MTT法檢測灰直紋螟-青錢柳蟲茶對腫瘤細胞體外增殖抑制作用

曾昭華，楊茂發(fā)， 2* ，楊再華

(1.貴州大學 昆蟲研究所/貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 煙草學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省林業(yè)科學研究院，貴州 貴陽 550011)

蟲茶是我國特有的林業(yè)資源昆蟲產(chǎn)品，是由特種昆蟲取食特種植物后的排泄物制成[1-2]。因此，蟲茶資源包括產(chǎn)蟲茶昆蟲和寄主植物兩部分，灰直紋螟-青錢柳蟲茶(以下簡稱“蟲茶”)的產(chǎn)茶昆蟲為灰直紋螟Orthopygiaglaucinalis(Linnaeus)，寄主植物為青錢柳Cyclocaryapaliurus(Batal)?；抑奔y螟，別名灰雙紋螟、黃條谷螟、谷粗喙螟、黃邊褐縞螟、干果螟，屬鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)螟蛾亞科(Pyralinae)直紋螟屬Orthopygia[3-4]；青錢柳Cyclocaryapaliurus(Batal) 又名青錢李(江西)、甜茶樹(貴州)、一串錢(湖北)，隸屬胡桃科Juglaruiaceae青錢柳屬Cyclocarya，是我國特有的單種屬植物，也是國家重點保護瀕危植物之一[5]。

蟲茶，作為茶文化中的奇葩與茶中奇珍，在湖南城步蟲茶被稱為“茶精”，而在廣西龍勝則俗稱為“龍珠茶”[6]。蟲茶是一種集營養(yǎng)保健和藥用價值于一體的保健飲料。蟲茶中含有粗蛋白、粗脂肪、糖類、單寧、維生素、咖啡因等營養(yǎng)物質[7-8]，還含有人體所需的18種氨基酸[9]，其中必需氨基酸8種，這些均與優(yōu)質茶葉并無多大差異。更可貴的是，蟲茶還含有黃酮類、昆蟲激素和凝血酶原以及磷、鐵、鋅、銅等多種微量元素[10-12]，這是任何優(yōu)質茶葉無法比擬的。

乳腺癌和胃癌是人類最主要的兩大癌癥疾病，全世界每年約有120萬女性患乳腺癌，其死亡人數(shù)高達50萬，隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，女性生活方式的顯著改變，患乳腺癌的人數(shù)呈逐年上升趨勢，但發(fā)病年齡逐漸降低。我國每年因胃癌死亡的人數(shù)居所有患癌死亡人數(shù)的首位(約占23.2%)[13-14]。目前，臨床主要采用手術切除、化學藥物和放射性三種方法治療癌癥，但無論哪種治療方法都有一定的局限性，無法達到理想的治療效果。因此，發(fā)掘具有抗癌作用的藥物在醫(yī)學上備受關注。據(jù)報道，蟲茶有一定的抗癌效果，但不同蟲茶品種及其對不同癌的效果差異較大，鑒于此，本實驗擬采用MTT法檢測灰直紋螟-青錢柳蟲茶分別對MCF-7和SGC-7901腫瘤細胞增殖的抑制作用，為獲得高效、低毒、安全的抗腫瘤藥物提供科學的理論依據(jù)，同時也為蟲茶產(chǎn)品的開發(fā)利用拓展更廣的應用領域。

1 材料與方法

1.1 蟲茶的制備

將野外采集的青錢柳嫩葉自然風干，然后放在紫外燈下殺菌，之后用于飼養(yǎng)灰直紋螟幼蟲。收集其幼蟲所排的代謝物，分別用14目、20目、30目、50目篩網(wǎng)進行依次篩選分離，由于幼蟲不同齡期所排代謝物大小不同，經(jīng)過不同規(guī)格篩網(wǎng)篩選分離后會獲得不同大小的蟲茶成品。將收集的蟲茶成品放入60℃鼓風干燥箱內(nèi)烘干后除塵，再用紫外燈殺菌后真空密封冷凍(-20℃)保存。

1.2 蟲茶樣品

蟲茶：稱取200 g蟲茶用沸水提取3次，混合3次的蟲茶提取液裝入培養(yǎng)皿中，然后把培養(yǎng)皿放入冷凍干燥機中干燥，最后收集脫水干燥后的粉末作為蟲茶樣品冷凍(-80℃)保存?zhèn)溆?。稱取0.05 g蟲茶樣品溶解于10 mL培養(yǎng)基中作為母液，然后吸取母液逐一稀釋成所需要的樣品濃度。

1.3 癌細胞株

人乳腺癌MCF-7和胃癌SGC-7901細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.4 主要試劑

高糖DMEM(Hyclone 公司，美國)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，中國)；0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司，美國)；青鏈霉素(索萊寶公司，中國)；PBS緩沖液(北京鼎國昌盛生物公司)；3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)(Solarbio公司，美國)；二甲基亞砜(DMSO)(Amresco公司，美國)。

1.5 主要儀器設備

Marin Christ Alpha 1-2 plus 冷凍干燥機(Marin Christ公司，德國)；Thermo 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoFisher Scientific公司，美國)；Thermo全波長讀數(shù)儀 Multiskan GO(ThermoFisher Scientific公司，美國)；生物安全柜(Telstar Technologies公司，西班牙)；離心機(Sigma公司，德國)；Motic 倒置顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司，中國)。

1.6 試驗方法

1.6.1MTT法檢測蟲茶對人乳腺癌細胞MCF-7體外增殖抑制試驗 將人乳腺癌細胞MCF-7體外培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃充分濕化條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取指數(shù)期生長的細胞，先用高糖DMEM完全培養(yǎng)基將細胞配置成單個細胞懸液；然后采用倍比稀釋法，調節(jié)細胞的濃度為5×104個/mL；最后將調節(jié)好濃度的細胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL。將接種細胞的96孔板放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，吸出舊培養(yǎng)基，處理組每孔加入150 μL含有梯度濃度100、200、300、400和500 μg/mL的蟲茶樣品培養(yǎng)基，每組梯度濃度設10個重復孔，同時分別設有調零孔和對照組(CK)，把加好樣的96孔板置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、36 h、48 h、72 h，不同時間處理實驗獨立重復3次實驗。每組時間處理完畢后每孔加入10 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心棄掉上清液，然后每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min 后在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量每孔的OD值。根據(jù)公式計算蟲茶對腫瘤細胞的增殖抑制率(Cell viability inhibition)：

細胞增殖抑制率(%) = (OD對照組-OD實驗組)/(OD對照組- OD空白組) ×100%

其中，空白組(blank)及為調零孔僅含有培養(yǎng)基沒有接種細胞，對照組(control)用DMEM 完全培養(yǎng)基按正常方法培養(yǎng)細胞，其余作為蟲茶實驗組(treated)。

1.6.2MTT檢測蟲茶對人胃癌細胞SGC-7901體外增殖抑制試驗 將人胃癌細胞SGC-7901體外培養(yǎng)于高糖DMEM(含10%滅活胎牛血清和1%雙抗)中。置于5%CO2、37℃充分濕化條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗處理和計算方法同1.6.1。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 蟲茶對人乳腺癌細胞MCF-7、胃癌細胞SGC-7901半數(shù)抑制濃度(IC50)

表1 蟲茶對不同癌細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)Tab.1 The 50% inhibitory concentration of insect tea on different cancer cells(IC50)

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準差。

IC50是評價一種藥物在誘導細胞凋亡能力方面的重要的指標之一，由表1數(shù)據(jù)可知，蟲茶對同一腫瘤細胞在不同時間段的誘導凋亡能力不同，如對人乳腺癌細胞MCF-7，24 h后蟲茶的IC50為(887.43±1.68) μg/mL，72 h后蟲茶的IC50為(136.68±1.14)μg/mL；而對人胃癌細胞SGC-7901，24 h后蟲茶的IC50為(826.78±1.35)μg/mL，72 h后蟲茶的IC50為(187.83±1.27)μg/mL。這表明，蟲茶誘導腫瘤細胞凋亡隨著時間的延長其作用效果越明顯。同時蟲茶對不同腫瘤細胞的誘導凋亡能力并不相同，如對人乳腺癌細胞MCF-7，36 h后蟲茶的IC50為(322.17±1.42)μg/mL，48 h后蟲茶的IC50為(178.72±0.94)μg/mL；但對人胃癌細胞SGC-7901，36 h后蟲茶的IC50為(364.06±0.97)μg/mL，48 h后蟲茶的IC50為(220.35±1.21)μg/mL。由此可知處理24 h之后的各時間段，蟲茶對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖抑制效果更好。

2.2 蟲茶對人乳腺癌細胞MCF-7的影響

圖1結果表明：蟲茶對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖抑制作用與蟲茶濃度及處理時間呈正相關。從圖1A可知，蟲茶處理72 h內(nèi)蟲茶濃度和抑制率成線性關系；48 h和72 h處理內(nèi)蟲茶濃度為500 μg/mL時抑制率幾乎相等，其分別為(94.67±3.59)%和(95.18±2.48)%；由此可知一定濃度蟲茶的抑制率達到其藥效發(fā)揮的最大值時，其抑制率不會隨著時間的延長而增大，這與其他抗腫瘤藥物的特性相符。由圖1B可知：蟲茶濃度為500 μg/mL時48 h內(nèi)其抑制率和時間成線性關系，48 h后其抑制率隨時間的增加幾乎不變，由此可知蟲茶濃度為500 μg/mL時其最佳處理時間為48 h。

A-不同時間處理抑制率隨蟲茶濃度變化曲線；B-不同蟲茶濃度處理抑制率隨時間變化曲線

2.3 蟲茶對人胃癌細胞SGC-7901的影響

由圖2結果可知：蟲茶對人胃癌細胞SGC-7901的抑制率與濃度及處理時間呈正相關。從圖2A結果可知，在48 h內(nèi)蟲茶濃度為100 μg/mL至400 μg/mL時其抑制率跟濃度成線性關系，分別為(31.82±2.32)%、(42.98±1.89)%、(54.97±2.13)%和(64.78±1.86)%，蟲茶濃度為500 μg/mL時抑制率為(88.78±3.23)%，其增幅最大。圖2B結果表明：蟲茶濃度為500 μg/mL時處理48 h以前其抑制率跟處理時間呈線性關系，同時處理48 h和72 h的抑制率幾乎相等，分別為(88.78±3.23)%和(90.92±2.27)% ，即蟲茶對人胃癌細胞SGC-7901抑制的最佳濃度為500 μg/mL，最佳處理時間處理為48 h。

3 結論與討論

惡性腫瘤是目前威脅人類健康的主要疾病之一。在我國，采用傳統(tǒng)的中藥來治療惡性腫瘤的方式由來已久，相比于西藥來說，中藥在治療惡性腫瘤方面有其非常獨特的優(yōu)勢，如作用全面，有助于提高病人抵抗力并可延長病人壽命；藥性溫和，治療過程中不會給病人帶來難以承受痛苦；毒副作用小及病愈后不易復發(fā)等優(yōu)點。近些年來，為尋找新型抗腫瘤藥物，國內(nèi)外學者掀起了一場研究和開發(fā)利用中草藥的熱潮。蟲茶是我國的傳統(tǒng)中藥，明代李時珍在《本草綱目》中記載有“茶蛀蟲，此裝茶籠內(nèi)蛀蟲也，取其屎用，蛀屑聹耳出汁，繳凈，摻之……”蟲茶是最好的天然有機茶，它是動物和植物精華的結晶。蟲茶馥郁甘冽，醇香宜人，具有清熱解毒、祛暑降溫、生津止渴、順氣解表、健脾益胃、增進食欲、明目益神、除乏去膩、消除疲勞、振奮精神、涼血降壓、散瘀止血之功，對于燥熱所致的鼻衄、牙齦出血，痔瘡出血，以及增強血管彈性、韌性，降低血壓、血脂、防治心血管疾病等癥狀，均有良好的療效[15]。本實驗的結果表明，灰直紋螟-青錢柳蟲茶對人MCF-7乳腺癌細胞和SGC-7901胃癌細胞的體外增殖具有顯著的抑制作用，其抑制效果與蟲茶濃度的增加及處理時間的延長呈正相關，根據(jù)實驗結果可知灰直紋螟-青錢柳蟲茶對腫瘤細胞的增殖抑制作用與其它種類的蟲茶有相同的抑制效果甚至更好，如馮霞等[16]和Qian等[17]研究表明，蟲茶可以起到促進TCA8113人舌鱗癌細胞凋亡的作用；Zhao等[18]研究也發(fā)現(xiàn)蟲茶對小鼠頰黏膜癌具有較好的抗癌效果；張靜和趙欣[19]研究表明蟲茶對人乳腺癌細胞MCF-7生長具有相對最強的抑制效果；趙欣[20]發(fā)現(xiàn)蟲茶中粗多酚(KMICP) 能完全抑制對人肝癌SMMC-7721細胞生長；Suo等[21]研究發(fā)現(xiàn)蟲茶能誘導HepG2 人肝癌細胞的凋亡。同時鄧瀟瀟和趙欣[22]、Zhou等[23]和王睿等[24]發(fā)現(xiàn)蟲茶對小鼠胃損傷、胃潰瘍以及肝損傷具有較好的預防及治療作用；Liao等[25]通過建立動物模型研究發(fā)現(xiàn)蟲茶水提取物可降低小鼠因Ccl4誘導引起的肝損傷以及在小鼠體內(nèi)有較強的抗氧化能力。

IC50是評價一種藥物在誘導細胞凋亡能力方面的重要的指標之一?；抑奔y螟-青錢柳蟲茶對人乳腺癌細胞MCF-7和胃癌細胞SGC-7901的抑制效果并不完全相同，由本實驗結果可知，蟲茶處理48小時，對于人乳腺癌細胞MCF-7，蟲茶的IC50為(178.72±0.94)μg/mL；對于人胃癌細胞SGC-7901，蟲茶的IC50為(220.35±1.21)μg/mL。蟲茶處理72小時，對于人乳腺癌細胞MCF-7，蟲茶的IC50為(136.68±1.14)μg/mL；對于人胃癌細胞SGC-7901，蟲茶的IC50為(187.83±1.27)μg/mL。這表明，不同的腫瘤細胞對于蟲茶的敏感性具有差異，其原因很可能是由于不同的腫瘤細胞來源于不同的組織器官，它們之間具有基因表達的差異性以及不同的代謝特點，究其主要原因還需進一步的研究。

本研究結果表明：通過MTT法檢測出灰直紋螟-青錢柳蟲茶對人乳腺癌細胞MCF-7和胃癌細胞SGC-7901具有明顯的抑制作用，處理24 h后蟲茶對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖抑制比對人胃癌細胞SGC-7901的抑制效果更好?；抑奔y螟-青錢柳蟲茶抗腫瘤效果與其他種類的蟲茶具有相似之處甚至更好，這表明灰直紋螟-青錢柳蟲茶具有極大的開發(fā)潛力。本研究的結果將為后面進一步篩選不同種蟲茶針對某一腫瘤細胞具有更好的抑制作用提供科學的理論依據(jù)，同時為灰直紋螟-青錢柳蟲茶的開發(fā)打下堅實的基礎。本研究只從宏觀方面探究了灰直紋螟-青錢柳蟲茶對腫瘤細胞的體外增殖抑制作用，要摸清灰直紋螟-青錢柳蟲茶誘導腫瘤細胞凋亡過程中的信號轉導機制及獲取蟲茶的抗腫瘤活性成分還需進一步的探究。

致謝：貴州大學昆蟲研究所研究生楊佳琪在細胞培養(yǎng)方面給予了大力幫助，新西蘭奧克蘭大學博士生劉健鋒對論文提出了修改建議，在此一并表示衷心感謝！

參 考 文 獻：

[1] 許利嘉，肖 偉，劉 勇，等.茶文化中的奇葩—蟲茶[J].中國現(xiàn)代中藥，2013，15(1)：76-79.

[2] XU L J， PAN H M， LEI Q F，etal.Insect tea， a wonderful work in the Chinese tea culture [J].FoodResearchInternational， 2013，5(3)：629-635.

[3] 李后魂.河南昆蟲志，鱗翅目：螟蛾總科[M].北京：科學出版社，2009.

[4] 王平遠.中國經(jīng)濟昆蟲志(第21冊)，鱗翅目：螟蛾科[M].北京：科學出版社，1980.

[5] 謝明勇，謝建華.青錢柳研究進展[J].食品與生物技術學報，2008，27(1)：113-121.

[6] 文禮章，郭海明.關于中國蟲茶若干問題的考察報告[J].茶葉通訊，1997(3)：29-31.

[7] 尚小麗，楊茂發(fā)，白智江，等.米縞螟—白茶蟲茶的營養(yǎng)成分分析與評價[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2013(8)：17-21.

[8] 尚小麗，楊茂發(fā)，白智江，等.紫斑谷螟—白茶蟲茶的營養(yǎng)成分分析與評價[J].營養(yǎng)學報，2013，35(5)：511-513.

[9] 文禮章，郭海明，黎家文，等.三葉蟲茶的生物安全性及其主要化學成分分析[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報，1996，22(6)：75-80.

[10] 閻明真，高文韜，賈春生.柞蠶蟲茶營養(yǎng)成分的分析[J].吉林林學院學報，1998，14(2)：52-54.

[11] 許乾麗，周雪松，茅向軍.老鷹茶和蟲茶的6種生命元素分布狀態(tài)和存在形態(tài)研究[J].貴州科學，1999，17(2)：140-143.

[12] 許乾麗，孫向彤，李明炬，等.老鷹茶、蟲茶的化學成分研究[J].貴州科學，2000，18(3)：191-195.

[13] SHANG J， PENG A S.Multidisciplinary approach to understand the pathogenesis of gastric cancer [J].WorldJournalGastroenterol，2005， 11 (27)：4131-4139．

[14] LENG W， WU M S， Kakugawa Y，etal． Screening for gastric cancer in Asia：current evidence and practice [J].LancetOncology， 2008， 9 (3)：279-287．

[15] 雷 鳴，盧曉黎.中國蟲茶資源及研究現(xiàn)狀[J].食品科學，2001，22(11)：100-102.

[16] 馮 霞，羅 敏，趙 欣.蟲茶對癌細胞生長和腫瘤轉移抑制作用的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29(8)：1898-1901，1905.

[17] QIAN Y， LI G J， WANG R，etal.In vitro anticancer effects of insect tea in TCA8113 cells [J].JournalofCancerResearchandTherapeutics， 2014， 10 (4)：1045-1051.

[18] ZHAO X， WANG R， QIAN Y，etal.In vivo preventive effects of insect tea on buccal mucosa cancer in ICR mice [J].JournalofCancerResearchandTherapeutics， 2014， 10 (3)：651.

[19] 張 靜，趙 欣.不同濃度蟲茶對MCF-7人乳腺癌細胞的體外抗癌效果[J].食品研究與開發(fā)，2014，35(5)：16-19.

[20] 趙 欣.苦丁茶葉制蟲茶粗多酚的抗氧化、抗突變和體外抗肝癌效果[J].現(xiàn)代食品科技，2015，31(3)：24-28，17.

[21] SUO H Y， SUN P， WANG C，etal.Apoptotic effects of insect tea in HepG2 human hepatoma cells Los efectos apoptóticos del té de insecto en las células de hepatoma humano HepG2 [J].CyTA-JournalofFood， 2016， 14 (2)：169-175.

[22] 鄧瀟瀟，趙 欣.不同濃度蟲茶對SD大鼠的胃損傷預防效果評價[J].北京聯(lián)合大學學報，2013，27(2)：64-67.

[23] ZHOU Y L， WANG R， FENG X， ZHO X.Preventive effect of insect tea against reserpine-induced gastric ulcers in mice [J].ExperimentalandTherapeuticMedicine， 2014 (8)：1318-1324.

[24] 王 睿，孫 鵬，趙 欣.蟲茶粗多糖對四氯化碳誘導小鼠肝損傷預防效果研究[J].現(xiàn)代食品科技，2015，31(5)：6-11.

[25] LIAO Y J， ZOU X C， WANG C， ZHAO X.Insect TeaExtract Attenuates CCl4-induced Hepatic Damage Through Its Antioxidant Capacities in ICR Mice [J].FoodSci.Biotechnol，2016，25(2)：581-587.