細胞內(nèi)單顆粒示蹤技術(shù)的進展

王德江，狄香君，王寶明，王 帆，郭智勇，金大勇*

(1.悉尼科技大學 生物醫(yī)學材料及儀器研究所，澳大利亞 悉尼 2007;2.西南石油大學 機電工程學院，四川 成都 610500)

1 引 言

細胞是生物體基本的結(jié)構(gòu)和組成單位，了解細胞功能復雜性首先要清楚細胞內(nèi)分子和顆粒的動力學特征。在活細胞中，分子和顆粒的運動具有時空多樣性，因此要分析它們的具體特征需要對其進行高時空分辨率的長時間追蹤。在過去的30多年里，各種各樣的技術(shù)被用于探究細胞內(nèi)分子和顆粒的動力學特征，其中，光漂白后的恢復技術(shù)(Fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAP)[1-2]和熒光相關(guān)光譜技術(shù)(Fluorescence correlation spectroscopy，F(xiàn)CS)[3-4]被人們廣泛使用。FRAP技術(shù)是將熒光標簽與靶分子偶聯(lián)，然后用強激光束小范圍內(nèi)照射帶有標簽的分子，被激光束照射的部分會發(fā)生熒光漂白現(xiàn)象，當激光照射停止后，該范圍內(nèi)的熒光強度被記錄下來，而周圍環(huán)境中的熒光分子由于布朗運動會擴散至漂白區(qū)域，通過計算該區(qū)域內(nèi)隨時間而變化的熒光強度，可以得到靶分子的擴散速率[5]。FRAP可以用于探究細胞膜上蛋白質(zhì)的運動[1]和細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動力學[2]。而FCS則是通過測定由于粒子進出微小的檢測體積而造成的熒光信號的漲落來獲取粒子的動態(tài)參數(shù)，如擴散系數(shù)，以及通過Stokes-Einstein方程計算分析物濃度，流體力學半徑[6-7]。FCS也可以用于活細胞內(nèi)的動力學研究[3-4]。盡管FRAP和FCS可以實時的監(jiān)測活細胞內(nèi)快速的動態(tài)過程(時間分辨率小于毫秒)，但是空間分辨率存在衍射極限的限制。此外，F(xiàn)RAP和FCS只能提供分子的平均信息，不具有功能上的異質(zhì)性。

另一種既具有高時間分辨率也能達到高空間分辨率的方法是單顆粒示蹤技術(shù)(Single Particle Tracking，SPT)。利用SPT技術(shù)，研究人員可以獲得FRAP和FCS不具備的信息，因為SPT是在納米精度上精確地定位每個單獨的顆粒，并測量其個體動力學作為時間的函數(shù)，而不是在一定時間內(nèi)整體的平均水平。SPT技術(shù)起源于20世紀80年代，Brabander課題組第一次在活細胞內(nèi)觀察到大小為40 nm的膠體金顆粒[8-9]。將膠體金顆粒附著于靶分子上，借助具有視頻功能的微分干涉差顯微鏡，通過連續(xù)記錄獲得顆粒中心的空間坐標。該方法比較簡單，常用來追蹤細胞膜上分子或顆粒的動態(tài)過程[10]。但是金顆粒尺寸比較大，常常會影響細胞內(nèi)生物分子正常的生理功能。1993年，關(guān)于熒光顯微鏡的研究取得重大突破：可以在室溫條件下檢測單分子[11]，該技術(shù)推動了SPT的發(fā)展，熒光分子和熒光蛋白逐漸作為SPT的分子標簽[12-13]。1996年，使用有機染料作為熒光標簽，可以在合成膜上觀察脂質(zhì)的運動[14]。2000年，能夠在活細胞內(nèi)觀察到信號受體和脂質(zhì)的運動[12,15]。2003年，Dahan第一次使用量子點(QDs)作為熒光標簽，在活細胞膜上追蹤單個甘氨酸受體的擴散過程[16]。自此，量子點廣泛用于SPT技術(shù)，例如細胞膜以及細胞內(nèi)動態(tài)過程的追蹤[17-20]，最近也用于腦切片中分子表面動力學的研究[21]。在SPT中，QDs是使用最廣泛的熒光標簽，近些年也有其他幾種熒光標簽興起，例如，2011年，Sang Hwan Nam第一次在活細胞內(nèi)追蹤上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNPs)的內(nèi)吞過程，時間長達6 h[22]。

盡管SPT技術(shù)發(fā)展迅速，可以在活細胞內(nèi)監(jiān)測許多生物分子的動態(tài)行為，例如細胞內(nèi)分子馬達的運動[23-24]；細胞膜上分子的內(nèi)吞機制[25]等，這些發(fā)現(xiàn)幫助我們了解活細胞內(nèi)生物分子的時空分布。但是，大多數(shù)都是有關(guān)細胞膜的研究，對于細胞內(nèi)狹窄區(qū)域或者是更復雜的分子環(huán)境(例如細胞核，組織)則很難追蹤，因此，研究人員也在算法，光學技術(shù)以及光學材料方面不斷優(yōu)化SPT技術(shù)，從而獲得更多的生物信息。

本文主要介紹SPT技術(shù)動力學原理和其在活細胞內(nèi)的應用，首先介紹了SPT技術(shù)的基礎知識，包括單顆粒的定位，運動軌跡的重建以及數(shù)據(jù)分析，重點介紹了光學材料、顯微鏡的種類以及優(yōu)缺點，然后分析了SPT在細胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)病毒上的應用，最后給出SPT未來可能的發(fā)展方向。

2 SPT技術(shù)

2.1 動力學原理

2.1.1 運動軌跡重建

對SPT數(shù)據(jù)進行分析最主要的目的就是獲得單個粒子的運動軌跡，進而通過對軌跡分析獲得相應的生物信息，因此當高速攝像機采集到一系列連續(xù)的圖像后，需要對每一幀圖像中的顆粒進行定位，從而重建運動軌跡(圖1)。

圖1 SPT軌跡重建示意圖[27]。(a)借助PSF確定顆粒的位置; (b)只和鄰近的點進行連接; (c)按照時間順序連接形成一個軌跡; (d)對軌跡進行數(shù)據(jù)分析，提取出動力學信息 Fig.1 Schematic representation of SPT[27]. (a)Particles are localized by finding the central locations of their point spread functions; (b)localizations belonging to the same particle at different times are connected using algorithms such as nearest neighbor; (c)chronological series of linked localizations form a time series trajectory; (d)dynamic information is extracted based on a statistical analysis of the trajectories

目前常用的定位方法大多是通過點擴散函數(shù)(Point spread function，PSF)進行定位[26]，公式如下:

(1)

式中，r是點擴散函數(shù)PSF中心的距離，J1是一級貝塞爾函數(shù)，λ是入射光的波長，NA代表數(shù)值孔徑。在此基礎上，有兩種方法比較常用：質(zhì)心法[27]和高斯擬合法。質(zhì)心法比較簡單，直接計算選定區(qū)域的光斑強度，單次迭代，運算速度快，常用來追蹤過程中即時的反饋，但是由于其邊緣敏感性高，背景干擾多等因素，所以定位精確度較差。另一種方法是高斯擬和法[28]，常用的高斯曲線的公式：

(2)

式中，I0是光斑中心的強度，ω是標準偏差，因此，光斑強度的分布可以很好的用高斯曲線擬合。該方法定位準確度高，常用于超分辨成像領域，缺點是計算過程中需要反復迭代，步驟繁瑣，計算速度慢。

針對某一時間內(nèi)連續(xù)的圖像進行定位，可以得到多個點的精確位置，將各個點連接起來，即可以得到該顆粒完整的運動軌跡。但是在連接點時存在一個問題：每個點都可以和多個點連接，常用的處理辦法是只允許相鄰的點進行連接[29]。

2.1.2 運動軌跡分析

分子在細胞膜上的運動模式多種多樣，有靜止(Immobile)、正常擴散(Pure diffusion)、異常亞擴散(Anomalous subdiffusion)、局限性運動(Confined motion)以及定向運動(Directed motion)等多種類型。對運動軌跡進行分析可以清楚顆粒的運動模式并獲得相關(guān)的運動參數(shù)，例如擴散系數(shù)，運動速度，異常擴散指數(shù)，圍欄類型等。

最常用的一種數(shù)據(jù)分析方法是均方位移法(Mean square displacement,MSD)。MSD指的是在整條軌跡內(nèi)具有相同時間間隔的所有點對間距離的平均值[28-30]，因此我們可以借助MSD與時間間隔的依賴關(guān)系對運動模式進行分類，分類如下：

〈r2〉=4Dt, 正常擴散 ，

(3)

〈r2〉=4Dta, 異常擴散，

(4)

〈r2〉=4Dt+(Vt)2, 定向擴散，

(5)

圍欄運動,

(6)

正常擴散(Normal diffusion)即為布朗運動，擴散系數(shù)恒定不變，我們可以根據(jù)公式(3)的斜率得到擴散系數(shù)D；定向擴散模式(Directed motion with diffusion)是指細胞內(nèi)物質(zhì)沿細胞骨架的運動，對應公式(5)，將MSD作為時間的函數(shù)可以擬合得到一條二次函數(shù)曲線，進而可以算出擴散系數(shù)D和流速V；異常擴散模式(Anomalous diffusion)存在兩種情況，一種是顆粒受到阻礙而減速，另外一種是顆粒被捕獲并發(fā)生相互作用，如公式(4)，大多數(shù)情況下α是在0.2～0.9之間，此時屬于異常亞擴散。對異常擴散的研究可以幫助我們了解細胞膜的結(jié)構(gòu)。最后一種運動模式是圍欄運動(Corralled diffusion)，是顆粒在小范圍區(qū)域內(nèi)的運動(公式(6))。每種運動模式不是單獨存在，在一條軌跡中可能存在多種運動模式，因此我們需要將軌跡拆分成幾段，每段單獨進行MSD分析。

2.2 SPT的光學材料

在SPT實驗中，針對單顆粒的光學檢測仍然很困難，我們需要從復雜的背景信號中找到靶分子的信號，最直接的方法是將靶分子貼上標簽。理想的標簽又小又亮，既能在光學顯微鏡下看得見又不影響靶分子的生理功能[31-32]。

起初，SPT使用的是散射標簽，例如：乳膠微珠，聚苯乙烯微球，二氧化硅微粒以及金顆粒[33]。這些標簽的優(yōu)點是穩(wěn)定，既不存在光漂白現(xiàn)象，也不存在生物降解，散射面較大，因此可以長時間監(jiān)測單分子的運動(時間尺度可以達到分鐘級)，而且具有較高的時間分辨率(幀速率可達到40 kHz)和空間分辨率(1～10 nm)。然而，由于標簽的體積較大以及瑞利散射，限制了它在生物領域的應用[28]。

SPT的另一類標簽是熒光標簽。有機熒光染料可能是最小的熒光標簽，直徑在1 nm到2 nm之間，可以對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA分子等進行熒光標記，但是具有細胞毒性[27]。熒光蛋白的尺寸略大于有機染料，它可以通過基因編碼的方式整合到生物分子上，避免對生物分子進行化學修飾。然而，熒光蛋白具有光閃性[34]且穩(wěn)定性差，追蹤時間最多只有1 s，不能長時間觀察細胞內(nèi)生物分子的運動。另一個使用比較廣泛的熒光標簽是量子點(Quantum Dots，QDs)[16]，它是一種納米級的半導體，發(fā)出的波長可以隨著尺寸改變而變化，因而通過調(diào)節(jié)半導體的尺寸就可以控制其發(fā)出的光的顏色。與有機熒光染料與熒光蛋白相比，QDs具有較好的光穩(wěn)定性[35]，可以對標記的分子長時間觀察(時間尺度長達幾分鐘)，而且具有寬的激發(fā)譜和窄的發(fā)射譜，可以進行多色檢測[35]。QDs的缺點是具有光閃性[36]，大量存在無輻射的粒子[36]以及潛在的毒性[37]，因此研究人員也在努力尋找其他具有更好光學性能的標簽。

近幾年，新興起的標簽正在逐漸引起人們的關(guān)注，有碳量子點(Carbon nanodots，CDs)，納米鉆石(Nanodiamonds，NDs)，碳納米管(single-walled carbon nanotubes，SWNTs)以及鑭系摻雜的上轉(zhuǎn)換納米顆粒(lanthanide ion doped upconverting nanoparticles，UCNPs)。CDs是直徑小于10nm的碳納米顆粒，與傳統(tǒng)的QDs相比，CDs具有很多優(yōu)點，例如發(fā)光強度高，水溶性好，低毒，抗漂白能力強，因此CDs有很好的應用潛能[38-39]。NDs具有很高的光穩(wěn)定性，不存在光閃性和光漂白，可用于細胞內(nèi)長時間追蹤(長達幾小時)[40]。據(jù)報道，在同等條件下激發(fā)，NDs要比有機染料亮很多[41]。然而，NDs的激發(fā)波長是488 nm或532 nm，會對細胞造成光損傷而且組織穿透力較差[22]，此外，由于本身結(jié)構(gòu)的問題，NDs無法做特異性標記。相比之下，SWNTs則更適用于細胞內(nèi)成像，因為它的激發(fā)和發(fā)射光譜都在近紅外光譜區(qū)域，但是SWNTs長達100 nm左右，體積太大不適合做生物標簽[42-43]。UCNPs因其獨特的光學特性，逐漸引起人們的關(guān)注。它被近紅外光激發(fā)，卻發(fā)射可見光，不具有光閃性和光漂白，毒性低，最重要的是近紅外光激發(fā)不會引起細胞內(nèi)的自發(fā)熒光，也不會對細胞造成光損傷[22,44-45]。雖然與其他幾種熒光材料相比，UCNPs具有穩(wěn)定的光學性能，但是隨著顆粒尺寸減小它的發(fā)光強度也會相應減弱，因此研究人員也在嘗試用不同的合成策略改善UCNPs的性質(zhì)(例如增大發(fā)光強度并縮小顆粒大小)[46]，期望可以更好的用于生物領域。

SPT的發(fā)展與標簽庫的豐富息息相關(guān)，每種標簽都有優(yōu)缺點以及適用的范圍，研究人員應該根據(jù)研究對象，合理選擇標簽。

2.3 單分子判定原則

在SPT實驗中，我們要追蹤和分析的是細胞內(nèi)單個分子的動力學行為，所以確保研究對象是單分子極其重要。依據(jù)分子標簽和檢測方式的不同，單分子判定原則也略有差別。有以下3個原則[47]：

(1)被標記的靶分子在特定波長下發(fā)射熒光，而雜質(zhì)的散射光波長范圍很寬，可以通過更換不同的濾鏡進行區(qū)分，在多個濾鏡下均有信號的是雜質(zhì)，反之，則為靶分子。

(2)對于QDs，可以通過是否閃爍進行判斷。如果是多個QD聚合在一起，熒光強度彼此互補，很難觀察到閃爍現(xiàn)象。

(3)熒光分子存在光漂白現(xiàn)象，在發(fā)生光漂白之前，每個熒光團發(fā)射的光子數(shù)是一定的，可以統(tǒng)計每個光斑的光子數(shù)，如果數(shù)值與理論光子數(shù)一致，則說明是單分子。

滿足的條件越多，則越能確定是單分子。目前，在判定單顆粒方面還存在一定的難度，科研人員也在嘗試從多方面進行檢驗。

2.4 SPT的光學系統(tǒng)

2.4.1 單分子寬場成像

由于常用熒光分子作標簽，所以高靈敏度的檢測器也是SPT成像裝置的重要組成部分。最基本的檢測器是寬場檢測器(Wide-field detectors)[48]，多數(shù)是基于電荷耦合裝置的照相機(CCD)。寬場檢測可以提供分子的位置，軌跡，光譜等信息，既具有單分子檢測的高靈敏優(yōu)勢，又具有操作簡單，結(jié)果直觀，實時監(jiān)測的特點。按照照明方式的不同，主要可以分為落射式熒光成像，全內(nèi)反射熒光成像和大入射角光學薄層照明成像。

2.4.1.1 落射式熒光成像

在常規(guī)熒光顯微鏡基礎上安裝高靈敏度的檢測器，合適的濾鏡和高數(shù)值孔徑的物鏡以后，即可以用于單分子檢測。如(圖 2(a))，一般情況下，激光束聚焦在物鏡的后焦面上以便得到平行光束，可以在局部區(qū)域內(nèi)穿透樣品，然后將樣品發(fā)射的熒光經(jīng)濾鏡過濾，最后用CCD檢測。在CCD前面放置一個像增強器，即為ICCD[27]，時間分辨率可以達到納秒級別，但是量子效率很低(20%～50%)。其他比較靈敏的CCD有電子倍增CCD(EMCCD)[49]和科學型互補金屬氧化物半導體(sCMOS)[27]，EMCCD量子效率能夠達到90%以上，但是時間分辨率卻遠低于ICCD，而sCMOS的量子效率是70%，稍微低于EMCCD，但是幀速很高，可以達到每秒幾百幀。單光子雪崩光電二極管檢測器(SPAD)是目前新興的光子檢測器，靈敏度極高，讀出噪聲為零，可以檢測到極弱的信號，時間分辨率能夠達到微秒級，非常適合活細胞內(nèi)成像[50]。

圖2 寬場成像的方法[28]。(a)TIRF或者Epi方法的簡單裝置圖；(b)不同的照明方案，包括Epi、TIRF以及HILO Fig.2 Different optical schemes for wide-field imaging[28]. (a)Simplest implementation of Epi or TIRF mode; (b)different illumination schemes, including Epi, TIRF and HILO

2.4.1.2 全內(nèi)反射熒光成像

對于活細胞內(nèi)的SPT實驗，大多數(shù)背景干擾來自于細胞的自發(fā)熒光，所以如何減少背景干擾是當務之急，最簡單的方法就是減少照明。全內(nèi)反射熒光(Total internal reflection fluorescence，TIRF)就是利用這一原理成像(圖 2(b))。當激發(fā)光在玻璃-水界面處全反射后產(chǎn)生衰逝波，衰逝波成指數(shù)形式衰減，因此只有靠近全反射的樣品區(qū)域才會產(chǎn)生熒光，觀測深度通常在200 nm以內(nèi)，避免了細胞內(nèi)的自發(fā)熒光[51]。TIRF確保了高信噪比，并且由于基底細胞膜通常與玻璃表面接觸，因此TIRF非常適合細胞膜的研究。然而，這也是該技術(shù)的局限，因為只有基底細胞表面和質(zhì)膜下方的細胞質(zhì)區(qū)域才能被激發(fā)到。

2.4.1.3 大入射角光學薄層照明成像

大入射角光學薄層照明成像(Highly Inclined and Laminated Optical Sheet ，HILO)可以觀察到細胞內(nèi)的不同區(qū)域[52]。與全內(nèi)反射熒光不同，HILO是激光束以一個傾斜的薄層光束穿過樣品中心(圖 2(b))。因為只有細胞內(nèi)薄薄的一層被激光照射到，因此在很大程度上減少了背景噪聲，但同時該方法也限制了其在細胞內(nèi)檢測的深度，而且只能觀察到樣品的中心，在樣品的邊緣處，由于傾斜的激光束分別照在焦平面的上方和下方，導致圖像模糊。

2.4.2 共聚焦成像

圖3 共聚焦顯微鏡原理示意圖[53] Fig.3 A schematic representation of the optical path in a confocal fluorescence microscope[53]

傳統(tǒng)的寬場熒光顯微鏡在觀察細胞結(jié)構(gòu)時可以達到亞微米級空間分辨率以及較好的時間分辨率，但是無法規(guī)避掉焦平面外的熒光信號，當對樣品進行三維成像時，會導致圖像模糊。共聚焦顯微鏡解決了這個問題，激光束經(jīng)照明針孔形成點光源，然后點光源對樣品內(nèi)焦平面的每一點進行掃描，最后在探測針孔處成像，有效的消除了焦平面以外的熒光(圖3)。雖然這種方法在一定程度上提高了信噪比，但是圖像的重建需要對樣品或者激發(fā)光進行掃描，致使采集速率降低(<10幀/秒)，因此只適用于比較緩慢的動態(tài)分析。目前發(fā)展比較迅速的是轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡(Spinning-disk confocal microscopy)，不僅保留了激光共聚焦的優(yōu)點，而且還可以對樣品快速成像，專門用來解決快速的動態(tài)檢測問題，與激光共聚焦相比，圖像的采集速率可以提高一個數(shù)量級[54-55]。

2.4.3 超分辨成像

光學顯微鏡的成像系統(tǒng)存在衍射限制，即顯微鏡的分辨率具有物理極限，為了獲得更多細胞內(nèi)的細節(jié)信息，科研人員迫切需要超高分辨率的顯微鏡。發(fā)展最早的是受激發(fā)射損耗熒光顯微鏡(Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED)，一個典型的STED需要兩束光，一束為激發(fā)光，一束為損耗光，激發(fā)光照射使熒光分子被激發(fā)，損耗光則使部分處于光斑外圍的電子以受激發(fā)射的方式回到基態(tài)，而位于光斑中心的電子仍以自發(fā)熒光的形式回到基態(tài)，因此檢測器只能收集到來自光斑中心的光，從而實現(xiàn)超高分辨率。2009年，Schmidt借助STED觀察到線粒體嵴結(jié)構(gòu)，分辨率為30 nm[44]。

另一種超分辨顯微鏡是光激活定位顯微鏡(Photoactivated Localization Microscopy ，PALM)，1994年由Eric Betzig提出。當PALM用于SPT時(sptPALM)，通過激活、定位、光漂白多種可光活化的熒光蛋白子集來獲得單分子的位置信息[56]。通過探測分子的不同子集，sptPALM可以提供細胞膜在空間和時間上的異質(zhì)性[56-58]。sptPALM的缺點是熒光蛋白的光學物理性質(zhì)較差，而且，需要高轉(zhuǎn)染效率的熒光蛋白。

通用點積累納米成像(Universal Points-Accumulation-for-Imaging-in-nanoscale Topography，uPAINT)利用溶液中的熒光配體對少量的生物分子進行連續(xù)、隨機標記，然后通過傾斜照明成像[59]。該方法使用傳統(tǒng)的有機染料作為熒光標簽，因此得到的軌跡(幾十秒)要長于PALM，但是成像速度比PALM慢，而且，只適用于活細胞的體外標記。用于SPT技術(shù)中的顯微技術(shù)多種多樣，我們可以在上述顯微技術(shù)的基礎上進行改造升級，從而推動SPT的發(fā)展。

3 SPT在活細胞中的應用

3.1 細胞膜表面蛋白動力學的研究

細胞膜由磷脂層和蛋白質(zhì)組成，將細胞內(nèi)物質(zhì)與外界環(huán)境隔離并控制物質(zhì)的進出。細胞間的交流以及細胞與周圍環(huán)境的交流都是通過細胞膜上特定的蛋白質(zhì)(也叫受體)完成，但是對于細胞膜的結(jié)構(gòu)以及作用機制人們還不是很清楚。SPT的發(fā)展為研究細胞膜的結(jié)構(gòu)及表面蛋白動力學提供了便利[17]。

近些年SPT的研究結(jié)果表明，細胞膜是一個高度分層的結(jié)構(gòu)：膜隔室，筏域和由膜相關(guān)蛋白、整合蛋白的低聚物組成的部分，不同的層次在不同的空間內(nèi)發(fā)揮各自的作用[17,60-62]。細胞膜上最大的區(qū)域是“膜隔室”，由靠近細胞內(nèi)膜的肌動蛋白骨架和錨定在細胞膜骨架的跨膜蛋白組成(圖 4(a))[17,63]。1995年，Yasushi Sako和Akihiro Kusumi用乳膠微珠(直徑為210 nm)和金顆粒(直徑為40 nm)標記轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，對膜隔室的邊界進行了研究，結(jié)果表明，膜隔室確實是由膜相關(guān)的細胞骨架組成[64]。2002年，Akihiro Kusumi將熒光染料Cy3標記的不飽和磷脂轉(zhuǎn)入大鼠成纖維細胞中，觀察它們在細胞膜上的運動，發(fā)現(xiàn)它們被限制在不同的隔室內(nèi)，隔室大小在30～250 nm之間[17,55]。該發(fā)現(xiàn)解釋了為什么細胞膜上的長距離擴散速率要遠遠慢于在人造脂膜上的擴散速率，因為跨膜蛋白在膜骨架上排成一排，分子很難跨過不同的隔室邊界，以“跳躍”擴散的形式跨過隔室需要一些時間[65]。在每個隔室內(nèi)的短距離擴散則很快，可能是布朗運動。

圖4 細胞膜的分層結(jié)構(gòu)[17]。(a)膜隔室層，由肌動蛋白骨架分隔整個細胞膜形成，并且跨膜蛋白錨定在肌動蛋白骨架上; (b)“筏域”,富含膽固醇，尺寸受到膜隔室的限制; (c)由膜相關(guān)蛋白以及整合蛋白的低聚物組成，存在時間非常短 Fig.4 Three-tiered hierarchical structure of mesoscale domains in the plasma membrane[17]. (a)Membrane compartments which stem from the partitioning of the entire plasma membrane by the membrane associated actin-based membrane skeleton(fence) and TM proteins anchored to the membrane skeleton fence(pickets); (b)cholesterol-containing raft domains, with sizes limited by the membrane compartments; (c)dimers and greater oligomers of membane associated and integral membrane proteins, which might exist only transiently

第二個區(qū)域是“筏域” (圖 4(b)),由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，與細胞膜之間存在相互作用，可以被“筏”相關(guān)的受體調(diào)節(jié)[17]。2012年，Akihiro Kusumi課題組用熒光染料Cy3標記“筏”相關(guān)的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(GPI-APs)并追蹤其在CHO-K1細胞中的動態(tài)過程，發(fā)現(xiàn)GPI-APs可以在幾百毫秒內(nèi)快速形成同源二聚體筏，而且該同源二聚體筏是極其動態(tài)的結(jié)構(gòu)，存在時間短暫[66]。第三個區(qū)域由膜相關(guān)蛋白以及整合蛋白的低聚物組成，大小在3～10 nm之間(圖 4(c))。這些復合物可以與脂筏[67-68]，肌動蛋白骨架[69]等發(fā)生相互作用。同時觀察QDs標記的FcεRI和GFP標記的肌動蛋白的運動軌跡表明，肌動蛋白將FcεRI限制在了微米級的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，而且肌動蛋白可以在幾秒內(nèi)重組，因此由肌動蛋白劃分的3種結(jié)構(gòu)域的位置、維度與時間相關(guān)[67]。

正是由于細胞膜獨特的結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在膜上的運動是極其復雜的，多數(shù)情況是異常擴散。隨著分子大小不同，持續(xù)時間不同，擴散也隨之改變[17,63,70]。Fujivara認為，分子在細胞膜上以受限運動和跳躍式的擴散形式在運動[65]。但是，Stefan Wieser用單分子熒光顯微鏡追蹤活細胞T24膜上GPI錨定蛋白CD59時，并沒有觀察到直接的跳躍式擴散[71]。因此，SPT的發(fā)展將幫助我們獲得更多的細節(jié)信息，不同課題組提出不同的觀點，使研究更加深入。

除此之外，科研人員也利用SPT技術(shù)對細胞膜上的受體進行研究，例如甘氨酸，表皮生長因子受體(EGFR)，GABA，人表皮生長因子受體-2(HER2)，神經(jīng)生長因子(NGF)，干擾素，不同的跨膜蛋白和水通道蛋白等[72]。基于金納米顆粒的SPT技術(shù)用來追蹤β3-干擾素[73]和EGFR[74]。2017年，Kuangcai Chen利用示差—微分干涉差顯微鏡實現(xiàn)了5D SPT，追蹤轉(zhuǎn)鐵蛋白—金納米棒在人肺癌細胞A549細胞膜上的運動，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白—金納米棒在做橫向擴散運動，同時又在做自旋運動[25]。

3.2 細胞內(nèi)信號通路和分子轉(zhuǎn)運機制的研究

信號通路是指能將細胞外的分子信號經(jīng)細胞膜傳入細胞內(nèi)并發(fā)揮效應的一系列酶促反應通路。這些細胞外的分子信號也可叫做配體，當配體特異性結(jié)合在細胞膜或者細胞內(nèi)受體后會引起細胞內(nèi)的信號傳導過程，因此了解膜蛋白活化后的內(nèi)化和轉(zhuǎn)運機制對于理解信號通路至關(guān)重要。通過對QDs進行修飾，并作為配體與細胞膜上的受體結(jié)合從而激活通路，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)運以及內(nèi)化過程的觀察[75-76]。Dhiraj Bhatia將QDs包裹在DNA多面體中，從而可以定量地修飾上配體(例如葉酸，半乳糖苷凝集素-3)，追蹤了細胞的內(nèi)吞途徑[77]。Sang Hwan Nam等人第一次在單囊泡水平上觀察UCNPs的內(nèi)吞過程，追蹤時間長達6 h，發(fā)現(xiàn)UCNPs內(nèi)吞后存在3種運動方向：(1)受動力蛋白影響的UCNPs，運動方向從細胞質(zhì)向核周區(qū)；(2)受驅(qū)動蛋白影響的UCNPs，運動方向從核周區(qū)向細胞質(zhì)；(3)還存在一些UCNPs，具有雙向運動的特點[22]。

SPT技術(shù)也可以用于探究細胞內(nèi)不同分子的動力學特征，例如對分子馬達的追蹤[23-24,78]，F(xiàn)akhri課題組用SWNTs標記COS-7細胞內(nèi)的驅(qū)動蛋白，觀察到驅(qū)動蛋白運輸過程中的新型運動模式—一種主動的隨機“攪拌”模式[79]。David M. Warshaw用兩種具有不同發(fā)射光譜的QDs標記同一個肌球蛋白的兩個頭部，發(fā)現(xiàn)當肌球蛋白在肌動蛋白絲上運動時，它的兩個頭部以72 nm的步長交替出現(xiàn)在肌動蛋白絲上，而且，在停止運動時，頭間距為36 nm，這說明肌球蛋白在肌動蛋白絲上的運動模式是兩頭交替運動式(Hand-over-hand)[18]。Nan等人用QDs追蹤人類肺癌細胞A549中的馬達蛋白，發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白和動力蛋白在微管上運動時步長為8 nm，然而有時候還能觀察到步長為16 nm或者24 nm的情況，可能是因為多個馬達蛋白在運輸同一個物質(zhì)時存在相互合作[19]。

圖5 單個QD-驅(qū)動蛋白在活細胞內(nèi)的運動[20]。(a)Hela細胞的明場圖像；(b)將連續(xù)的600幀圖像疊加得到的最終圖像，線性軌跡表示單個QD-驅(qū)動蛋白做定向運動(實心箭頭)，空心箭頭表示的是其他一些QD-驅(qū)動蛋白做隨機運動 Fig.5 Single QD-kinesin motions in a living cell[20]. (a)Bright-field image of a HeLa cell; (b)image obtained by superimposing the 600 consecutives frames in the image sequence. The linear traject-ories are indicative of directed motions of individual QD-kinesin. Examples are marked by the full arrows. The trajectories of diffusing QD-Ks(marked by empty arrowheads) have a random shape in the superimposed image

將SPT技術(shù)與超分辨成像結(jié)合可以觀察細胞內(nèi)微管的運輸[80]以及細胞器內(nèi)蛋白復合物的動態(tài)組織過程[81]。Yoo等人將Anti-Tubulin抗體修飾的QDs轉(zhuǎn)入到細胞內(nèi)并與微管結(jié)合，發(fā)現(xiàn)anti-tubulin-QDs向前或向后運動，平均速度為50.3 nm/s，揭示了微管的動態(tài)運動[82]。Courty用QDs標記Hela細胞內(nèi)的驅(qū)動蛋白，發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白在微管上做定向運動(圖5)，平均速率是(0.57±0.02) μm/s[20]。據(jù)nature報道，Alex M.Valm利用共聚焦顯微鏡和柵格激光層照顯微鏡(lattice light sheet microscope)實現(xiàn)了對細胞器(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，溶酶體，過氧化物酶體，線粒體和脂滴)數(shù)量、體積、速度、位置以及動態(tài)膜接觸的觀察，發(fā)現(xiàn)每個細胞器都有各自的分散特點，而且受微管和細胞內(nèi)營養(yǎng)狀態(tài)的影響，細胞器間的膜接觸處于重復循環(huán)的模式[83]。

3.3 遺傳信息表達過程的研究

SPT也用于細胞核結(jié)構(gòu)和動力學的研究，通過SPT追蹤我們了解到細胞核是一個高度復雜、擁擠的環(huán)境[84-86]，因此分子在細胞核內(nèi)的擴散也很復雜。研究人員開發(fā)了不同的光學技術(shù)以便探究細胞核的動力學，例如Levi課題組使用雙光子顯微鏡與軌道追蹤方法跟蹤細胞核內(nèi)的染色質(zhì)的運動，發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)的運動交替出現(xiàn)限制性布朗運動，快速曲線運動以及跳躍式的擴散[87]。還可以借助反光片顯微鏡(Reflected light sheet microscopy)觀察細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的動態(tài)過程，而且通過雙色-SPT可以同時觀察不同的轉(zhuǎn)錄因子以及它們的激活因子[88]。Lowe和Siegel監(jiān)測了蛋白修飾的QDs進入細胞核的過程，發(fā)現(xiàn)核孔復合物(NPC)控制顆粒進出細胞核的機制[89]：(1)胞質(zhì)絲增加了捕獲顆粒的面積；(2)運輸過程中存在大小的選擇；(3)顆粒在核孔中央通道內(nèi)的運動屬于異常亞擴散，而且顆粒表面受體越多，越容易進入細胞核；(4)中央通道在功能上是不對稱的，顆粒從中央通道進入細胞核需要Ran(小分子GTP結(jié)合蛋白)的幫助，而且Ran只存在于核表面。與SPT在細胞膜上的研究相比，對于細胞核的研究還不是很透徹，但是相信隨著光學技術(shù)的成熟，標簽庫的豐富等一些技術(shù)的快速發(fā)展，人們會獲得更多有關(guān)細胞核的細節(jié)信息。

3.4 病毒感染機制的研究

病毒是由一個核酸分子與蛋白質(zhì)構(gòu)成的非細胞形態(tài)，通過感染宿主細胞進行自我復制，但是對于病毒的感染機制還不是很清楚。近些年，SPT的發(fā)展使研究人員明確了解多種病毒內(nèi)化的機制，例如傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)[90]、包膜病毒[91]、后代偽狂犬病病毒(PrV)[92]、無包膜的腺相關(guān)病毒(AAV2)[93]等等。Liu用QDs標記H9N2病毒，發(fā)現(xiàn)流感病毒進入細胞主要有5個階段，首先病毒在細胞表面受到限制，然后慢慢地向細胞周邊區(qū)域移動，緊接著快速移向細胞核，在核周區(qū)做間歇性的運動，最后在該區(qū)域做局限運動[94]。Li Qin等人將QDs包裹在HIV-1中，追蹤HIV-1病毒感染巨噬細胞的過程(圖6)，發(fā)現(xiàn)HIV-1以網(wǎng)格蛋白介導的方式被內(nèi)吞，然后移位至內(nèi)體，最終通過病毒包膜介導的內(nèi)體融合將核酸分子釋放到宿主細胞中。他們還發(fā)現(xiàn)，HIV-1進入細胞需要內(nèi)體和肌動蛋白的協(xié)助，對內(nèi)體和肌動蛋白的抑制可以阻斷HIV-1進入細胞[95]。因此了解病毒內(nèi)吞的機制能夠幫助人們發(fā)展新型阻斷劑，有效阻斷病毒入侵人體。

圖6 HIV-1病毒侵染巨噬細胞的過程[95] Fig.6 Process of HIV-1 entry into macrophages[95]

4 結(jié)束語

SPT技術(shù)是研究活細胞內(nèi)復雜的分子動態(tài)過程的重要手段，揭示了活細胞內(nèi)生物分子的動力學特征。在過去30多年里，SPT技術(shù)的快速發(fā)展是物理、化學、材料、工程、生物等各個學科共同努力的結(jié)果。本文從基礎技術(shù)和細胞內(nèi)應用兩方面介紹SPT，在基礎技術(shù)中介紹了SPT軌跡追蹤原理，光學材料以及光學儀器，使人們了解SPT是如何實現(xiàn)對復雜的細胞內(nèi)環(huán)境進行實時的監(jiān)控并提供生物信息；在應用方面重點介紹SPT在單細胞內(nèi)的研究進展，基于這些研究，人們揭示了細胞內(nèi)分子的運輸特性，分子間的相互作用以及結(jié)構(gòu)與功能間的機制等，幫助我們更好的了解活細胞內(nèi)分子的時空分布。

雖然SPT在單細胞研究上取得了很大的成就，但是它的發(fā)展還不是很成熟，仍有許多需要完善的地方，例如在光學材料方面，我們可以對熒光蛋白進行突變，從而獲得具有更優(yōu)異的光學物理性質(zhì)的蛋白；通過優(yōu)化UCNPs的合成策略進而提高發(fā)光強度、降低粒徑；還可以將不同的熒光材料組合，例如對于一些共軛聚合物，不僅對它們的表面進行修飾，還可以將有機染料小分子包裹進去(例如NIR染料[96-97])，用于多光子檢測。更亮、更穩(wěn)定、低毒、多功能的光學材料必定會推動力SPT技術(shù)的發(fā)展。

而為了更好的利用這些新型材料，我們也需要引入更有效和更高分辨率的光學技術(shù)，例如利用寬場追蹤與超分辨的共定位測量。近幾年，應用結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微技術(shù)(SIM)可以實現(xiàn)活細胞內(nèi)二維和三維實時超分辨成像。將光片照明技術(shù)與SIM結(jié)合，實現(xiàn)了對厚樣品的三維超分辨成像和活細胞內(nèi)雙色三維快速成像，分辨率也有了很大的提高。因此將不同的成像技術(shù)例如SIM跟SPT進行組合、改造，會進一步完善SPT的光學系統(tǒng)，光學的發(fā)展可以讓我們在新的尺度上分析問題。

復雜的光學系統(tǒng)可以實現(xiàn)快速超分辨成像，同時也需要自動化的數(shù)據(jù)處理來支持。我們需要對算法進行優(yōu)化，減少計算時間，從而實現(xiàn)實時數(shù)據(jù)處理，獲得更多的細節(jié)信息，例如實時分析追蹤的顆粒數(shù)目以及顆粒所處的周圍環(huán)境等。

借助具有優(yōu)異的光學物理性質(zhì)的熒光材料，超高分辨率的光學顯微系統(tǒng)，以及自動化的數(shù)據(jù)處理，可以對細胞內(nèi)或者組織中高度局限、復雜的分子環(huán)境進行實時追蹤，從而獲得任意時間長度的3D軌跡或者是小范圍內(nèi)超多個單顆粒的運動軌跡。同時，還可以將SPT擴展到其他領域，例如化學、物理等學科。最近報道用SPT探究自由基的聚合機理[98]以及納米材料中的擴散、吸收、分配以及測量的動力學問題[99]。了解納米材料合成以及運輸機制可以幫助我們設計出先進的材料體系，進一步推動SPT的進步。

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