星點(diǎn)設(shè)計(jì)-多指標(biāo)評(píng)價(jià)優(yōu)化六味地黃丸制備工藝△

屈云萍，李菲，劉育強(qiáng)，楊斯斯，黃寧，姜國(guó)志

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051430)

六味地黃丸是最著名的經(jīng)典方劑之一，滋陰補(bǔ)腎，用于頭暈耳鳴、腰膝酸軟、遺精盜汗，臨床應(yīng)用范圍極其廣泛。近年來(lái)，不少學(xué)者對(duì)六味地黃丸進(jìn)行了廣泛而深入地研究，并取得了較大的進(jìn)展，文獻(xiàn)[1]統(tǒng)計(jì)分析了1995—2000年以來(lái)六味地黃丸的研究，共計(jì)544篇，但其中的制藥工藝研究?jī)H有7篇，占總文獻(xiàn)量的1.29%，且六味地黃丸含量控制項(xiàng)中，丹皮酚的含量、丸芯溶散時(shí)限受干燥溫度及干燥時(shí)間的影響較大[2]，同樣的，軟材的粘合性、成型性對(duì)壓丸得率也有很大的影響。本文通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法多指標(biāo)評(píng)價(jià)，對(duì)六味地黃丸制備工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，旨在穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)[3-6](central composite design，CCD)廣泛應(yīng)用于處方優(yōu)化和制劑工藝，星點(diǎn)設(shè)計(jì)與常用的正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)法相比，具有非線性擬合的特點(diǎn)，其結(jié)果可采用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體的效應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)精度高，預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值，試驗(yàn)次數(shù)少，CCD-RSM廣泛應(yīng)用于處方優(yōu)化和制劑工藝，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法既能考察各自變量對(duì)因變量的影響及各自變量間交互作用，也能進(jìn)行各自變量的最優(yōu)化，建立數(shù)學(xué)模型并做出相應(yīng)的三維因變量曲面圖，對(duì)自變量與因變量的關(guān)系進(jìn)行直觀的量化分析，CCD-RSM可較好地描述依賴變量和非依賴變量之間的關(guān)系。該方法直觀性、方便性及預(yù)測(cè)性均比正交和均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化更好。

1 材料與儀器

六味地黃浸膏、藥粉(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司中藥提取車間提供)；丹皮酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110708-201407)；甲醇(色譜純，天津康科德公司)，其余試劑(分析純，市售)。

HC200C槽形混合機(jī)(浙江溫州化工機(jī)械廠)；中藥自動(dòng)制丸機(jī)(黑龍江制藥機(jī)械廠)；荸薺式打光鍋(寶雞制藥機(jī)械廠)；熱風(fēng)循環(huán)烘箱(常州范群干燥設(shè)備有限公司)；BJ-Ⅱ型智能崩解儀；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

2 方法與結(jié)果

2.1 六味地黃丸制備工藝

牡丹皮用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)性成分；藥渣與部分酒萸肉、熟地黃、茯苓、澤瀉加水煎煮二次，每次2 h，煎液濾過(guò)，濾液合并，濃縮成稠膏；山藥與剩余酒萸肉粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻；與上述稠膏和牡丹皮揮發(fā)性成分混勻，制丸，干燥，打光，即得。

2.2 丹皮酚含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定[7]。

2.3 質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)

以水分、丹皮酚含量、溶散時(shí)限、外觀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)研究浸膏相對(duì)密度、潤(rùn)濕劑用量、干燥溫度、干燥時(shí)間4個(gè)影響因素對(duì)六味地黃丸制備工藝的影響。

六味地黃丸為濃縮丸，為規(guī)避丸劑的粒徑大小及重量對(duì)溶散時(shí)限的影響，本試驗(yàn)嚴(yán)格按規(guī)格控制在每8丸重1.44 g(每8丸相當(dāng)于飲片3 g)，即每丸重0.18 g，且在試驗(yàn)階段通過(guò)篩分、揀選出不符合粒徑、丸重要求的丸子。

2.3.1 水分(Y1) 按水分測(cè)定法(通則0832第四法)測(cè)定[8]103。

2.3.2 丹皮酚含量(Y2) 按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定。

2.3.3 溶散時(shí)限(Y3) 取六味地黃丸6丸，選擇孔徑約2.0 mm篩網(wǎng)的吊籃，照溶散時(shí)限檢查法(通則0921)測(cè)定[8]118。

2.3.4 外觀質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Y4) 隨機(jī)取不同條件制備的丸芯各50丸，分別對(duì)各組丸芯的外觀進(jìn)行評(píng)分，設(shè)定圓整度、硬度、色澤等3個(gè)外觀評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別占45、25、30分，滿分為100分，將各指標(biāo)評(píng)分相加作為丸芯的外觀得分。

以Y1，Y2，Y3，Y4的總評(píng)“歸一值”(overall desirability，OD)為評(píng)價(jià)指標(biāo)[9]，根據(jù)4個(gè)指標(biāo)對(duì)丸芯質(zhì)量影響的重要性，設(shè)定各自權(quán)重分別為40%、20%、30%、10%。

OD值=(Y1/Y1max)×40%+(Y2/Y2max)×20%+(1-Y3/Y3 min)×30%+(Y4/Y4max)×10%

(1)

式中Y3越小越好。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 浸膏相對(duì)密度的影響 處方中六味地黃浸膏的量占比較大，與藥材原粉及其余物料混合攪拌制備軟材后壓丸，本試驗(yàn)分別考察4個(gè)不同相對(duì)密度的浸膏按照2.1的方法壓制丸芯，考察軟材的性狀、壓制成條性、丸重差異及丸芯成型，結(jié)果見(jiàn)表1。

結(jié)果表明：相對(duì)密度1.38、1.40時(shí)，軟材黏性適中，壓丸容易成條，丸重差異小且丸面光滑，成型較圓整，因此可以選用1.39為中線做進(jìn)一步考察。

3.1.2 潤(rùn)濕劑的選擇 制備軟材時(shí)用到的潤(rùn)濕劑為純化水和乙醇，兩者以不同的比例進(jìn)行配合，另外乙醇用量比例較大時(shí)，能很好的改善丸芯的溶散，但同時(shí)軟材黏性就會(huì)降低，導(dǎo)致壓丸不易，本試驗(yàn)考察以純化水、乙醇為潤(rùn)濕劑，按2.1的方法制備丸芯，考察軟材的性狀、壓制成條性、丸重差異及溶散時(shí)限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 浸膏相對(duì)密度的影響

表2 潤(rùn)濕劑的選擇

結(jié)果表明：純化水∶乙醇為1∶2時(shí)，軟材硬度適宜、黏性適中，壓制易成條、條面光滑，丸重差異小，且溶散時(shí)限合格，因此選擇純化水∶乙醇為1∶2為潤(rùn)濕劑，后續(xù)做用量的進(jìn)一步考察。

3.1.3 干燥溫度的影響 用浸膏相對(duì)密度為1.39(30 ℃)、選擇潤(rùn)濕劑為純化水∶乙醇1∶2，按照2.1的方法制備丸芯，放入熱風(fēng)循環(huán)烘箱內(nèi)干燥，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)分別選擇55、60、65、70 ℃的干燥溫度，干燥相同的時(shí)間，考察丹皮酚含量、水分、溶散時(shí)限，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 干燥溫度的影響

結(jié)果表明：不同的干燥溫度，干燥相同的時(shí)間，丹皮酚及溶散時(shí)限差異不明顯，但70 ℃干燥的丸芯含水量較低，對(duì)丸芯的質(zhì)量保證更加可靠，因此后續(xù)選擇70 ℃為中線做進(jìn)一步考察。

3.1.4 干燥時(shí)間的影響 按照2.1的方法制備丸芯，用浸膏相對(duì)密度為1.39(30 ℃)、選擇潤(rùn)濕劑為純化水∶乙醇為1∶2，干燥溫度為70 ℃，選擇不同的干燥時(shí)間，考察丹皮酚含量、水分、溶散時(shí)限、丸芯外觀，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 干燥時(shí)間的影響

結(jié)果表明：隨著干燥時(shí)間的延長(zhǎng)，丹皮酚含量稍有下降，且溶散時(shí)限及丸芯外觀受很大的影響，因此選擇18 h為中線做后續(xù)的進(jìn)一步考察。

3.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選六味地黃丸制備工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法多指標(biāo)對(duì)六味地黃丸制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。以浸膏相對(duì)密度1.39(30 ℃)(A)、潤(rùn)濕劑用量6L(40萬(wàn)丸用量)(B)、干燥溫度70℃(C)、干燥時(shí)間18 h(D)為考察因素的中線，以水分(Y1)、丹皮酚含量分?jǐn)?shù)(Y2)、溶散時(shí)限分?jǐn)?shù)(Y3)、外觀質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Y4)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算OD值。

每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表5。

表5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素水平編碼

3.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，本試驗(yàn)共含有29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中29個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)。析因點(diǎn)為自變量取值在所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，其中零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估算試驗(yàn)誤差。Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表6。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，回歸方程Y=0.39-0.032A-0.027B-0.088C-0.16D-0.025AB-0.045AC-0.095AD-0.055BC-0.015BD-5×10-3CD-0.083A2-0.021B2-0.071C2-0.033D2，相關(guān)系數(shù)r=0.993 8，接近1，說(shuō)明所建模型與試驗(yàn)擬合較好。詳細(xì)見(jiàn)表7。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表7 回歸模型和方差分析

注：*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)。

3.4 各因素間相互作用對(duì)結(jié)果的影響

響應(yīng)曲面圖是根據(jù)回歸方程繪制的，是響應(yīng)值在各試驗(yàn)因素交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個(gè)三維空間曲面，可以預(yù)測(cè)和檢驗(yàn)變量的響應(yīng)值以及確定變量的相互關(guān)系。AB、AC、AD和BC之間均存在交互作用，根據(jù)回歸方程做出模型的響應(yīng)曲面及等高線，見(jiàn)圖1。

由圖1可知，軟件最終篩選出的最佳工藝參數(shù)為：浸膏相對(duì)密度1.40(30 ℃)、潤(rùn)濕劑(純化水∶乙醇為1∶2)用量(40萬(wàn)丸用量)6.58 L、干燥溫度65 ℃、干燥時(shí)間16 h，此狀態(tài)OD值為0.570 8。

3.5 最佳工藝參數(shù)的驗(yàn)證

按照響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行3批驗(yàn)證，三批丹皮酚含量分別為0.47、0.45、0.42 mg/丸；水分分別為6.8%、6.5%、6.2%；溶散時(shí)限分別為39、36、34 min；將數(shù)據(jù)用2.3.4的方法計(jì)算OD值，分別為0.571 9、0.571 1、0.571 5，與預(yù)測(cè)OD值比較，偏差為-0.19%、-0.05%、-0.12%。因此，實(shí)踐結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值基本一致，所以利用響應(yīng)面法得到的六味地黃丸制備工藝參數(shù)穩(wěn)定可靠，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

3.6 丸芯整形、打光及結(jié)果

將丸芯置打光鍋中，啟動(dòng)打光鍋，用95%乙醇及純化水適量潤(rùn)濕丸粒，然后交替將藥汁和50%左右乙醇噴灑至丸芯表面，直至丸芯表面平整，加入滑石粉和藥用炭的混合粉末整形至丸面光滑、細(xì)膩，撒蟲白蠟繼續(xù)打光40～60 min，然后加入2%硅油蠟打光至光亮，并考察丸子外觀、丸重差異、檢測(cè)丹皮酚含量、溶散時(shí)限、水分，結(jié)果見(jiàn)表8。

圖1 等高線和響應(yīng)面圖

表8 3批驗(yàn)證丸芯整形、打光后結(jié)果

4 結(jié)論

效應(yīng)面法是采用多元二次回歸方程來(lái)擬合效應(yīng)值與因素之間關(guān)系的一種優(yōu)化統(tǒng)計(jì)方法，該設(shè)計(jì)法具有精度高、預(yù)測(cè)性好的特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于藥學(xué)研究領(lǐng)域[10]。本試驗(yàn)通過(guò)單因素考察和響應(yīng)曲面分析對(duì)六味地黃丸制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終篩選出的最佳工藝參數(shù)為：浸膏相對(duì)密度1.40(30 ℃)、潤(rùn)濕劑用量(40萬(wàn)丸用量)6.58 L、干燥溫度65 ℃、干燥時(shí)間16 h，此狀態(tài)OD值為0.570 8。

5 討論

目前針對(duì)濃縮丸的干燥方式有很多中，據(jù)文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道的有微波干燥、烘箱干燥，本試驗(yàn)是按照熱風(fēng)循環(huán)烘箱開展的研究，優(yōu)化的制備工藝，待后續(xù)繼續(xù)開展等其他的干燥方式，尤其是微波干燥時(shí)對(duì)丸子內(nèi)部成分的影響，以提高產(chǎn)能和效率。另外濃縮丸的生產(chǎn)工藝不同，可能會(huì)導(dǎo)致體外溶出度的差異性，如濃縮丸藥材的粉碎程度[13]，藥粉混合的均勻性，成藥的硬度等都對(duì)其有一定的影響，故制作工藝的標(biāo)準(zhǔn)化是提高藥品質(zhì)量的重要方面[14]，在本試驗(yàn)的基礎(chǔ)上要持續(xù)優(yōu)化其他影響質(zhì)量穩(wěn)定性的因素。

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