為一種光致變色染料，用于制備基于石墨烯的熒光納米復(fù)合材料。值得注意的是，作者重復(fù)了這些類似的實驗，且沒有附加額外的熒光材料[79]。相反，他們利用了平均尺寸為20 nm的GQDs內(nèi)在熒光，以確定GQD-HA對理想受體的有效靶向定位[80]。通過對體內(nèi)和體外腫瘤組織熒光圖像的觀察，發(fā)現(xiàn)GQD-HA成功的結(jié)合到過度表達的CD44受體上。隨后，基于GQDs平臺的阿霉素在輕度酸性條件下得到釋放，進而可以進行癌癥的治療。盡管先前研究基于石墨烯的治療/成像應(yīng)用包括其他熒光分子，但研究人員仍在努力探索利用GQDs發(fā)光來進行原位治療。在2014年，Ge等人在高效的光動力癌癥治療中摻雜了幾個納米級的GQDs，同時也進行了熒光成像[81]。在這個研究中，作者成功地合成了具有寬吸收光譜的GQDs，并且在680 nm的范圍內(nèi)展示出了強烈的深紅色發(fā)射峰。通過體外和體內(nèi)實驗，作者清楚地證明了GQD可以被認為是最有希望的PDT劑，具有優(yōu)異的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率，光穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，甚至是同步的熒光成像。

3.2 對目標(biāo)蛋白質(zhì)的示蹤

圖6 (A)將GQD與神經(jīng)生長因子(NGF)結(jié)合的示意圖[82];(B)分子結(jié)構(gòu)的GO與轉(zhuǎn)鐵蛋白和PEG結(jié)合的示意圖[77];(C)GO與分子染料FITC的體外雙光子發(fā)光比較[76](彩圖見電子版) Fig.6 (A)Schematic illustration of conjugating a GQD with nerve growth factor(NGF) [82]; (B)a representation of the molecular structure of GO conjugated with transferrin and PEG[77]; (C)comparison of in vitro two-photon luminescence of GO with molecular dye FITC[76](color figures are available in electro-version)

利用GQD熒光同樣可以進行原位監(jiān)測和確定藥物的靶向傳遞。Zheng等人證明GQDs可以用來揭示一些重要生物學(xué)功能(圖6A)[82]。在這項研究中，通過來自于脂肪細胞內(nèi)部和循環(huán)的胰島素受體所發(fā)出的GQDs熒光來實現(xiàn)對胰島素受體的特異性標(biāo)記和動態(tài)跟蹤，作者試圖確定一些蛋白質(zhì)的相對功能。通過動態(tài)地跟蹤胰島素受體，作者發(fā)現(xiàn)胰島素受體的內(nèi)部化和循環(huán)被兩種不同的蛋白質(zhì)所調(diào)控：(1)愛佩琳(apelin)，改善胰島素敏感性；(2)腫瘤壞死因子(TNFa)，增強了胰島素抗性。雖然這項研究并沒有從根本上改變糖尿病的治療方法，但GQDs熒光技術(shù)對未來生物醫(yī)學(xué)研究細胞/亞細胞功能等方面是有所幫助的。

3.3 多光子成像技術(shù)

目前的成像方式主要是利用熒光分子，包括紫外-可見光發(fā)射(一般是400～600 nm)。然而，從非侵入性分析考慮，長波長成像研究是首選的。因為它們不僅提供了更少的破壞性分析方法，而且還能進行深層組織成像。這樣的優(yōu)勢，使得近紅外發(fā)射熒光探針受到越來越多的關(guān)注，同時也推動了帶有近紅外熒光發(fā)射的GQDs合成。然而，這些方法由于各種原因常常也會帶來一些困難，因而多光子成像被認為是一個很好的選擇。事實上，明亮的多光子熒光探針具有成像深度深、光致?lián)p傷較弱和背景熒光較小等優(yōu)勢，可以對生物樣品深層區(qū)域內(nèi)的各種細胞/子細胞活動提供更詳細的分析。多光子成像相對于單光子成像顯示出了幾個主要的優(yōu)勢：首先，只有在所期望的區(qū)域內(nèi)容易被激發(fā)，且光致漂白發(fā)生的概率較低，非線性激發(fā)模式可產(chǎn)生相對較高水平的空間分辨率。其次是多光子激發(fā)可以很好地適用于深層區(qū)域內(nèi)的組織，因為雙光子激發(fā)波長在700～1 350 nm范圍內(nèi)。2012年，Qian等人報道了平均尺寸約40 nm的PEG-GO納米顆粒在雙光子和三光子誘導(dǎo)下的體外和體內(nèi)細胞成像(圖6B、6C)[77]。

4 結(jié)束語

本文系統(tǒng)地總結(jié)了近年來GO及其衍生物的各種發(fā)光現(xiàn)象。經(jīng)過一系列的化學(xué)處理，如水熱反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等，使得GO的形貌或表面基團發(fā)生改變，從而調(diào)制GO的帶隙獲得不同的發(fā)光信號。為了進一步深入研究GO納米材料的發(fā)光機制，拓展GO材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，我們?nèi)孕枰_發(fā)量子產(chǎn)率更高、顏色更為豐富的GO發(fā)光納米材料。然而，新型GO發(fā)光材料的制備面臨幾個關(guān)鍵性的挑戰(zhàn)：首先，GO非化學(xué)計量比的結(jié)構(gòu)使其難以精確地調(diào)節(jié)其帶寬以獲得特定發(fā)光峰位的熒光。大多數(shù)文獻報道的合成方法總是會得到發(fā)射藍色熒光的GO納米材料，而將發(fā)光顏色精確地調(diào)控為綠色，黃色或紅色卻很少報道。其次，現(xiàn)有的GO熒光納米材料量子產(chǎn)率很低，特別是紅色熒光的量子產(chǎn)率更低。第三，發(fā)光GO納米材料的純化非常困難。如上一節(jié)所述，這些發(fā)光的GO納米材料通常是不同尺寸的混合，具有寬的發(fā)射光譜和不同的發(fā)射顏色。因此，當(dāng)使用其熒光作為信號輸出時，GO的復(fù)雜性會限制它們在傳感或成像方面的應(yīng)用。針對上述3個挑戰(zhàn)性的難題，我們可以借鑒一些半導(dǎo)體量子點或硅納米晶體的合成方法，利用一些自下而上的合成策略，通過控制反應(yīng)時間、溫度等參數(shù)，實現(xiàn)GO材料尺寸、帶隙、發(fā)光顏色的可控制備。具有高量子產(chǎn)率且均勻多色GO納米材料的可控甚至是宏量制備將會大大擴展其在生物成像、醫(yī)學(xué)診斷和治療等方面的應(yīng)用。

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