雙色熒光輻射差分超分辨顯微系統(tǒng)研究

張智敏，匡翠方，王子昂，朱大釗，陳友華，李傳康，劉文杰，劉 旭

(浙江大學 光電科學與工程學院，浙江 杭州 310058)

1 引 言

光學顯微術作為一門古老的成像技術，為人們打開了一扇通往微觀世界的大門，極大地豐富了人們的視界，拓展了人類的認知邊界。隨著科學技術的不斷發(fā)展，人們對超高分辨率的顯微圖像的要求也越來越高，尤其是像生物醫(yī)學、材料科學等需要對亞百納米尺度微觀結構進行觀測和分析的領域更是如此[1]。然而由于阿貝衍射極限的存在，即便是共焦熒光顯微技術，其空間分辨率也只能達到半波長左右，無法滿足人們對于亞百納米結構成像的要求[2]。20世紀90年代，Stefan.W.Hell 提出了一種全新的可突破衍射極限的顯微方法---熒光受激輻射損耗(Stimulated Emission Depletion,STED)顯微成像技術。該方法可以將原先的極限分辨率提高4.5倍。STED技術雖然可以極大地提高顯微成像分辨率，但是其過高的損耗調制光容易發(fā)生熒光漂白，損壞生物樣品[3-4]。2012年，浙江大學匡翠方教授的超分辨顯微研究組提出了一種新的超分辨顯微技術---熒光輻射差分(Fluorescence Emission Difference,FED)顯微術。該方法是將實心光斑掃描得到的共焦圖像減去空心光斑掃描得到的負共焦圖像實現(xiàn)的超分辨顯微[5-6]，其優(yōu)勢在于僅利用單色光便可實現(xiàn)突破衍射極限實現(xiàn)超分辨顯微，另外由于其只需要激發(fā)熒光樣品發(fā)射熒光而不用進行受激輻射損耗，其光毒性和熒光漂白相比STED技術要弱很多，有利于對樣品的長期觀測。為了拓展FED顯微成像的應用能力，本文在單色FED的基礎上進一步研究并設計出了雙色FED顯微系統(tǒng)，在熒光顆粒上分別實現(xiàn)了488 nm激發(fā)光和640 nm激發(fā)光下135 nm和160 nm的空間分辨率，于此同時也對生物樣品進行了多色同時成像，滿足了同時觀測和研究生物樣品不同組織結構的應用要求。

2 原 理

熒光輻射差分顯微術的基本原理是將兩幅由不同照明光斑獲得的共焦熒光顯微圖像進行相減，即將一幅由實心激發(fā)光斑掃描得到的共焦熒光圖像減去一幅由空心激發(fā)光斑掃描得到的負共焦熒光圖像[7-11]，圖1為FED原理圖解。

圖1 FED原理圖解：(a)，(b)分別為激發(fā)的實心光斑和空心光斑的PSF三維圖；(c)，(d)為探測的實心光斑和空心光斑的PSF三維圖；(e)為FED的PSF三維圖；(f)，(g)，(h)分別為(c)，(d)，(e)的平面圖；(i)，(j)，(k)分別為(f)，(g)，(h)在虛線處的截面圖 Fig.1 Illustration of FED theory. (a)PSF of confocal excited pattern; (b)PSF of negative confocal excited pattern; (c)PSF of confocal image; (d)PSF of negative confocal image; (e) PSF of FED image; (f), (g), (h) the plane graph of (c), (d) and (e); (i), (j), (k) the sectional drawing along the dash line of (f), (g) and (h)

空心光斑由0 ～2π渦旋相位板調制產生，其調制函數(shù)如公式(1)所示[6]：

P(φ)=φ,

(1)

式中，φ為入射光束上一點位置矢量與水平方向的夾角。當調制后光束經二分之一波片和四分之一波片形成圓偏光后聚焦到焦平面時便會產生面包圈型空心光斑。最終的FED超分辨顯微圖像由公式(2)所示[5]：

IFED=Ic-γ·Ud,

(2)

式中，Ic、Id和IFED為歸一化的強度分布圖，Ic為歸一化共焦強度圖，Id為歸一化負共焦強度圖，IFED為歸一化的FED圖像強度圖，γ為小于等于1的FED校準系數(shù)。共焦圖像的點擴散函數(shù)可有公式(3)得出[5,12]：

PSFc=PSFe×PSFf?p(x,y) ,

(3)

式中，PSFc表示共焦圖像的PSF，如圖1(c)所示，PSFe表示激發(fā)光經過物鏡的PSF，如圖1(a)所示，PSFf表示熒光經過物鏡的PSF，p(x,y)表示小孔的傳遞函數(shù)。同理亦可得到圖1(d)的負共焦圖像的PSFd。兩幅圖像相減后便可得到一幅FED顯微圖像，其PSF如圖1(e)所示。

從圖1的原理解釋中可以看出，理論上，γ值越接近1，PSFFED則會越小，這就意味著其分辨率越高，然而這也就意味著通過相減得到的FED圖像的有用信息就會損失的越多，即信噪比越低。此外，目前在FED系數(shù)選擇上并沒有一個行之有效的評價標準，一般通過實際圖像效果進行主觀評判，通過多次實驗得知，γ值在0.7～0.85之間可以比較好的保證分辨率與信噪比。

3 光學系統(tǒng)與控制軟件設計

3.1 光學系統(tǒng)設計

圖2 雙色FED系統(tǒng)圖與時序圖(a)雙色FED系統(tǒng)圖，其中PBS為偏振分光鏡，PM為渦旋位相板，RM為反射鏡，DC為二色鏡，4F SM為4F掃描模塊，AL為消色差透鏡，SMF為保偏光纖；(b)系統(tǒng)CAD設計圖；(c)掃描時序圖 Fig.2 Scheme and sequence chart of dual color FED system. (a)Dual color FED system, PBS:polarizing beam splitter, PM:vortex phase mask, RM:reflect mirror, DC:dichroic beam splitter, 4F SM:4F Scanning Module, AL:achromatic lens, SMF:single-mode polarization maintain fiber; (b)CAD of the system; (c)scan sequence chart

從圖2(a)雙色FED系統(tǒng)圖中可以看出，激發(fā)光需先經過二分之一波片，保證了通過PBS后的分光比盡量達到1∶1，而未經過位相板調制的光路由于其光程相對較長，因此需要一對焦距為50 mm的透鏡組成的4F成像系統(tǒng)做中繼透鏡，保證了出射光為平行光。在調制光路部分，我們選用了Vortex Phase Plate RPC Photonics 公司的VPP-1a和VPP-m633兩種渦旋位相板來調制488 nm和640 nm激發(fā)光。為了形成圓偏光，調制光和未調制光經過一個PBS合束后仍需經過1/2波片和1/4波片。需要注意的是，激發(fā)光在經過4F掃描系統(tǒng)之前需要用一片1/4波片進行圓偏振矯正，因為激發(fā)光通過了多片二色鏡和反射鏡，其偏振狀態(tài)會受到影響，為了保證激發(fā)光的圓偏振狀態(tài)，在入射4F掃描系統(tǒng)前需進行圓偏振矯正。在該系統(tǒng)的顯微鏡架和物鏡鏡頭選擇上，我們采用了國產永新光學有限公司提供的N-900科研級顯微鏡架和Nikon公司提供的100×/1.49油浸顯微物鏡。為了滿足系統(tǒng)實時掃描成像的要求，本系統(tǒng)使用了自主設計的反射式4f電流計式振鏡掃描模塊，該模塊由1塊焦距為50 mm的掃描透鏡，2塊焦距分別為50 mm和100 mm的凹面反射鏡以及Cambridge Technology公司的8310k振鏡模塊構成，不同焦距的凹面鏡不僅可以消除色差的影響，也可在一定程度上縮小量程，使得該掃描模塊更加緊湊。

在探測路部分，我們將光纖探頭同時作為小孔以及熒光收集器，為了平衡信噪比和分辨率的要求，小孔大約為0.7個艾里斑為宜，而艾里斑的計算公式[2]為：

δ=M×1.22×λ/NA,

(4)

式中，δ為艾里斑直徑，λ為波長，NA為物鏡數(shù)值孔徑，M為系統(tǒng)放大倍數(shù)。

由488 nm和640 nm激發(fā)的熒光波長大約為530 nm和670 nm，根據公式(4)，可求出這兩種熒光在未被放大前的艾里斑直徑，大約為434 nm和549 nm。經100放大后，該艾里斑在后焦面上的大小分別為43.4 μm和54.9 μm。掃描模塊內包含了一個50 mm的掃描透鏡以及由50 mm和100 mm凹面反射鏡組成的4f系統(tǒng)，因為光纖頭的口徑被固定為62.5 μm，為了保證光纖口作為小孔大概能達到0.7個艾里斑，在探測路上分別增加一個200 mm和150 mm的消色差透鏡。最終艾里斑在探測終端的投影大小分別為86.8 μm和82.4 μm，使得小孔分別達到了0.72個和0.76個艾里斑大小，滿足匹配要求。

從原理上，可以知道，F(xiàn)ED顯微術需要分別采集兩種不同的共焦顯微圖——傳統(tǒng)共焦熒光顯微圖像和負共焦顯微圖，因此需要對樣品進行分時采樣。圖2(c)展示了分時采樣過程，首先利用實心光斑進行掃描成像，再利用空心光斑進行掃描成像，最后按照公式(2)將兩幅圖像進行相減操作便可得到FED顯微圖像。需要注意的是，因為FED原理上是實心光斑減空心光斑，所以系統(tǒng)的實心光斑與空心光斑在圖像上是要重合的。如果實心光斑和空心光斑不重合，則會導致FED的圖像重心偏移，出現(xiàn)定位誤差。因此，在調校系統(tǒng)時需要利用納米顆粒對實心光斑和空心光斑進行來回切換分時成像，通過調整光路使得實心光斑和空心光斑重合，而振鏡造成的定位誤差較小，在實際成像中可忽略。

3.2 控制軟件設計

為了能夠實現(xiàn)實時采樣和顯示，本文利用LabVIEW編寫了一套完整的控制與顯示軟件，可進行樣品的實時顯示功能。

該控制程序的主要難點有兩點，一是激光掃描的控制方法，二是多硬件同步協(xié)調。圖3為該系統(tǒng)采用的激光掃描控制算法。該方法為單向掃描控制算法，雖然執(zhí)行效率不高，但較容易實現(xiàn)，是比較常用的共焦掃描控制方法。圖4為軟件控制流程圖。

圖3 單向掃描控制波形 Fig.3 Unidirectional scan control waveform

圖4 軟件流程圖 Fig.4 Software flow chart

在多硬件同步協(xié)調上，由于FED特殊的時序要求，(圖2(c))，需要在不同圖像中來回切換實心光斑和空心光斑，為了保證不同硬件協(xié)調進行，軟件在初始設計層面上就進行了消息隊列邏輯控制，使得軟件執(zhí)行每一步都必須經過消息隊列機，以此達到硬件按照時序嚴格地進行操作，保證了時序的有效性。

4 實驗結果與分析

為了驗證系統(tǒng)的有效性，本文分別在熒光顆粒和生物樣品上進行了實驗。圖5為488 nm激發(fā)光掃描得到的熒光樣品圖像，該圖像為200 nm熒光顆粒在10 nm每像素點和500×500圖像分辨率的條件下掃描得到，先用實心光斑光束掃描得到一張共焦圖像，然后用空心光斑光束掃描得到一張負共焦圖像，將歸一化后的共焦圖像減去一張乘上FED系數(shù)為0.75的歸一化負共焦圖像便可得到一張FED圖像。

從圖5(e)可以看出，在488 nm激發(fā)光下，該系統(tǒng)的分辨率可達到135 nm，基本達到單色FED的分辨率水平。圖6為640 nm激發(fā)光下掃描得到的熒光顆粒圖像。

該樣品也為200 nm熒光顆粒，該圖像是在20 nm每像素點500×500圖像分辨率下掃描得到的圖像，其處理方法也如在488 nm激發(fā)的熒光樣品圖一樣，從圖6(e)可以看出，在640 nm激發(fā)光下，該系統(tǒng)的分辨率可以達到160 nm，也基本和單色FED系統(tǒng)一致，滿足分辨率的基本需求。

圖5 488 nm激發(fā)的熒光樣品共焦和FED圖像。(a)共焦圖像；(b)FED圖像；(c)共焦圖像虛框內局部放大圖像；(d)FED圖像虛框內局部放大圖像；(e)箭頭部分歸一化后的輪廓圖 Fig.5 Confocal image and FED image of fluorescent beads excited at 488 nm. (a)Confocal image; (b)FED image. (c, d)Magnified view of dashed region at (a) and (b). (e)Normalized outline of arrow section of (c) and (d)

圖6 640 nm激發(fā)的熒光樣品共焦和FED圖像。(a)共焦圖像；(b)FED圖像；(c)共焦圖像虛框內局部放大圖像；(d)FED圖像虛框內局部放大圖像；(e)箭頭部分歸一化后輪廓圖 Fig.6 Confocal image and FED image of fluorescent beads excited at 640 nm. (a)Confocal image; (b)FED image; (c, d)Magnified view of dashed region at (a) and (b); (e)Normalized outline of arrow section of (c) and (d)

圖7 生物樣品多色成像圖。(a)共焦圖像；(b)FED圖像；(c)共焦圖像虛框內局部放大圖；(d)FED圖像虛框內局部放大圖；(e)箭頭指向部分輪廓圖 Fig.7 Confocal image and FED image of biological structures excited at 488nm and 640nm simultaneously. (a)Confocal image; (b)FED image; (c, d)Magnified view of dashed region at (a) and (b); (e)Normalized outline of arrow section of (c) and (d)

為了驗證該系統(tǒng)在生物樣品上也有比較好的實驗效果，本文在多色生物樣品FluoCellsTMPrepared Slide #1(BPAE cells with MitoTrackerTMRed CMXRos,Alexa FluorTM488 Phalloidin, and DAPI)上進行了雙色同時成像的實驗，實驗結果如圖7所示。從圖7可以看出，與共焦相比較，雙色FED系統(tǒng)雖然會犧牲一些部分有用信號，降低了圖像的信噪比，但卻有效的提升了圖像的分辨率，可觀測樣品一些細微結構。從圖 7(e)可看出，在共焦下不能清晰分辨的微觀交叉位置，F(xiàn)ED可以有效區(qū)分開，說明在生物樣品中，雙色FED系統(tǒng)依舊可以保證有良好的雙色同時成像效果。需要注意的是，在實驗中，由于是在488 nm和640 nm兩種波段的激發(fā)光下同時激發(fā)，為了保證實驗效果，樣品染料的激發(fā)光譜不能同時涵蓋這兩種波段的激發(fā)光，不然會發(fā)生串色干擾。至此，從實驗效果來看，無論是在分辨率上還是在生物樣品上，該系統(tǒng)都取得了不錯的實驗效果，滿足實際應用的要求。

5 結 論

與共焦顯微相比較，F(xiàn)ED超分辨顯微方法能夠有效地提升圖像分辨率，實現(xiàn)超分辨顯微效果。本文中雙色FED顯微系統(tǒng)在實驗上不僅實現(xiàn)了生物樣品的雙色同時成像，還在一定程度上實現(xiàn)了超分辨的顯微效果以及降低了熒光漂白的發(fā)生概率，達到了實際應用的要求。然而，該系統(tǒng)也有些不夠完善的地方，第一是有一定的串色干擾，在實驗部分，如果選用了寬激發(fā)光光譜的染料就有可能會發(fā)生串色干擾，使得不能雙色同時成像，需要分別進行掃描成像；第二是FED系統(tǒng)由于原理上的原因，在實現(xiàn)超分辨的同時會造成一定的信息丟失，造成信噪比降低，如何權衡兩者間的平衡，選用合適的FED系數(shù)成為關鍵，而每一張不同的樣品圖則需要調整FED系數(shù)使其達到平衡，如何根據圖像自動調整FED系數(shù)有待進一步深入研究。

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