ELISA方法檢測豬和羊血清中甲型流感抗體的研究

王中正

摘 要：目的：用ELISA方法檢測來自安徽銅陵市、鳳陽縣及蚌埠市養(yǎng)殖場所采集的91份羊與91份豬的血清中甲型流感陽性抗體，以確定其中陽性血清和其所占總量中的比例。方法：采集的樣品在實驗室經(jīng)過冷凍離心機來分離血清，并且用ELISA法對這些血清樣品進行檢測分析，以此檢測豬和羊血清中甲型流感的抗體水平。結果：在91份羊血清樣品中檢測到3份甲型流感陽性抗體，占血清總數(shù)的3.3%；在91份豬血清樣品中檢測到21份甲型流感陽性抗體，占血清總數(shù)的23.1%。結論：說明在安徽地區(qū)，甲型流感屬部分感染且在豬中的感染率高于羊。

關鍵詞：流感病毒；ELISA試劑盒；血清抗體

中圖分類號 S858.9 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）02-0084-04

Abstract：Objective：Detecting the influenza A antibody in the serum samples which collected from 91 goats and 91 swine in Tongling，Bengbu and Fengyang of Anhui Province with ELISA method，so as to determine the existence and prevalence of positive serum in the total.Methods：Serum samples were collected with centrifuging in the laboratory，and detect the antibody levels of H1N1 flu in swine and goats' serum with ELISA method.Results：3 serum samples were influenza A antibody positive detected from 91 goats serum samples，accounting for 3.3% in the total，while 21 influenza A antibody positive were detected from 91 swine serum samples which account for 23.1%.Conclusion：There was some prevalence of influenza A in Anhui Province，and the positive rate of serum in swine was higher than in goat.

Key words：Influenza virus；ELISA kit；Serum antibody

甲型流感病毒可以感染多種家畜和家禽，曾在世界各地都有發(fā)生。2007年，菲律賓布拉干省及邦板牙部分豬場后院發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒，引起全國“紅色警報”[1]；而在我國，1957年2月首次發(fā)現(xiàn)于中國貴州西部；1977年5月在我國丹東、鞍山和天津再度發(fā)現(xiàn)新甲型（H1N1），2個月后從北向南擴散并迅速傳遍全國。甲型流感的不斷暴發(fā)，已經(jīng)引起國內(nèi)外的重視，不少實驗對其結構、防治、流行特點等做出研究。流感病毒所致病癥的差異是因病毒基因的組成不同所致，根據(jù)核蛋白（NP）和基質(zhì)蛋白（MP）的不同，分為3個類型，即甲、乙、丙型。其中，甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，其主要是通過空氣、唾液等傳播，具有傳染力強，傳播速度快等特點[2]。甲型流感病毒根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H有15個亞型（H1～H15），N有9個亞型（N1～N9）。其中感染人類的亞型有H1N1、H2N2、H3N2[3]，其他亞型可感染禽類或哺乳動物。

甲型流感病毒對各個年齡、性別和品種的豬、羊都有一定的感染能力，并且有明顯的季節(jié)性，天氣多變的秋末、早春和寒冷的冬季易發(fā)生[4]。該病初期突然發(fā)熱，體溫升高達40～41.5℃，精神不振，食欲減退或廢絕，常常橫臥在一起，呼吸困難，劇烈咳嗽，呈腹式呼吸，有犬坐姿勢，夜里可聽到病豬哮喘聲，個別病豬關節(jié)疼痛。如果在發(fā)病期治療不及時，則易并發(fā)支氣管炎、肺炎和胸膜炎等，病死率大大增加[5]。母豬在懷孕期感染，產(chǎn)下的仔豬在產(chǎn)后2～5d發(fā)病很重，有些在哺乳期及斷奶前后死亡。病死剖檢可見喉、氣管及支氣管充滿含有氣泡的黏液，黏膜充血，腫脹，時而混有血液，肺間質(zhì)增寬，淋巴結腫大，充血，脾腫大，胃腸黏膜有卡他出血性炎癥，胸腹腔、心包腔蓄積含纖維素物質(zhì)的液體。

目前針對甲型流感病毒，現(xiàn)有的檢測技術包括，病毒分離培養(yǎng)、血凝抑制（HI）與血凝（HA）試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫膠體金技術等。其中，作為檢測病毒“金標準”的分離培養(yǎng)，由于其培養(yǎng)時間長，需要一定的培養(yǎng)技術而未廣為使用；至于分子生物學檢測，大多都是針對不同亞型的特異檢測方法，對篩選所有甲型流感病毒具有一定的局限性；而免疫膠體金技術主要應用于暴發(fā)疫情初篩大量病例的快速檢測，但靈敏度較低，檢出率不高，常常受到限制[6]。本次所采用的ELISA方法敏感性高、操作簡便、快速高效、便于大規(guī)模檢測。據(jù)介紹，ELISA是Engvall等在1971年所建立的一種檢測方法，以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合的一種檢測技術。常規(guī)的ELISA測定方法分為直接法、間接法、雙抗體夾心法和競爭法[7]。在實際應用時，因該技術的不斷改進，又形成了很多分析方法，這些方法，有檢測抗原的，如測定病毒和血清抗體；有單抗介導的，有多抗介導的，還有的利用分子生物學為基礎能夠鑒別疫苗株和野毒株，在靈敏度、特異性、操作方便及快速高效等方面都有改進。除在生命科學領域得到廣泛應用，還應用于農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、畜牧業(yè)和食品加工業(yè)等。

鑒于甲型流感病毒的抗原易變性和傳播速度快，對甲型流感的檢測和防控造成很大困難，甚至嚴重威脅動物和人類的健康[8]。因此，本試驗主要用針對甲型流感所有亞型的ELISA試劑盒檢測多地區(qū)豬和羊血清中甲型流感抗體水平，及時了解甲型流感的流行狀況，為該病的綜合防控和檢測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 采自安徽省銅陵市，安徽省蚌埠市及滁州市鳳陽縣養(yǎng)殖場的豬、羊的血清。其中豬血清來源于3家養(yǎng)殖場、羊血清采自1家養(yǎng)殖場。各地區(qū)養(yǎng)殖場血清加樣的順序：地區(qū)1：G（001-091）S（1-40）、地區(qū)2：S（41-77）、地區(qū)3：S（78-91）。

1.1.2 儀器設備 酶標儀（生產(chǎn)廠家：京奕瑞祥科技有限公司）、抗凝管（生產(chǎn)廠家：山東奧塞特醫(yī)療器械有限公司）、冷凍離心機（生產(chǎn)廠家：上海赫田科學儀器有限公司）、離心管（生產(chǎn)廠家：山東萬吉塑料科技有限公司）、5mL注射器。

1.1.3 主要試劑 ELISA試劑盒（生產(chǎn)廠家：北京愛德士元亨生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 從銅陵市、鳳陽縣和蚌埠市采集豬和羊的抗凝血各91份，分別來源于3家地市級定點養(yǎng)殖場，樣品送至實驗室后進行離心，分離血清。

1.2.2 ELISA檢測 采集的血清用針對甲型流感的ELISA試劑盒進行檢測。

1.2.2.1 測定方法 （1）取出抗原包被板并在記錄表上標記好被檢樣品的位置；（2）在兩孔中分別加入100μL未稀釋的陰性作為對照；（3）在兩孔中分別加入100μL未稀釋的陽性作為對照；（4）將100μL稀釋好的被檢樣品加入相對應的孔中；（5）置于18～26℃孵育60min；（6）每孔加約350μL的洗滌液進行洗板，共需洗滌3～5次；（7）每孔加100μL酶標抗體；（8）置于18～26℃孵育30min；（9）重復第六步；（10）每孔加100μL的TMB底物液；（11）再置于18～26℃孵育15min；（12）每孔加100μL的終止液終止反應；（13）酶標空氣調(diào)0；（14）測定各孔在650nm波長處的吸光值A（650）。

1.2.2.2 結果判定 只有陰性對照平均吸光度A（650）大于或等于0.600，陽性對照的平均值S/N小于0.50，該檢測結果才能成立。如果出現(xiàn)不成立的結果，首先應該看操作是否存在問題，并重新檢測。檢測樣品中是否含有A型流感病毒的抗體由該樣品的測定值與陰性對照平均值的比例（S/N）決定：S/N小于0.60，判為A型流感病毒抗體陽性，S/N大于或等于0.60，判為A型流感病毒抗體陰性，具體加樣如表1和表2所示。

1.2.2.3 數(shù)據(jù)處理 （1）陰性對照平均值（NCx）=[孔1A（650）+孔2A（650）]/2；（2）陽性對照平均值（PCx）=[孔3A（650）+孔4A（650）]/2；（3）S/N比值=樣品值（650）/陰性對照平均值（NCx）。

2 結果與分析

2.1 S/N值測定結果 根據(jù)每個樣品的OD值測定結果，計算出每個樣品的S/N值，如表3、表4所示。由表3可以看出，從鳳陽縣養(yǎng)殖場采集的91份羊血清中共有3份為甲型流感陽性，陽性樣品分別為G41、G43、G47。由表4可以看出，從銅陵、蚌埠和鳳陽3地養(yǎng)殖場采集的91份豬血清中共有21份為甲型流感陽性：養(yǎng)殖場1中S14、S17、S18、S20、S24、S26、S31、S32共8份樣品；養(yǎng)殖場2中S56、S67、S72、S73、S77共5份樣品；養(yǎng)殖場3中S78、S80、S81、S83、S84、S85、S86、S91共8份樣品。

2.2 甲型流感陽性率統(tǒng)計結果與分析 由以上樣品的S/N值可以得出不同采樣地區(qū)豬和羊血清中甲型流感的陽性率，如表5、表6所示。由表5可以看出，在采集到的91份羊血清樣品中，有3份顯示出陽性，其陽性率為3.3%。由表6可以看出，在從3地養(yǎng)殖場采集到的共91份豬血清樣品中，有21份顯示出陽性，其陽性率為23.1%。

3 討論與小結

3.1 討論 目前，甲型流感主要在豬和禽類中間流行，而對于羊的感染率相對較低，因此對其研究較少。本研究利用ELISA方法對91份羊血清和91份豬血清的流感病毒的抗體檢測，檢測出91份羊血清樣品中甲型流感的陽性率為3.3%，91份豬血清樣品中甲型流感的陽性率為23.1%。文獻記載，李凱航等利用HI和HA的方法曾于2010年5月檢測從上海地區(qū)養(yǎng)殖場所采集到的30份豬血清的H1N1亞型的抗體水平，測定的陽性率為30%；而孫忠晟[9]也運用此法對廣東地區(qū)養(yǎng)殖場提供的豬血清樣品進行檢測，陽性率為21.7%。

實際試驗當中酶聯(lián)免疫吸附試驗方法對于流感病毒的檢測比更為簡單、靈敏和準確。該方法主要采用的是抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，進行定量測定。在試驗過程中，以下要點需要引起重視。首先，所采集到的血液樣品一定要保證新鮮，而且操作也要在無菌環(huán)境下進行。這是因為，菌體里面可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，會導致假陽性反應的出現(xiàn)；其次，一般來說，5d以內(nèi)采集到的樣品在4℃下保存，超過一周的需進行低溫保存。由于反復凍融會使抗體效價跌落，對于低溫保存的凍結血清，取出后應輕緩地充分混勻，切不可在混勻器上進行強烈震蕩；再次，試劑的準備要嚴格按照試劑盒說明書所要求配置，比如需要用到的蒸餾水或者去離子水，用于洗滌，應是新鮮的和高質(zhì)量的，加樣的時候也要注意使用微量加樣器按照規(guī)定的兩加入對應的板孔中，每次加樣都需更換槍頭，避免交叉污染；最后，在保溫的過程中，加入板孔中的樣品里不是所有的抗原都能和固相抗體結合。只有在最貼近孔壁出的才可以。這是一個逐步平衡的過程，需經(jīng)擴散才能達到反應的終點。

據(jù)相關報道，甲型流感的暴發(fā)與流行對養(yǎng)殖業(yè)會造成一定的危害，因而養(yǎng)殖生產(chǎn)者應高度重視對豬和羊（尤其是豬）流感的防控[10]。對于甲型流感所應采取的措施有如下。第一，加強源頭控制，堅決切斷污染源頭，做好養(yǎng)殖場壞境的消毒、糞便清理等工作，如疫病已發(fā)生，及時上報有關部門，進行疫區(qū)封鎖，在疫區(qū)接觸封鎖前或疫病發(fā)生后對可能殘留的病原體進行全面徹底地消毒，第二，加強過程控制和末端控制，對于可能產(chǎn)生或傳播甲型流感病毒的污染物，要求進行無害化處理；第三，針對當前我國豬流感病毒日趨復雜，亟需建立長期有效的監(jiān)測體系，以掌握豬流感病毒的流行情況，從而實施科學防控。這樣不僅減少對養(yǎng)殖業(yè)的直接經(jīng)濟損失，也可以降低出現(xiàn)新流感毒株的風險，具有十分重要的公共衛(wèi)生學意義[11]。

3.2 小結 本研究用ELISA方法檢測羊血清中甲型流感的陽性率為3.3%，豬血清中甲型流感的陽性率為23.1%，表明甲型流感在安徽地區(qū)有一定流行，應采取防重于治的原則。

參考文獻

[1]李春，宋云峰，金海林，等.豬流感病毒HA基因的原核表達及其ELISA檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學進展，2007，28（7）：35-39.

[2]劉瀟瀟，張震，初艷慧，等.北京市西城區(qū)2011年甲型H1N1流感血清流行病學調(diào)查[J].中國熱帶醫(yī)學，2012，12（3）：324-326.

[3]王善雨，高春玉，姚新華，等.甲型H1N1流感的流行病學特征及預防控制[J].中國當代醫(yī)藥，2009，15：37-39.

[4]鄔向東，陳如圣，晏文波，等.豬流行性感冒Swine Influenza SI[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志，2009，4：2-4.

[5]李春.豬流感病毒的分離鑒定和豬流感血清流行病學調(diào)查[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2007.

[6]陳紅英，崔沛，方忠意，等.檢測禽流感抗體的重組核蛋白間接ELISA方法的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2010，26（2）：359-363.

[7]高蕾.中國部分地區(qū)豬血清對甲型H1N1流感病毒的交叉免疫研究分析[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2011.

[8]孔維.抗H3亞型豬流感病毒血凝素單抗的制備及抗原捕捉ELISA方法的建立[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2009.

[9]孫忠晟，尹燕博，王平，等.間接ELISA檢測豬流感抗體方法的建立及應用[J].中國獸醫(yī)雜志，2011（01）：78-80.

[10]孫彥偉.廣東部分規(guī)模豬場豬流感血清學監(jiān)測結果與分析[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2006，31（5）：28-30.

[11]謝海燕，朱燕秋，曾慶泉，等.東莞市豬流感的監(jiān)測及風險評估[J].中國動物檢疫，2012，29（4）：61-62.

（責編：張宏民）