正交試驗優(yōu)化裸花紫珠水提取工藝及外用止血作用的評估△

張仲，羅賢強，周金娜，周小芳，黃明浩，張俊清1，*，羅喻超*

(1.海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點實驗室，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199)

裸花紫珠CallicarpanudifloraHook.et Arn為馬鞭草科紫珠屬(CallicarpaLinn.)植物，又名趕風(fēng)柴、節(jié)節(jié)紅、百花茶、飯湯葉、亞賽凡等[1]，主要分布于我國海南，廣西，廣東等地，裸花紫珠是海南常用黎藥材[2]。主要分布于白沙，五指山瓊中等地。裸花紫珠作為藥材四季均可收獲，取裸花紫珠的地上干燥部分，陰干，去除雜質(zhì)用藥，具有抗菌、消炎解毒、收斂止血、祛風(fēng)除濕的功效，臨床上用于急性傳染性肝炎、化膿性炎癥、消化道出血等癥，外用常用于治燒傷、燙傷及外傷出血等?，F(xiàn)代研究表明，裸花紫珠主要含有黃酮、鞣質(zhì)、萜類和酚類等成分[3-4]，其中的苯乙醇苷類化合物毛蕊花糖苷(acteoside，AS)有顯著縮短活化部分凝血活酶時間(APTT)作用，提示裸花紫珠可能是通過影響內(nèi)源性凝血途徑來發(fā)揮止血作用，其中毛蕊花糖苷在藥材中的含有量很高，可能是裸花紫珠止血的主要活性成分[5]。

市場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前市場上裸花紫珠制劑已有片劑、膠囊劑、合劑、分散片、栓劑和陰道片劑等劑型[6]，但是缺少用于止血的外用制劑，研制裸花紫珠外用止血貼不僅可以填補市場的空缺，還能通過貼劑的特點更好發(fā)揮裸花紫珠的止血效果。本論文通過正交試驗對裸花紫珠的水提取工藝進行優(yōu)化，并進行了工藝驗證實驗。用最佳提取工藝所獲得的水提取物進行了外用止血實驗，對止血的效果進行了評估。這些都為將來裸花紫珠止血貼的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 動物

清潔級家兔，購買于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，合格證號：SDWA-44060506-0403-20170330-00001，雌雄各半，體重2.2～2.5 kg。

1.2 藥物及試劑

裸花紫珠于2016年5月采自海南省白沙縣，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院田建平教授鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物裸花紫珠CallicarpanudifloraHook.et Arn；吸水墊(7.5 cm×7.5 cm×0.1 cm)購買于優(yōu)玖責(zé)任有限公司；云南白藥創(chuàng)可貼(批號：PJE1628)；甲醇、醋酸、無水乙醇均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠，乙腈為色譜純，水為超純水。

1.3 儀器

北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司SO9001型電子天平；上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠GXZ-9240型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱；上海亞榮生化儀器廠RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。Shimadzu LC-2010AHT高效液相色譜儀(配有紫外檢測器，自動進樣器，LC solution色譜工作站)。

2 方法與結(jié)果

2.1 裸花紫珠提取工藝的考察

2.1.1 浸膏得率的測定 精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥24 h，迅速轉(zhuǎn)移至干燥器中冷卻0.5 h，迅速精密稱定質(zhì)量，計算浸膏得率。計算浸膏得率。

(1)

2.1.2 毛蕊花糖苷的測定 依照本實驗室王勇等[7]建立的色譜條件：Luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相乙腈-0.1%醋酸水溶液(15∶85)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長332 nm，柱溫30 ℃。精密稱取毛蕊花糖苷對照品25.8 mg，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成毛蕊花糖苷濃度為1.032 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。然后分別吸取一定體積的該溶液置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別稀釋成6種濃度分別為0.103 2、0.206 4、0.412 8、0.516 0、0.619 2、0.825 6 mg·mL-1的對照品溶液。各濃度的溶液分別進樣2 μL，測定毛蕊花糖苷的峰面積，以毛蕊花糖苷的進樣量(μg·μL-1)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到毛蕊花糖苷的回歸方程為Y=3.574×106X-40 115，r=1.000 0，線性范圍為0.103 2～1.032 μg·μL-1。

取裸花紫珠提取后的濃縮液0.5 mL，置25 mL量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度。取適量，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，測定，記錄色譜圖，計算毛蕊花糖苷(AS)提取率。

2.1.3 藥材水提取工藝因素與水平 裸花紫珠莖葉中主要的成分毛蕊花糖苷易溶于水，因此采用水加熱回流提取方法，采用蒸餾水回流提取。由于裸花紫珠葉的吸水率較大[7]，故在選擇加水量的水平時第1次加入量比后兩次大。選取考察加水量，浸泡時間，提取時間和提取次數(shù)4個因素。結(jié)合參考文獻[7-9]，并進行了預(yù)實驗，最終選取了每個因素的考察水平，因素水平見表1。

表1 裸花紫珠水提取水平因素表

2.1.4 提取工藝正交試驗方法 取裸花紫珠地上干燥部分，將莖葉剪成均一大小，分成9份，每份約20 g，依次編號為1～9組。按照表2中L9(34)正交表規(guī)定的條件進行回流提取，提取液用200目紗布過濾，濃縮，待濃縮液冷卻后，加蒸餾水定容到100 mL，搖勻。按照2.1.1和2.1.2所述方法測定浸膏得率和毛蕊花糖苷含量。測定結(jié)果見表2及表3。

表2 提取工藝正交試驗設(shè)計結(jié)果

注：綜合評分=(浸膏得率/19.60×0.3+AS得率/1.77×0.7)×100。

表3 方差分析表

比較各因素的極差可知，因素D(提取次數(shù))對試驗結(jié)果影響最大，其次是C、B和A，所以因素對綜合評分值指標(biāo)影響大小排序為D>C>B>A。由方差分析可知，因素D具有顯著性差異。根據(jù)極差分析各因素的均值，可確定裸花紫珠藥材水提取最佳工藝為A2B3C2D3，即藥材浸泡時間2 h后，提取3次，加水量分別為12，10，10倍量，每次提取時間為1 h。

2.1.5 工藝驗證實驗 稱取裸花紫珠藥材3份，每份50 g，按上述確定的最佳工藝條件提取，對藥材水提取工藝進行驗證，測定結(jié)果見表4。結(jié)果表明，由上述確定的最佳方案提取毛蕊花糖苷的提取率較高，該方案較為穩(wěn)定。

表4 水提取驗證實驗結(jié)果 %

2.2 藥效學(xué)評價

采用最佳提取工藝提取獲得的流浸膏旋蒸濃縮，分別稀釋至浸膏濃度為1.0、0.5 g·mL-1。吸取一種濃度的流浸膏1mL均勻分布于吸水棉墊2.4 cm×1.5 cm×0.1 cm后，50 ℃減壓烘干1 h，分別制成高低兩種含藥濃度的止血棉墊，記錄各棉墊的的質(zhì)量。進行預(yù)實驗[10-11]，選取市售的云南白藥創(chuàng)可貼為陽性藥。結(jié)果如表5所示，顯示云南白藥創(chuàng)可貼組的平均出血時間與0.5 g·mL-1組相當(dāng)，而平均出血量要低于1.0 g·mL-1組。

表5 預(yù)實驗結(jié)果

參考預(yù)實驗的結(jié)果，制得含藥濃度分別為0.5、1.0、2.0 g·mL-1的低中高三種止血棉墊。取成年家兔15只，隨機分為5組，低、中、高劑量組、陰性對照組和陽性對照組。將家兔左耳與右耳對齊，于耳緣末端2/3、1/2、1/3處，用一次性采血針對家兔耳緣靜脈穿刺1 cm，形成靜脈出血后立即在出血處敷以制好的止血棉墊，并用100 g砝碼壓在棉墊上，5 s觀察1次出血情況，直至出血停止。記錄出血時間，并稱量止血棉墊的質(zhì)量，計算出血量。

結(jié)果見表6和表7。

表6 出血時間結(jié)果

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01。

表7 出血量結(jié)果

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01。

與空白組相比，裸花紫珠低、中、高劑量與云南白藥創(chuàng)可貼均可以非常顯著地減少出血量(P<0.01)，其中高劑量組的出血量要低于陽性對照組；此外，高劑量組相較空白組也可以明顯地減少出血時間(P<0.01)，同時高劑量的出血時間也要低于陽性對照組。綜上，說明裸花紫珠水提取物具有一定的外用止血作用，具有開發(fā)成外用止血貼劑的潛力。

3 討論

在正交試驗分析中，引進綜合評價的理念，使用多指標(biāo)綜合加權(quán)評分法可以避免單一評價的片面性，使分析結(jié)果更加科學(xué)、客觀，使得提取工藝趨于合理、可信[12]。本研究以浸膏得率、毛蕊花糖苷的提取得率為指標(biāo)，采用正交試驗設(shè)計，對裸花紫珠葉中苯乙醇苷類成分的水提取工藝進行研究，確定了最佳的提取工藝：藥材加水浸泡2 h，提取3次，加水倍量分別為12、10、10，每次提取1 h。本研究確定的提取工藝簡單可行，3次驗證實驗結(jié)果重復(fù)性較好，可為今后裸花紫珠莖葉的水提取提供參考，也為日后裸花紫珠制劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

本文進一步針對最佳提取工藝所獲得的裸花紫珠浸膏，進行了外用止血藥效學(xué)的研究。以出血時間和出血量為評價指標(biāo)，先進行了預(yù)實驗。參考預(yù)實驗的結(jié)果，考察不同劑量對家兔耳緣靜脈出血的影響。預(yù)實驗和正式實驗的動物數(shù)量、樣本量以及實驗方法都相同，且結(jié)果基本在同一水平，兩次實驗結(jié)果都有較好的重復(fù)性。此次研究，初步證明本浸膏具有一定的外用止血作用，尤其以2.0 g·mL-1的濃度給藥時，作用效果十分顯著，甚至要優(yōu)于市售的云南白藥創(chuàng)可貼，表明了本浸膏作為外用止血藥物開發(fā)的潛力。本次研究，參考止血貼的制作流程，并采用了相應(yīng)的材料，這也為裸花紫珠外用止血貼的研制提供了基礎(chǔ)。

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