甘蔗赤腐病菌拮抗細(xì)菌TWC2的分離鑒定及其防效研究

梁艷瓊 唐文 吳偉懷 李樂 習(xí)金根 鄭肖蘭 李銳 鄭金龍 黃興 賀春萍 易克賢

摘 要 由鐮孢炭疽菌（Colletotrichum falcatum Went）引起的赤腐病是甘蔗生產(chǎn)上的主要病害之一，發(fā)病時可導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失。為探求赤腐病有效的生防措施，從熱帶牧草臺灣草葉片上分離到一株生防菌TWC2。經(jīng)形態(tài)觀察、16S rDNA序列分析和生理生化鑒定，確定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。平板對峙試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TWC2菌株對甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum）、香蕉黑星病菌（Macrophoma musae）、橡膠樹炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、柱花草炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、甘蔗環(huán)斑病菌（Leptosphaeria sacchari）、王草莖點(diǎn)霉葉斑病菌（Phoma herbarum）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）等病原菌均具有一定的抑制作用。離體葉片接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TWC2菌株對甘蔗赤腐病菌的抑制率達(dá)72.01%，盆栽試驗(yàn)與離體葉片接種結(jié)果一致，表明TWC2菌株對甘蔗赤腐病具有較好的防治效果。該結(jié)論為開發(fā)甘蔗赤腐病生防方法打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 甘蔗赤腐病 ；解淀粉芽孢桿菌 ；鑒定 ；生防效果

中圖分類號 S476.1 ；S435.661 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.02.013

Abstract Sugarcane red rot is caused by Colletotrichum falcatum Went， and is one of the most devastating diseases of sugarcane， causing serious yield loss. An antagonistic bacterial strain TWC2 was isolated from the leaves of Taiwan grass （Zoysia tenuifolia Willd. ex Trin.）， a tropical grass， and used to control the red rot disease. The strain TWC2 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through morphological observation， 16S rDNA sequence analysis， and physiological and biochemical identification. The plate confrontation test showed that the TWC2 had a strong antagonistic activity against the growth of some pathogenic fungi such as Colletotrichum falcatum， Macrophoma musae， Colletotrichum gloeosporioides infecting Hevea brasilliensis， stylosanthes and mango， Leptosphaeria sacchari， Phoma herbarum and Fusarium oxysporum. In vitro leaf inoculation test showed that the TWC2 had an inhibition rate of 72.01% against C. falcatum， which was the same as the pot experiment. This conclusion indicated that TWC2 had a better control effect against the sugarcane red rot. The study laid a foundation for developing an effective biocontrol method to control the sugarcane red rot.

Keywords sugarcane red rot ； Bacillus amyloliquefaciens ； identification ； biological control

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是一種重要的糖料作物和可再生能源作物，盛產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國現(xiàn)已成為繼巴西、印度之后的世界第三大種植國[1-2]。甘蔗易受各種生物和非生物因素影響，但由鐮孢炭疽菌Colletotrichum falcatum Went引起的赤腐?。≧ed Rot）是甘蔗生產(chǎn)過程中的毀滅性病害，從苗期到成株到收獲后均可發(fā)生，主要為害蔗莖和葉片中脈，侵害葉鞘和宿根蔗頭[3]。該病害不僅導(dǎo)致產(chǎn)量降低，其病原菌還可促使蔗糖轉(zhuǎn)化，降低蔗汁純度、減少蔗糖糖分[4-5]?？共∮N一直以來被認(rèn)為是防治甘蔗赤腐病最安全有效的手段，然抗病品種培育時間長，易因病原菌小種變異而喪失抗性[6-7]；化學(xué)殺菌劑是當(dāng)前最有效的甘蔗赤腐病防治方法，但長期使用易使病原菌產(chǎn)生抗性而導(dǎo)致防效下降，且頻繁、高濃度的化學(xué)殺菌易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，造成環(huán)境污染，嚴(yán)重威脅人類的健康[8]。隨著人們健康、環(huán)保意識的增強(qiáng)，生物防治以無毒、無害、無污染、高效等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。因此，研究新的無公害生物防治技術(shù)成為解決甘蔗赤腐病的當(dāng)務(wù)之急。

關(guān)于甘蔗赤腐病的生物防治，國外已有大量的研究報道。如Viswanathan等[9-10]從甘蔗根際土壤分離到產(chǎn)幾丁質(zhì)的熒光假單胞菌株CHAO、KKMI，并研究其對甘蔗赤腐病菌的防治效果；Singh等[11]從76份印度北方邦、比哈爾邦甘蔗的根際土壤中分離到哈茨木霉（Tichoderma harzianum）、綠色木莓（Tichoderma viride），均對甘蔗赤腐病菌具有抑菌作用，其中哈茨木霉比綠色木霉的抑菌效果更佳；Vijai等[12-13]發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉（T. harzianum）和綠色木莓（T. viride）的復(fù)合培養(yǎng)物、孢子懸浮液和代謝產(chǎn)物對降低甘蔗赤腐病的發(fā)病率，提高甘蔗的分蘗率、產(chǎn)量以及蔗種萌發(fā)率具有顯著效果；Hassan等[14]報道3株枯草芽孢桿菌通過產(chǎn)生脂肽抗生素、水解酶、鐵載體等次級代謝產(chǎn)物抑制甘蔗赤腐病菌；Goswami等[15]報道銅綠假單胞菌RL-DS9（rhamnolipid biosurfactant）產(chǎn)生的生物表面活性劑鼠李糖脂能有效抑制甘蔗赤腐病菌?？梢?，利用生防菌控制植物病害是一種環(huán)境友好型的防治措施。為此，本研究從熱帶牧草——臺灣草植株葉片上篩選獲得一株對甘蔗赤腐病具有較強(qiáng)拮抗效果的菌株TWC2，并結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行鑒定，利用離體接種和盆栽接種的方法探究對甘蔗赤腐病菌的抑制效果。以期為甘蔗赤腐病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌

甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum Went）、香蕉黑星病菌[Macrophoma musae （cooke） Berl.et Vogal.]、橡膠樹炭疽病菌[Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Penz. and Sacc.]、柱花草炭疽病菌[Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Penz. and Sacc.]、芒果炭疽病菌[Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Penz. and Sacc.]、甘蔗環(huán)斑病菌[Leptosphaeria sacchari V. Breda. de Haan]、王草莖點(diǎn)霉葉斑病菌（Phoma herbarum Wested）和西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum），由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所分離、鑒定、保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

細(xì)菌分離純化采用LB培養(yǎng)基（蛋白胨 10 g，酵母浸出物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉15 g，pH 7.0）；菌株篩選及抑菌譜測定選用PDA培養(yǎng)基（去皮馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂粉15 g，pH 7.0）。

1.1.3 植物材料

甘蔗品種為‘桂糖21號，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 拮抗細(xì)菌的分離

選取健康的臺灣草葉片，用無菌水沖洗干凈，在無菌超凈工作臺上分別剪取直徑約5 mm的葉片組織，用75%酒精+0.1%升汞混合液表面消毒30 s，無菌水清洗3次，移植到PDA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)一定時間后挑取菌落形態(tài)不同的菌株，進(jìn)一步劃線純化保存?zhèn)溆谩０次妩c(diǎn)接菌法將具強(qiáng)致病力的甘蔗赤腐病菌接入PDA培養(yǎng)基平板中央，分離物接于病原菌四周，以不接分離物為對照，倒置培養(yǎng)，從中篩選抑菌作用較強(qiáng)的菌株。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態(tài)特征和生理生化特征鑒定

菌株的形態(tài)特征及生理生化特征測定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[16]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]進(jìn)行。

1.2.2.2 16S rDNA序列分析

依據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒（OMEGA）步驟提取TWC2菌株的DNA，采用細(xì)菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′，1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′和引物gyrB：UP-1-Rev1 （5′-CAYGCNGGNGGNAARTTYG-3′），UP-2r （5′-CCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增[18]。反應(yīng)體系為25 μL，包括10 × PCR 緩沖液（ 含Mg2+ ） 2.5 μL， dNTPs（10 mmol/L） 2 μL，引物對27F/1492R各1 μL （ 10 μmol/L），Taq DNA 聚合酶（ 5 U/μL） 0.2 μL，模板DNA 1 μL，最后ddH2O補(bǔ)足至25 μL，以清水為對照。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72℃再次延伸10 min，4℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，與pEASY-T1克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)陽性克隆檢測，挑取有外源片段的質(zhì)粒于上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 TWC2菌株抑菌譜測定

采用平板對峙法，將7株供試病原菌接入PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5 d，待菌絲長滿培養(yǎng)皿，用打孔器取直徑5 mm的菌塊置于PDA平板中央，四周接種TWC2菌株，以沒有接種TWC2菌株為對照，每處理重復(fù) 3 次，按以下公式計算病菌抑制率。

病菌抑制率（%）=（對照菌落半徑-處理菌落半徑）/對照菌落半徑×100%。

1.2.4 TWC2在甘蔗植株及離體葉片的生防效果

將甘蔗赤腐病菌轉(zhuǎn)接在PDA平板上，28℃培養(yǎng)3 d，備用。TWC2接入LB液體培養(yǎng)基，34℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，備用。取嫩綠甘蔗葉片，每處理8片葉片，每片用針刺法刺傷3處，隨后處理如下：① 將TWC2菌液先噴灑在甘蔗葉脈，待風(fēng)干后馬上接病原菌于針刺處（T+S）；②先接病原菌于針刺處，后噴灑TWC2菌液（S+T）；③只接病原菌于針刺處（S）；④空白，只噴清水于葉片表面（CK）。3 d后觀察結(jié)果，按十字交叉法測病斑直徑并求出面積，按以下公式計算病斑抑制率。

病斑抑制率（%）=（對照病斑總面積-處理病斑總面積）/對照病斑總面積×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 TWC2菌株的獲取

臺灣草葉片組織在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，經(jīng)分離純化，挑取單菌落，獲得形態(tài)、大小、顏色一致的純化菌株31株，備用。用平板對峙法測定上述 31株細(xì)菌的抑菌活性，最終得到一株對甘蔗赤腐病菌具有較強(qiáng)抑制作用的菌株，抑菌率達(dá)70%以上（圖1），將該菌株命名為TWC2。

2.2 TWC2菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)

在LB培養(yǎng)基上菌落呈白色，近圓形，表面濕潤，有褶皺，不透明；經(jīng)顯微鏡觀察，菌株呈桿狀，具芽孢，革蘭氏反應(yīng)陽性（圖2）；具體生理生化指標(biāo)見表1 。

2.2.2 16S rDNA 序列與同源性分析

以TWC2的基因組DNA為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，檢測到一條大小約1 500 bp的條帶（圖3-A），測序結(jié)果為1511 bp。將測序結(jié)果在 NCBI GenBank上進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)與Bacillus amyloliquefaciens JN382250、KU363819和NR116022同源性最高，達(dá)99%。利用MEGA6軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），TWC2菌株和解淀粉芽孢桿菌聚在同一分支上，初步認(rèn)定TWC2菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.2.3 gyrB基因序列分析

進(jìn)一步用細(xì)菌分類中常用的gyrB基因?qū)WC2進(jìn)行分析，以TWC2基因組DNA為模板，擴(kuò)增gyrB基因，電泳檢測目的片段（圖3-B）與預(yù)計片段大小基本吻合。搜索GenBank 數(shù)據(jù)庫里相關(guān)芽胞桿菌gyrB基因序列，以熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）為外群，采用MEGA 6軟件中的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），結(jié)果顯示，Bacillus thuringiensis、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Brevibacillus brevis聚在一個大分支里，Bacillus subtilis、 Bacillus amyloliquefaciens聚在另一個分支上，TWC2與Bacillus amyloliquefaciens的GM-1、FQS38、DY1b菌株聚在同一分支，親緣性最近，這與16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致。

綜合菌落形態(tài)、生理生化特性、16S rDNA 序列分析、gyrB 基因系統(tǒng)發(fā)育分析，最終將TWC2鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens。

2.3 對其他病原真菌的抑制作用

為研究拮抗菌株TWC2 的生防潛力，采用平板對峙法對其抑菌譜進(jìn)行測定。結(jié)果表明，菌株TWC2對7株供試病原真菌均有較高的拮抗活性（圖6），其中對甘蔗赤腐病菌、柱花草炭疽病菌、芒果炭疽病菌的抑制率最高，均達(dá)70%以上（表2）。

2.4 TWC2對甘蔗赤腐病的防治效果

如圖7所示，對照組葉片葉脈狀況良好，沒有出現(xiàn)病斑。由表3可知，T+S處理組葉片葉脈出現(xiàn)病斑，但面積較小，僅為9.11 mm2；S+T處理組葉片病斑面積較大，為14.44 mm2；S處理組葉片受赤腐病菌侵染較為嚴(yán)重，病斑面積達(dá)32.56 mm2。說明T+S處理組、S+T處理組對赤腐病菌均有一定抑制作用，其中T+S處理組抑制率最高，達(dá)72.01%，S+T處理組其次，為55.63%，而未噴灑TWC2菌液的S處理組和空白處理抑制率為0。盆栽試驗(yàn)（表4）與離體葉片接種結(jié)果（表3）基本一致， 說明TWC2菌株對甘蔗赤腐病具有較好的防治效果。

3 討論

赤腐病是甘蔗生產(chǎn)過程中的常見病害，廣泛分布于世界各蔗區(qū)，苗期至成株期均可發(fā)病，嚴(yán)重時可導(dǎo)致30%左右的減產(chǎn)[13]。目前，防治該病的主要措施是抗病育種和化學(xué)防治，但均存在較多缺陷；生物防治以其無污染、持效期久、環(huán)境兼容性好等特點(diǎn)被認(rèn)為是最具有發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒ㄖ弧ｉ_展甘蔗赤腐病生物防治最基礎(chǔ)的工作之一就是篩選具有不同生物學(xué)特性的生防微生物，國外研究人員已經(jīng)分離獲得了一些對甘蔗赤腐病菌具較好效果的生防微生物。Suresh等[19]研究了哈茨木霉、綠色木霉、黃曲霉、煙曲霉、黑曲霉和硫曲霉等6種根際土壤真菌對甘蔗赤腐病菌的拮抗活性。Hassan等[20]發(fā)現(xiàn)，大田條件下惡臭假單胞菌菌株NH-50可使甘蔗赤腐病減輕44%～60%的危害程度，該菌分泌的胞外代謝物和揮發(fā)性物質(zhì)對甘蔗赤腐病菌同樣具有抑制作用。Mehnaz等[21]從甘蔗植株莖桿、根部及根際土壤分離獲得對甘蔗植株的生長具有影響作用的7株假單胞菌，并探究了它們的產(chǎn)抗真菌化合物HCN情況和對甘蔗赤腐病的生防效果。

總的來說，目前對甘蔗赤腐病菌有抑制作用的生防菌中，以假單胞菌（Pseudomonas spp.）和木霉（Trichoderma spp.）居多。本研究從臺灣草葉片上分離獲得一株解淀粉芽孢桿菌，室內(nèi)防效試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對甘蔗赤腐病菌具有較高的抑制活性，對赤腐病菌抑制率達(dá)72.01%，為甘蔗赤腐病的防治提供了新的生防資源。

解淀粉芽孢桿菌是目前一種重要的芽孢桿菌類生防菌，其在生長過程中會分泌某些物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)對很多真菌和細(xì)菌均具有抑制作用。已有研究表明，解淀粉芽孢桿菌對白粉菌（Erysiphe）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、梨孢霉菌（Piricularia sp.）、雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）、禾谷多粘菌（Polymyxa graminis）、青霉菌（Penicillium sp.）、稻黃單胞菌稻生致病變種（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola， Xooc）、絲核菌（Rhizoctonia solani）、鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、鏈格孢（Alternaria Nees）等多種病原菌都具有很好的拮抗作用[19-27]。本研究結(jié)果表明TWC2不僅能抑制甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum）、橡膠樹炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、柱花草炭疽病菌（C.gloeosporioides）和芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等病原真菌的生長，而且對香蕉黑星病菌（Macrophoma musae）、甘蔗環(huán)斑病菌（Leptosphaeria sacchari）、王草莖點(diǎn)霉葉斑病菌（Phoma herbarum Wested）和西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）也有較好的抑制作用。說明解淀粉芽孢桿菌TWC2是一株具有廣譜抑菌活性的拮抗菌。此外，解淀粉芽胞桿菌的防效具有較好的穩(wěn)定性，張榮勝[28]等人研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌Lx-11對水稻細(xì)菌性條斑病的盆栽防效達(dá) 62.5%，大面積示范試驗(yàn)的防效則為 60.2%，顯著高于20%葉枯唑的防效（51.2%和 45.8%）。楊洪鳳[29]盆栽試驗(yàn)表明，內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌 CC09的菌株發(fā)酵液對小麥白粉病有很高的預(yù)防治療效果，15 d防效為 95%，為三唑酮的2.3倍。本研究中，離體葉片和盆栽試驗(yàn)均表明，菌株TWC2對甘蔗赤腐病有較好的防效，該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了芽孢桿菌防效的穩(wěn)定性。

綜上所述，解淀粉芽孢桿菌TWC2抗菌譜廣，為甘蔗赤腐病害中開發(fā)應(yīng)用潛力較大的生防菌。當(dāng)然，要實(shí)現(xiàn)在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用，仍需在生產(chǎn)、代謝產(chǎn)物的純化與鑒定以及生防機(jī)制等方面做進(jìn)一步的研究。未來隨著發(fā)酵條件與應(yīng)用方式的進(jìn)一步優(yōu)化，該菌生防潛力將會得到進(jìn)一步提升。

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