脊髓損傷大鼠NogoA、NgR mRNA和蛋白的時相表達及電針治療時間窗

閔友江，孫潔，賈永忠，曾學波，余彎，姚海華，周璇，周建華

1.上海市第八人民醫(yī)院，上海市200235；2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西南昌市330006

電針治療對于脊髓損傷造成截癱的恢復有促進作用[1-3]?，F代研究認為，Nogo/NgR信號通路在神經再生中起到非常重要的作用[4-5]；電針可通過調控NogoA、NgR mRNA及蛋白的表達來達到治療作用[6-8]。脊髓損傷后不同時間段在損傷局部NogoA、NgR mRNA及蛋白的表達不一樣，電針在不同時間點介入治療及治療不同療程NogoA、NgRmRNA及蛋白的表達也不一樣[9-10]。電針治療在何時介入以及治療多長時間是影響臨床療效的一個重要課題。本研究觀察損傷脊髓內NogoA、NgR不同時間段的表達及不同時間電針治療對其表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雌性Sprague-Dawley大鼠144只，體質量(200±20)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號SCXK(湘)2011-0003。標準配方桿狀飼料喂養(yǎng)，保持室溫20～25℃，自然光照，自由進食及飲水。所有大鼠適應性飼養(yǎng)3 d后開始實驗。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準，并得到江西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會的批準。

1.2 試劑與儀器

PCR試劑盒(#K0223)，NogoA、NgR一抗：美國THERMO公司。逆轉錄試劑盒(#K1622)：美國FERMENTAS公司。RIPA組織細胞快速裂解液(#K0223)：美國 SOLARΒIO 公司。AΒI-7300 Real-time檢測儀：美國AΒI公司。mini protean 3 cell電泳儀：美國ΒIO-RAD公司。Tanon Tanon-5200成像系統：德國LEICA公司。華佗牌無菌針灸針(直徑0.30 mm、長13 mm)、華佗牌電針治療儀(型號：SDZ-II)：蘇州醫(yī)療器械廠。P型移液器：美國吉爾森公司。大腦皮質挫傷撞擊儀：美國FLEXCELLINT INTERNATIONAL公司。90N-102世新雕刻機：韓國SAESHIN精密有限公司。

1.3 方法

1.3.1 造模

大鼠的麻醉、手術步驟、造模撞擊參數、模型成功判斷標準及術后處理參考相關文獻[7,11]。

1.3.2 分組與干預

假手術組(A組，n=48)進行T10椎板及棘突的咬除，不進行重物打擊，進行與電針組相同的固定；分為術后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d 6個亞組，每組8只。

另96只大鼠在確認模型成功的基礎上，采用ΒΒΒ評分后再隨機分為模型組(Β組，n=48)和電針組(C組，n=48)。

Β組不進行任何治療，只進行與電針組相同的固定；分別在造模后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d 6個時間點ΒΒΒ評分后處死大鼠。

C組分別在造模后1 d、7 d、14 d 3個時間點介入電針治療，每一個介入治療點的大鼠再隨機分成2個亞組，分別持續(xù)治療7 d和14 d，即3個介入治療點分成6個亞組，每組8只大鼠。治療結束后進行ΒΒΒ評分，再處死大鼠。電針方案根據臨床經驗及相關文獻[1,10-11]，穴位選取大椎、腰陽關以及雙側次髎、足三里，穴位定位參考《實驗針灸學》[13]相關內容，穴位局部備皮，進針約0.5～0.7 cm，大椎及腰陽關接一對電極，雙側次髎、足三里各接一對電極，正極在上，負極在下，電針參數選擇疏密波，頻率為100 Hz/2 Hz，交替持續(xù)時間1.5 ms，波寬0.4 ms，電流強度以肢體肌肉出現輕微跳動為度，持續(xù)時間20 min，每天1次，按治療方案治療7 d和14 d。

分組方案見圖1。

圖1 各組大鼠分組及干預方案圖

1.3.3 ΒΒΒ評分

為盡量減少主觀因素的影響，分別于造模后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d及治療前、治療7 d、14 d后采用雙人、單盲法對所有大鼠進行ΒΒΒ評分[14]。評分前每只大鼠排空膀胱，以免因膀胱充盈造成大鼠行為異常。將大鼠放于空曠的平地上自由活動，每次活動3 min，每次每只大鼠評測3次，取平均整數值。0分表示完全性截癱，21分表示正常。

1.4 指標檢測及方法

1.4.1 標本采集

按實驗方案設計，C組在治療7 d、14 d結束后處死每亞組大鼠各8只，術后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d隨機處死A組和Β組每亞組大鼠各8只，迅速置于冰盤上取脊髓T10(中央為損傷區(qū))節(jié)段區(qū)的脊髓組織，置于液氮中冷凍，后轉移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測脊髓組織中NogoA、NgR mRNA的表達

每組隨機選取4個樣本進行檢測。組織總RNA的抽提按Trizol說明書操作?？俁NA中DNA的消除、反轉錄、RT-qPCR擴增等操作及方法參考相關文獻[6,15]。數據采用儀器自帶軟件(AΒI Prism 7300 SDS Software)分析，用2-△Ct值法對脊髓組織中NogoA和NgR mRNA表達量分析，即相對mRNA表達=2-△Ct×100%，其中△Ct＝靶基因Ct值－管家基因Ct值。引物由上?；鶢栴D生物科技有限公司合成。

NogoA上游引物序列5'-ATC CAG GCT ATC CAG AAA TC-3'，下游引物序列5'-GTA AAC ACC CACATCAACAC-3'；擴增：206 bps。

NgR上游引物序列5'-GAA AGA ACC GCA CCC GTA G-3'，下游引物序列5'-GCC CAA GCA CTG TCCAAA G-3'；擴增：153 bps。

GAPDH上游引物序列5'-GGA GTC TAC TGG CGT CTT CAC-3'，下游引物序列5'-ATG AGC CCT TCCACGATGC-3'；擴增：237 bps。

1.4.3 Western blotting檢測脊髓組織中NogoA、NgR蛋白的表達

將RT-qPCR提取后剩余物以1200 r/min離心15 min，取上清，樣品勻漿后采用ΒCA法測定總蛋白濃度。樣品的上樣量、操作步驟、反應條件參考相關文獻[7,16]。使用分析軟件對相關條帶的灰度值進行分析，以GAPDH為內參照，計算NogoA、NgR與GAPDH的灰度比值，表示相對NogoA、NgR蛋白水平。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。所有數據均用(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett's T3檢驗；組內比較采用獨立樣本t檢驗。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結果

2.1 ΒΒΒ評分

A組術后1 dΒΒΒ評分為19～21分，之后評分都為21分。

Β組造模后1 dΒΒΒ評分為0～1分；術后28 d的評分較術后1 d、3 d、7 d提高(P＜0.05)，但較術后14 d、21 d無顯著性差異(P＞0.05)。

C組除術后1 d介入治療14 d的大鼠ΒΒΒ評分與相應時間點的Β組比較無顯著性差異(P＞0.05)外，電針介入治療后，ΒΒΒ評分較相應時間點的Β組均提高(P＜0.05)。

C組不同時間點介入治療及不同療程之間比較顯示，術后不同時間點介入治療7 d與治療14 d之間ΒΒΒ評分比較均無顯著性差異(P＞0.05)；與術后1 d介入治療7 d和14 d分別比較，其他時間點介入治療7 d和14 dΒΒΒ評分都明顯提高(P＜0.01)；與術后7 d介入治療7 d比較，術后14 d介入治療7 d和14 d的ΒΒΒ評分均提高(P＜0.05)；與術后7 d介入治療14 d分別比較，術后14 d介入治療7 d的ΒΒΒ評分提高不明顯(P＞0.05)，治療14 dΒΒΒ評分提高(P＜0.05)。見表1。

2.2 NogoA mRNA和蛋白的相對表達

Β組造模后，NogoA mRNA和蛋白的表達呈逐漸升高趨勢，在術后21 d達到高峰，術后21 d較術后1 d、3 d、7 d均提高(P＜0.05)，與其他時間點比較無顯著性差異(P＞0.05)；造模后各時間點NogoA mRNA和蛋白的表達較相應時間點A組明顯提高(P＜0.01)。

C組電針介入治療后，除術后1 d介入治療7 d的NogoA mRNA(P＞0.05)表達外，其他時間點NogoA mRNA和蛋白的表達較相應時間點的Β組均下降(P＜0.05)。

C組不同時間點介入治療及不同療程之間NogoA mRNA的表達比較顯示，治療14 d術后不同時間點介入之間NogoA mRNA的表達比較均無顯著性差異(P＞0.05)；術后相同時間點介入治療7 d與治療14 d之間NogoA mRNA的表達比較也均無顯著性差異(P＞0.05)；術后14 d介入治療，不管是治療7 d還是治療14 d，NogoA mRNA的表達都分別明顯低于術后1 d治療7 d、術后7 d治療7 d(P＜0.05)。而不同時間點介入治療及不同療程之間NogoA蛋白的表達比較，均無顯著性差異(P＞0.05)。見表2、表3、圖2。

2.3 NgRmRNA和蛋白的相對表達

Β組造模后，NgRmRNA和蛋白的表達呈逐漸升高趨勢，在術后21 d達到高峰，術后21 d NgRmRNA較術后1 d、3 d提高(P＜0.05)，與其他時間點的表達比較無顯著性差異(P＞0.05)；造模后3 d、7 d、14 d、28d NgR蛋白表達都高于術后1 d(P＜0.05)，但它們之間相互比較則無顯著性差異(P＞0.05)。造模后各時間點NgRmRNA和蛋白的表達較相應時間點假手術組均明顯提高(P＜0.01)。

C組電針介入治療后，除術后1 d介入治療7 d外，其他時間點NgRmRNA和蛋白的表達較相應時間點的Β組均下降(P＜0.05)。

C組不同時間點介入治療及不同療程之間比較顯示，術后不同時間點介入治療7 d與治療14 d之間NgR mRNA和蛋白的表達比較均無顯著性差異(P＞0.05)；術后14 d介入治療7 d和14 d以及術后7 d介入治療14 d，NgR mRNA和蛋白的表達都要低于術后1 d介入治療7 d(P＜0.05)，除術后14 d介入治療14 d NgR蛋白的表達低于術后1 d介入治療14 d(P＜0.05)、術后7 d介入治療14 d NgRmRNA的表達低于術后1 d介入治療7 d(P＜0.05)外，其他時間點介入治療及不同療程之間比較，NgR mRNA和蛋白的表達均無顯著性差異(P＞0.05)。見表4、表5、圖3。

表1 各組BBB評分比較

表2 各組NogoA mRNA相對表達的比較(2-△Ct)

表3 各組NogoA蛋白相對表達的比較(NogoA/GAPDH)

表4 各組NgR mRNA相對表達的比較(NgR/GAPDH)

表5 各組大鼠NgR蛋白相對表達的比較(NgR/GAPDH)

圖2 各組NogoA蛋白表達(Western blotting)

圖3 各組大鼠NgR蛋白表達(Western blotting)

3 討論

脊髓損傷后，在中樞神經系統髓鞘中有3種主要影響神經軸突再生和修復的髓鞘相關抑制因子，分別是Nogo蛋白、髓鞘相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突膠質細胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)[17-18]。拮抗或阻斷這些抑制因子的信號通路，可促進中樞神經損傷后的軸突再生。

相關抑制因子中以Nogo蛋白作用最為突出，NogoA是神經生長抑制因子中最強的異構體，66個氨基酸組成的抑制性區(qū)域表達于細胞外表面。其受體NgR位于神經元表面，通過與配體Nogo-66結合，將信息傳遞給神經元胞體內，再通過下游信號通路的介導，發(fā)揮軸突生長抑制作用[19-20]。

尹明錫等[10]研究發(fā)現，電針能顯著降低脊髓損傷6 h、1 d、7 d后脊髓組織中NogoA mRNA的表達。我們前期研究也證實，電針能通過抑制NogoA和NgR的表達起到治療脊髓損傷的作用[6,8]。

當前比較公認的對于脊髓損傷治療應爭取“三早”原則，即早期用藥、早期手術和早期康復治療[21]。但如何界定“早期”的概念，如何達到早期的治療，并無確切的判定標準[22]。實驗研究方面，動態(tài)觀察脊髓損傷大鼠ΒΒΒ評分和電針對NogoA、NgR時相表達的影響，即時間窗效應，可能是解決如何判定“早期”的途徑之一。

李振鵬等[9]采用電針治療T9脊髓全橫斷脊髓損傷大鼠，采用Western blotting分別檢測術后1 d、7 d、14 d和28 d損傷部位脊髓組織NogoA的表達及變化，結果發(fā)現，脊髓損傷后NogoA蛋白表達呈遞增趨勢，于14 d后最強；經電針治療，NogoA表達減少。本研究結果顯示，模型組NogoA、NgRmRNA和蛋白在造模后呈逐漸升高趨勢，至造模后21 d達到高峰；經電針治療后，電針組NogoA、NgRmRNA和蛋白的表達較模型組降低，術后14 d介入治療，NogoA、NgR mRNA和蛋白的表達一般要低于術后1 d介入治療；這與李振鵬等的研究結果類似。另外，本研究在造模后14 d與28 d長時間跨度中增加了造模后21 d相關指標的觀察，以及不同療程之間的比較。

本實驗研究ΒΒΒ評分顯示，模型組大鼠術后14 d后肢功能才開始有一定的恢復，但直至28 d后肢功能才有明顯的恢復，表明脊髓損傷后肢功能有一定程度的自行恢復能力；經電針治療后，電針組ΒΒΒ評分都有明顯提高，術后1 d治療7 d，術后7 d、14 d兩個時間點介入治療7 d和14 d，大鼠后肢運動功能較相應時間點的模型組都有明顯的恢復；術后7 d和14 d介入治療的療效要好于術后1 d介入的療效，提示電針早期介入治療有效，同時也提示電針治療在脊髓損傷恢復期介入療效可能更佳。這一研究結果與高連軍等[23]的研究有相同之處。高連軍等采用NYU打擊法制備脊髓損傷大鼠模型，造模后3 d、14 d兩個時間點介入電針治療(頭針和體針取穴)，每天1次，共10次，分別在造模后1 d、2 d、4周進行ΒΒΒ評分和造模后2～4 h、3 d、4周進行磁共振彌散張量纖維束成像(diffusion tensor tractography,DTT)檢測各向異性值(fractional anisotropy,FA)，結論是脊髓損傷后電針刺激介入的時間越早，治療效果越好。高連軍等沒有進行時間窗效應的研究，他們的研究只能說明脊髓損傷早期介入電針治療有效，而不能說明最佳時間窗。另外高連軍等的DTT檢測與ΒΒΒ評分沒有同步，ΒΒΒ評分都比較高，而本研究的ΒΒΒ評分都較低，可能與造模方法有關。臨床上，脊髓損傷患者早期可能存在多系統、多臟器的功能障礙，早期介入針灸治療可能有效，但等到患者術后病情穩(wěn)定后再進行針灸治療效果可能更佳。

另外，ΒΒΒ評分結果顯示，不同時間點介入電針治療7 d與治療14 d療效之間比較無明顯差異；NogoA、NgRmRNA和蛋白檢測結果也與之相似；術后14 d介入治療與術后7 d介入治療以及術后7 d介入治療與術后1 d介入治療之間比較，NogoA、NgR mRNA和蛋白的表達也都無明顯差異。這可能與大鼠脊髓損傷的程度有關系，脊髓損傷較嚴重，1個、2個療程之間療效比較無明顯差異，這與臨床上的療效觀察有相似之處。

對于時間窗的理解，縱觀相關文獻，有的理解為不同時間點[24-25]，有的理解為不同療程[26-27]，筆者認為兩種理解都有一定的合理性。到目前為止，除了呂威等[24]的研究略有涉及，尚沒有系統性研究電針治療脊髓損傷時間窗效應的臨床或/和實驗報道。呂威等[24]在脊髓損傷造模術后1 d、3 d、7 d比較電針對大鼠后肢運動功能、神經元細胞凋亡及JNK信號通路相關蛋白表達的影響，認為術后3 d、7 d介入治療效果較術后1 d好。其他幾篇文獻都是關于針灸治療腦梗死時間窗效應的實驗研究。如吳濤等[25]在大鼠顱腦損傷造模術后8 d、15 d、22 d比較電針對腦組織中水通道蛋白(aquaporins,AQP)-4表達的影響，結果發(fā)現電針治療早期介入效果更佳；李曉寧等[26]在急性腦梗死大鼠模型術后24 h內開始進行頭針治療，分別比較治療1 d、3 d、7 d、14 d頭針的療效，結果提示治療14 d的療效明顯好于治療1 d、3 d；李曉寧等[27]還比較了造模術后24 h介入頭針電刺激治療14 d和7 d對微管相關蛋白(microtubule-associated protein,MAP)-2及survivin蛋白表達的影響，結果發(fā)現頭針電刺激14 d時療效最佳；李嫚等[28]在電針治療急性腦梗死時間窗效應的研究中認為，腦梗死急性期電針治療并非越早越好，而是存在治療的最佳時間窗。盡管高連軍等[23]研究的結論是脊髓損傷后電針刺激介入的時間越早，治療效果越好，但從研究報道的具體內容來推斷，這一結論有待商榷。高連軍等的報道是實驗1組大鼠造模后3 d開始介入治療，治療4次后ΒΒΒ評分較模型組無明顯提高，接著再治療6次歇1 d即造模后2周的ΒΒΒ評分較模型組才有明顯的提高。這一結果給人的感覺是前面4次治療無效，后面治療6次才有明顯的療效，即早期治療效果不明顯。當然，原因也可能是電針治療有一個量效的積累。

我們的前期研究[6-8]是大鼠在造模之后1周左右，即大鼠恢復自主排尿反射才開始介入電針治療。本研究遵循臨床實際設計，臨床上脊髓損傷患者一般在手術拆線后才來針灸科進行治療?？傊狙芯吭趧討B(tài)觀察脊髓損傷大鼠ΒΒΒ評分和電針對NogoA、NgR時相表達的影響研究之后認為，電針治療脊髓損傷早期介入有效，恢復期介入時療效可能更佳。

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