長時程雙光子成像技術(shù)

徐依雯，張運海，楊皓旻，劉 創(chuàng)，唐玉國

(1.中國科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇省醫(yī)用光學(xué)重點實驗室，江蘇 蘇州 215163；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

1 引 言

雙光子顯微鏡是非線性光學(xué)顯微鏡中應(yīng)用最廣泛的一種[1]，在雙光子熒光顯微鏡成像時，熒光分子必須同時吸收兩個長波長光子才能達到激發(fā)態(tài)，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，實現(xiàn)成像[2]，因此雙光子成像對激發(fā)光的光子密度要求很高，只有焦點及其附近非常小體積內(nèi)的熒光分子能夠被激發(fā)，這種激發(fā)特性使得雙光子具有極高的三維分辨率[3-4]。由于雙光子采用近紅外波段的激發(fā)光，波長較長，穿透性好，在某些生物樣本如血管中成像深度甚至能超過1 mm[5]，對細胞的光毒性也小，非常適合用來觀察活細胞甚至活組織[6]。雙光子顯微鏡因其低光毒性、大成像深度和高三維分辨率的優(yōu)勢成為生物醫(yī)學(xué)及藥學(xué)領(lǐng)域重要的研究工具[7-8]，被廣泛用于神經(jīng)、血管以及腫瘤等相關(guān)方面的研究[9-11]。

在雙光子顯微成像中，雖然長波長光的光毒性較弱，光漂白也局限于焦點處，但是由于高數(shù)值孔徑物鏡和窄激光脈寬等原因，聚焦光斑處光功率密度極高，焦平面的熒光分子仍然會發(fā)生嚴重的熒光漂白[12]。Alexander Hopt等人的研究表明，激光造成的光損傷與激光脈沖寬度成反比，即激光脈寬越窄，對熒光分子的光損傷越大[13]。雙光子成像為了保證激光光子密度，通常采用飛秒激光器作為光源，脈寬幾百飛秒的短脈沖激光會帶來非常嚴重的熒光漂白，影響了雙光子長時間成像所取得的熒光圖像質(zhì)量，研究降低雙光子成像時熒光漂白的技術(shù)顯得十分重要。

熒光團發(fā)射熒光時必然伴隨熒光漂白，漂白過程的快慢及嚴重程度取決于熒光團本身的光學(xué)化學(xué)性質(zhì)以及光照劑量，從這兩點出發(fā)，有許多限制光漂白的方法，比如改進培養(yǎng)基以減少背景熒光從而降低激發(fā)光強[14]，再比如減少樣本氧氣含量以減少氧化物的產(chǎn)生，或者添加化學(xué)穩(wěn)定劑提高熒光團抗漂白能力[15]等。從成像技術(shù)角度來說，直接減少光照劑量是緩解熒光漂白問題最直接有效的途徑。減少光劑量并不意味著直接降低光強或縮短照明時間，否則無法獲取足夠的有效熒光信號，所取圖像變得模糊。Manders等人提出一種單光子共聚焦閉環(huán)控制技術(shù)CLEM[16]，對不同濃度的熒光團施加不同的光劑量，最大限度降低了單光子共聚焦成像的熒光漂白，但其閉環(huán)循環(huán)條件是根據(jù)多次實驗經(jīng)驗得出的，對于不同的樣本需要重新實驗摸索。

本文提出了一種降低熒光漂白的雙光子成像新技術(shù)——優(yōu)化光照的雙光子(Optimized Lighting-Two Photon,OL-TP)成像技術(shù)。利用預(yù)掃描取得的傳統(tǒng)雙光子圖像，分析高低閾值，并以此閾值為標準，優(yōu)化雙光子成像時同一幅圖像上不同區(qū)域的光照時間，在保證信噪比的同時降低熒光漂白。

2 優(yōu)化光照的雙光子原理與實現(xiàn)方法

2.1 優(yōu)化光照的原理

雙光子成像對激光光子密度要求很高，極高的光子流量大大提高了雙光子成像焦點范圍內(nèi)熒光分子與光子發(fā)生相互作用的概率[17]。Patterson等人的研究表明，雙光子激發(fā)的熒光漂白率與激發(fā)光入射光強成高階指數(shù)關(guān)系，而單光子激發(fā)的熒光漂白率與入射光強成線性關(guān)系，雙光子成像對焦平面的熒光漂白遠超單光子成像[18]。以作用于樣本激光功率3～5 mW(生物成像典型光功率)為例，當雙光子激光脈寬為150 fs時，對焦平面而言，雙光子成像造成的熒光漂白是單光子的10倍[18]。激發(fā)光強和光照時間是雙光子熒光漂白的主要影響因素，所以通過優(yōu)化光照來降低雙光子熒光漂白的方法具有很大的可行性。

雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)與共聚焦激光掃描顯微鏡[19]類似，屬于點掃描成像系統(tǒng)，激光經(jīng)物鏡聚焦后只能激發(fā)焦點附近一小片區(qū)域的熒光，以焦平面光斑與樣本相對位移收集熒光信號并獲取圖像，常用點擴散函數(shù)[20](Point Spread Function,PSF)描述掃描樣本的光斑，其直徑可由式(1)計算：

(1)

本文實驗中使用的激發(fā)光波長λ=780 nm，數(shù)值孔徑NA=1.4，光斑直徑d=660 nm，根據(jù)奈奎斯特采樣定律，采樣頻率達到信號最高頻率的兩倍才能完整保留原始信號中的信息，實際應(yīng)用中應(yīng)大于兩倍，所以本文實驗中將采樣間隔(物方像素尺寸)設(shè)為60 nm。由于焦點光斑的直徑遠大于像素尺寸，光斑停留在某一個像素內(nèi)時，周圍多個像素都處于光斑照射范圍內(nèi)。

傳統(tǒng)雙光子成像技術(shù)，激光光強恒定，成像區(qū)域內(nèi)各點的光照時間完全相同，所以激光強度必須合理設(shè)置，既不能太強也不能太弱，太強會使熒光分子密集區(qū)域熒光過強，引發(fā)熒光飽和以及嚴重的光漂白，太弱則會使熒光分子稀疏區(qū)域熒光過弱，無法在圖像上清晰呈現(xiàn)。在長時程成像時，考慮熒光漂白的影響，一般會調(diào)整激光強度使細節(jié)部分恰好能看清。這就意味著，對熒光分子稀疏區(qū)域正合適的光照時間，在熒光分子密集區(qū)域會產(chǎn)生過量的熒光信號，在圖像上表現(xiàn)為局部高信噪比，如圖1(a)所示；而在沒有熒光分子的背景區(qū)域完全無法獲得有效熒光信號，反而對周邊在光斑照射范圍內(nèi)的熒光分子造成漂白，如圖1(b)所示。

圖1 物方像素點掃描示意圖 Fig.1 Spot scanning diagram of objective pixel

生物樣本中熒光分子分布很不均勻，光照時間過剩的情況普遍存在，本文提出的優(yōu)化光照的雙光子成像方法，不改變激光強度，只在無熒光分子的背景區(qū)和熒光分子很密的強熒光區(qū)減少光照時間，從而大幅減少不必要的熒光漂白，同時又保證圖像信噪比不會降低太多。

2.2 優(yōu)化光照的雙光子成像技術(shù)實現(xiàn)方法

優(yōu)化光照時間的雙光子成像方法基本思想是：分析閾值，以閾值為標準優(yōu)化各像素光照時間以去除不必要光照。

首先，利用預(yù)掃描獲取傳統(tǒng)雙光子圖像，分析出高低兩個閾值。高閾值是圖像上每個像素內(nèi)熒光信號必須達到的信噪比要求的下限，為了判斷出位于熒光分子密集區(qū)域的像素而設(shè)置的。高閾值計算公式如式(2)所示：

(2)

式(2)中，Iu表示高閾值，I5%max為傳統(tǒng)雙光子圖像中最大5%像素值的均值，Td表示判斷時間，Tp表示像素停留時間。

低閾值是噪聲信號的上限，為了分辨不產(chǎn)生熒光信號的背景區(qū)域像素而設(shè)置。低閾值計算公式如式(3)所示：

(3)

式(3)中，Il表示低閾值，I5%min為傳統(tǒng)雙光子圖像中最小5%像素值的均值，Td表示判斷時間，Tp表示像素停留時間，IN為環(huán)境噪聲最大值。

然后，在每個像素掃描過程中不斷讀取反饋的像素值，并與閾值比較。根據(jù)比較結(jié)果優(yōu)化各像素光照時間。每個像素開始掃描時刻記為0，首次讀取反饋的時間稱為判斷時間，記為Td；掃描光斑中心位置停留在單個像素的時間稱為像素停留時間，記為Tp；激光實際保持開啟的時間稱為像素實際光照時間，記為Te。

當激光開始掃描一個像素，先用一小段時間(判斷時間)收集熒光信息，然后開始讀取反饋并判斷該像素所在區(qū)域以及是否需要優(yōu)化光照時間，如圖2所示：當反饋小于低閾值，判斷該像素位于背景區(qū)域，立刻關(guān)閉激光；當反饋大于高閾值，判斷該像素位于熒光分子密集區(qū)域，也立刻關(guān)閉激光；當反饋始終在高低閾值之間，判斷該像素位于熒光分子稀疏區(qū)域，需接受標準時長的光照。

圖2 OL-TP像素光照時間優(yōu)化過程示意圖 Fig.2 Diagram of optimized process for pixel lighting time in OL-TP

2.3 優(yōu)化光照的雙光子重建圖像

以O(shè)L-TP方法掃描一幅圖像后得到兩組數(shù)據(jù)，一組數(shù)據(jù)代表了每個像素實際接受光照的時長，另一組數(shù)據(jù)代表了每個像素實際采集到的像素值。像素值與光照時間成線性關(guān)系，如圖3所示，I表示過程中像素值(反饋)，Ie表示實際像素值，對應(yīng)實際光照時間Te，Ip表示若該像素接受全程光照應(yīng)得的等效像素值，對應(yīng)像素停留時間Tp。

圖3 像素值與像素光照時間關(guān)系示意圖 Fig.3 Relationship between pixel value and lighting time

OL-TP重建圖像的原理就是像素值與像素光照時間的線性關(guān)系，重建OL-TP圖像的公式如式(4)所示，

(4)

式(4)中，Ip(x,y)為等效像素值，Ie(x,y)為實際像素值，Te(x,y)為像素實際光照時間，Tp(x,y)為像素停留時間。公式比較抽像，圖4用一組四像素示意圖說明重建過程，假設(shè)像素停留時間設(shè)為200 μs，判斷時間設(shè)為50 μs，高閾值設(shè)為100，低閾值設(shè)為5。

圖4(a)代表傳統(tǒng)雙光子圖像，圖中的數(shù)字表示每個像素接受200 μs光照時的像素值；圖4(b)代表像素光照時間分布圖，圖中的數(shù)字表示高閾值設(shè)為100低閾值設(shè)為5時，每個像素實際接受光照的時間，單位為μs；圖4(c)代表實際像素值分布圖，圖中數(shù)字表示對應(yīng)圖4(b)中光照時間的實際像素值；圖4(d)代表重建的OL-TP圖像，圖中數(shù)字由圖4(b)和圖4(c)根據(jù)式(4)計算得到。理想情況下OL-TP重建圖像與傳統(tǒng)雙光子圖像完全一致。

圖4 (a)傳統(tǒng)雙光子圖像；(b)像素光照時間分布圖；(c)實際像素值分布圖；(d)OL-TP重建圖像 Fig.4 (a)Conventional two-photon image; (b)distribution of pixel lighting time; (c)distribution of real pixel value; (d)reconstructed image of OL-TP

2.4 優(yōu)化光照的雙光子成像系統(tǒng)

為了實現(xiàn)預(yù)設(shè)閾值并優(yōu)化光照時間的功能，OL-TP成像系統(tǒng)比傳統(tǒng)雙光子成像系統(tǒng)增加了兩個部分，一塊FPGA(Field Programmable Gate Array)板配合放大電路構(gòu)成的反饋電路，以及一個聲光調(diào)制器(Acoustic-Optical Modulation，AOM)。AOM放置在光路中，起到高速開關(guān)的作用；反饋電路主體是FPGA，用作光子計數(shù)器，存儲高低閾值，編入反饋判斷程序，執(zhí)行比較后根據(jù)結(jié)果輸出信號，控制AOM實現(xiàn)激光的開閉。探測器采用光子計數(shù)型雪崩光電二極管(APD)，型號為SPCM-AQRH-14-FC。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖5所示。

圖5 OL-TP成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖 Fig.5 Diagram of OL-TP image system

3 優(yōu)化光照的雙光子成像實驗

在驗證OL-TP降漂白效果前，先要驗證OL-TP重建圖像的真實性。圖6(a)是傳統(tǒng)雙光子圖像，圖6(b)是在同一區(qū)域獲得的OL-TP重建圖像，需要從主觀和客觀兩個角度對重建圖像保真程度進行評價[21]。

圖6 (a)傳統(tǒng)雙光子圖像。(b)OL-TP重建圖像 Fig.6 (a)Conventional two-photon image. (b)Reconstructed image of OL-TP

主觀評價是由人眼對兩幅圖像進行觀察，其結(jié)論是這兩幅圖像相似度很高，差異性很小?？陀^圖像質(zhì)量評價方法很多，全參考評價方法是其中最可靠的評價方法，以傳統(tǒng)雙光子圖像為參考圖像，通過將重建圖像與傳統(tǒng)雙光子圖像進行比較來評價重建圖像的保真程度[22]。最簡單最高效的全參考評價方法就是峰值信噪比(PSNR)，以參考圖像的像素值為信號，待評價圖像也就是重建圖像與參考圖像的像素值差異作為噪聲，計算公式如式(3)所示，

PSNR=10×

(3)

式(3)中，圖像大小為M×N，R(x,y)是參考圖像在(x,y)處的像素值，I(x,y)是重建圖像在(x,y)處的像素值。當峰值信噪比達到30 dB以上，可以判斷噪聲對圖像的影響相當小，也就是兩幅圖像的差異性非常小。以圖6(a)為參考圖像，圖6(b)的PSNR值為39.93 dB，這說明OL-TP重建圖像保真程度較高，只是信噪比略有下降，但未對圖像質(zhì)量造成很大影響。

為驗證OL-TP成像方法降漂白效果，本文設(shè)計了一組實驗：激發(fā)光波長為780 nm，顯微鏡物鏡前光強為19 mW，物方像素尺寸為60 nm，成像區(qū)域為15 μm×15 μm，判斷時間為50 μs，像素停留時間為200 μs，成像區(qū)域內(nèi)共有250×250個像素，本文實驗中每一行從左向右掃描結(jié)束后，位移臺會回到最左邊再開始掃描下一行，換行時間與掃描時間基本相同，掃描時間加上換行時間即為本文實驗中獲取一幅完整圖像所需時間，約25 s。用傳統(tǒng)雙光子和OL-TP分別對110 nm熒光小球樣本連續(xù)取30幅圖像，將兩組圖的第一幅和最后一幅圖在同一標尺下作對比，如圖7所示。從圖7可以明顯觀察到，連續(xù)掃描30幅圖像之后，傳統(tǒng)雙光子圖像大部分區(qū)域變得非常暗，而OL-TP圖像只是整體亮度略有降低，并沒有發(fā)生明顯的光漂白現(xiàn)象。

圖7 (a)傳統(tǒng)雙光子。(b)OL-TP重建圖像 Fig.7 (a)Conventional two-photon image. (b)Reconstructed image of OL-TP

本文采用的探測器是光子計數(shù)型雪崩光電二極管，探測到的光子數(shù)代表了熒光強度，在圖像上表現(xiàn)為各像素的像素值。為了定量分析OL-TP成像方法降漂白的效果，對一幅圖像上所有像素值求和，計算結(jié)果代表一幅圖的熒光光子總數(shù)。經(jīng)計算，傳統(tǒng)雙光子組的第30幅圖像熒光光子總數(shù)為第1幅圖像的62.94%，而OL-TP組的第30幅圖像熒光光子總數(shù)為第1幅圖像的91.8%，證明OL-TP成像技術(shù)將熒光漂白降低了28.86%。

4 結(jié) 論

本文針對影響雙光子顯微成像技術(shù)長時程觀測效果的焦平面熒光漂白問題，提出了一種降低熒光漂白的雙光子成像新技術(shù)——優(yōu)化光照的雙光子(OL-TP)成像技術(shù)，它利用掃描前取得的傳統(tǒng)雙光子圖像，針對成像區(qū)域設(shè)置閾值，并根據(jù)所設(shè)閾值優(yōu)化圖像中每個像素接受的光照時間，從而極大地降低雙光子成像時對焦平面熒光分子的光漂白。

實驗證明，OL-TP對110 nm熒光小球樣本連續(xù)成30幅圖像后，整幅圖像的熒光漂白相比傳統(tǒng)雙光子圖像降低了28.86%，證明OL-TP成像技術(shù)有很好的降漂白效果，它使得雙光子顯微鏡能對成像目標同一深度的平面連續(xù)取更多高質(zhì)量圖像，極大地延長了雙光子顯微鏡有觀測時程，增強了雙光子熒光顯微術(shù)在長時程觀測生物樣本方面的優(yōu)勢。

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