人參中農(nóng)藥殘留在水煎及研粉吞服兩種用藥方式下溶出轉(zhuǎn)移情況研究△

楊婉珍，呂朝耕，康傳志，王升，周良云，周利，蔣靖怡，李佳興，郭蘭萍*

(1首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心/道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700；3廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院/國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣州綜合試驗(yàn)站CARS-21-16，廣東 廣州 510006)

生態(tài)農(nóng)業(yè)是中藥農(nóng)業(yè)的必由之路[1]，當(dāng)前中藥生態(tài)農(nóng)業(yè)的重要工作內(nèi)容之一就是減少和規(guī)范中藥材栽培中的農(nóng)藥使用，其中安全性評(píng)價(jià)是規(guī)范中藥材農(nóng)藥使用和中藥材農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)制定的基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)中藥材農(nóng)藥殘留進(jìn)行有效監(jiān)測是其重要環(huán)節(jié)之一。安全性評(píng)價(jià)與中藥的服用方式密切相關(guān)[2]，但目前尚未見中藥材在日常服藥方式下農(nóng)殘溶出情況的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本課題組前期通過文獻(xiàn)調(diào)研對(duì)中藥材農(nóng)藥殘留情況及現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)概況進(jìn)行了了解，發(fā)現(xiàn)人參為農(nóng)藥殘留較嚴(yán)重的一味藥材[3]。本研究在前期6批人參飲片中70種農(nóng)藥殘留檢測基礎(chǔ)上，進(jìn)而考察其中農(nóng)殘種類、殘留量較多的一批代表性樣品中7種農(nóng)藥殘留在水煎和粉末吞服兩種用藥方式下的溶出轉(zhuǎn)移情況，并對(duì)其性質(zhì)特點(diǎn)進(jìn)行探討，以期為準(zhǔn)確的中藥材農(nóng)殘風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和限量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

藥材、水煎液及人工胃腸液溶出所選用藥材為同一批在前期研究基礎(chǔ)上篩選出的購自河北安國藥材市場的人參飲片。腐霉利、六氯苯、五氯硝基苯、毒死蜱、樂果、馬拉硫磷和亞胺硫磷7種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(均為溶液標(biāo)準(zhǔn)樣品100 μg·mL-1，1 mL)購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所(各農(nóng)藥信息見表1)，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)氘代倍硫磷和氘代莠去津均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。乙腈(色譜純，德國Merck公司)；正己烷(色譜純，天津市康科德科技有限公司)；Milli-Q超純水；二氯甲烷、氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

Agilent7890A-7000B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱為HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，固定相為(5%)-二苯基-(95%)二甲基聚硅氧烷；Thermo U3000-AB SCIX Qtrap 5500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科技有限公司)，色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(150 mm×3 μm×3.5 μm)；煎藥鍋(潮州市潮安區(qū)康雅順電器有限公司)；Eppendorf 5810R離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)；Agilent 5982-0028凈化柱(安捷倫科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1水煎液制備 稱取30 g樣品(精確至0.01 g)于1 L燒杯中，稱重；加水300 mL，浸泡60 min，煎煮60 min一次，為頭煎，轉(zhuǎn)移水煎液至燒杯中；藥材再加水180 mL，煎煮40 min一次，為二煎；合并水煎液及藥渣，稱重，將水煎液過濾，存放于-4 ℃冰箱中[4-6]。

1.2.2人工胃腸液的配制 人工胃液的配制 取稀鹽酸16.4 mL，加入水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋成1 L，pH 1.5～1.8 即得。

人工腸液的配制 磷酸鹽緩沖液(含胰酶)(pH 6.8) (《中華人民共和國藥典》通則8004)取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 6.8；另取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 L，即得[7]。

表1 7種農(nóng)藥類型、溶解度及限量值信息

1.2.3人工胃腸提取液的制備 稱取藥材粉末3 g(精確至0.01 g)，加入配制好的人工胃液50 mL，置于37 ℃恒溫?fù)u床上，在避光條件下振蕩提取2 h，于6000 r·min-1離心5 min后倒出上清液為人工胃液提取液。

向殘?jiān)屑尤肴斯つc液50 mL，置于37 ℃恒溫?fù)u床上，在避光條件下振蕩提取2 h，于6000 r·min-1離心5 min后倒出上清液為人工腸液提取液[8]。每個(gè)樣品平行3次。

1.2.4樣品前處理 液體樣品 稱取水煎液50 g(人工胃液提取液或人工腸液提取液40 mL)，于250 mL分液漏斗中，分別用30 mL二氯甲烷萃取2次，靜置分層，取有機(jī)層置于裝有無水硫酸鈉的玻璃漏斗中過濾，收集濾液；水相再用正己烷萃取2次，重復(fù)上述操作，合并濾液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL左右，待凈化[9]。

固體樣品 稱取5 g樣品粉末(精確至0.01 g)，于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，15 000 r·min-1均質(zhì)提取2 min，4200 r·min-1離心10 min，取上清液于100 mL雞心瓶中。殘?jiān)?5 mL乙腈重復(fù)提取一次，離心，合并二次提取液，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL左右，待凈化[10]。

將待凈化樣品轉(zhuǎn)移至凈化柱中，雞心瓶用乙腈洗滌2次，液體轉(zhuǎn)移至凈化柱，將凈化柱漩渦振蕩1 min，離心，取上清液用微孔濾膜(0.22 μm)過濾，待測。

1.2.5樣品檢測條件 參照《中華人民共和國藥典》中農(nóng)殘檢測方法進(jìn)行檢測。線性、檢出下限、定量下限等見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參藥材中檢測結(jié)果

人參藥材檢測結(jié)果顯示70項(xiàng)指標(biāo)中共7種有檢出，這7種農(nóng)藥的類型主要包括殺菌劑、殺蟲劑和殺螨劑3類，且均未在人參中登記使用。其中六氯苯和五氯硝基苯2種農(nóng)藥出現(xiàn)超標(biāo)現(xiàn)象。六氯苯殘留量為0.175 5 mg·kg-1，超過了《中華人民共和國藥典》和《歐洲藥典》[11]限定的0.1 mg·kg-1；五氯硝基苯殘留量6.697 8 mg·kg-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出《中華人民共和國藥典》限量值0.1 mg·kg-1，相比于《歐洲藥典》的限量值1 mg·kg-1亦是超標(biāo)6倍有余?！吨腥A人民共和國藥典》未對(duì)其余5種農(nóng)藥有限量規(guī)定，若以《歐洲藥典》的限量值進(jìn)行衡量，則這5種農(nóng)藥雖有檢出但均符合規(guī)定。前期文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參中農(nóng)藥殘留總體超標(biāo)率為8.53%，涉及到的殘留量較高的農(nóng)藥有六六六、滴滴涕、五氯硝基苯、六氯苯、毒死蜱、樂果、馬拉硫磷、腐霉利等，其中六六六、滴滴涕已在我國農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布的第199號(hào)公告中明令禁止使用，在所檢測樣品中均未檢出。

2.2 水煎液及人工胃腸液中的溶出情況

人參藥材及水煎液的檢測結(jié)果見表3，水煎液中有檢出的3種農(nóng)藥腐霉利、六氯苯和五氯硝基苯的轉(zhuǎn)移率分別為0.92%、0.42%和0.02%，溶出均較低。結(jié)合溶解度來看，其中腐霉利受熱穩(wěn)定，20 ℃時(shí)在水中的溶解度為2.46 mg·L-1；六氯苯幾乎不溶于水，20 ℃時(shí)在水中的溶解度為0.004 7 mg·L-1，有0.42%轉(zhuǎn)移至水煎液中；五氯硝基苯屬于微溶物質(zhì)，20 ℃時(shí)水中溶解度為0.44 mg·L-1，雖然在原藥材中殘留量較大，但轉(zhuǎn)移至水煎液中的量同樣很低。毒死蜱、樂果、馬拉硫磷和亞胺硫磷在水煎液中均未檢測到。

表2 7種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程、檢測限及定量限

表3 人參中農(nóng)藥殘留在水煎液中的溶出轉(zhuǎn)移情況(μg·kg-1，n=3)

注：“N.D.”表示低于LOQ。

胃/腸液中農(nóng)殘檢測結(jié)果見表4。腐霉利、六氯苯和五氯硝基苯在胃液和腸液中均有溶出，總?cè)艹雎史謩e為11.46%、4.95%和1.76%，且不同農(nóng)藥在不同環(huán)境中的溶出情況不同。其中腐霉利在胃環(huán)境和小腸環(huán)境中的溶出率相近，而六氯苯和五氯硝基苯在小腸環(huán)境中溶出率明顯高于胃環(huán)境，推測應(yīng)與環(huán)境pH差異有關(guān)。在相同的環(huán)境中，不同農(nóng)藥的溶出率亦有很大區(qū)別，如在胃環(huán)境中腐霉利溶出率為6.43%，五氯硝基苯為0.55%，相差10倍之多，除了不同性質(zhì)的農(nóng)藥受pH影響程度不同外，這兩種農(nóng)藥在原藥材中殘留的初始濃度有極大差異(五氯硝基苯6 697.76 μg·kg-1，腐霉利58.79 μg·kg-1)，這是否會(huì)對(duì)溶出率產(chǎn)生影響仍有待進(jìn)一步研究。

7種農(nóng)藥中均只有腐霉利、六氯苯和五氯硝基苯在人參水煎液及胃腸溶出液中均有檢出，且其溶出在水煎液和人工胃腸液中趨勢一致，按溶出率由大到小排列為腐霉利>六氯苯>五氯硝基苯。3種農(nóng)藥在水煎液的溶出明顯低于胃腸液，本文推測可能與長時(shí)間不封閉的煎煮過程有關(guān)，為證實(shí)此推測，后續(xù)研究中對(duì)本次實(shí)驗(yàn)所得的煎后藥渣(預(yù)先冷凍干燥后保存)中農(nóng)殘情況進(jìn)行了測定，結(jié)果為：腐霉利為15.67 μg·kg-1、六氯苯為52.74 μg·kg-1、五氯硝基苯為948.35 μg·kg-1，與原藥材中殘留量仍有較大差距，表明可能是在煎煮過程中通過分解或揮發(fā)損失，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3 討論

水煎液和胃腸溶出液農(nóng)殘溶出結(jié)果顯示不同服用方式下藥材中農(nóng)殘溶出情況有較大差異，打粉吞服下農(nóng)殘暴露的風(fēng)險(xiǎn)高于煎湯服用，但總體看來，兩種方式下農(nóng)殘溶出率均在12%以下，且中藥材在臨床上以煎煮服藥方式為多，僅少數(shù)貴重藥材研粉吞服，本研究中腐霉利、六氯苯和五氯硝基苯3種殘留農(nóng)藥在水煎液中溶出率更是均在1%以下，考慮到服用方式及用藥周期，農(nóng)藥殘留通過中藥材帶給人們的風(fēng)險(xiǎn)仍應(yīng)小于每日直接食用的水果蔬菜等常規(guī)農(nóng)作物。因此，在制定中藥材農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)考慮中藥材使用的特殊性，使其既能保證藥用植物的生長的需要，又能夠保障人民的健康安全。就此而言，當(dāng)前茶葉相關(guān)農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)制定中以茶湯而非茶葉本身的殘留為依據(jù)制定茶葉MRL標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)驗(yàn)值得中藥材相關(guān)研究借鑒[12]。此外，本研究僅對(duì)兩種日常服藥方式中農(nóng)殘轉(zhuǎn)移進(jìn)行了考察，尚未考慮中成藥制藥過程中加壓、超聲等工藝對(duì)農(nóng)藥溶出的影響[13]，相關(guān)問題仍待進(jìn)一步深入研究。

目前，中藥材作為特色小作物在農(nóng)藥殘留方面的研究基礎(chǔ)與其他農(nóng)作物相比還較為薄弱。除殘留限量與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估問題研究外，中藥材農(nóng)殘問題的解決核心仍在于中藥材載培過程中農(nóng)藥的合理使用，要解決這個(gè)問題就需要①相關(guān)部門加強(qiáng)管理、完善登記制度；②加大宣傳力度，使種植者認(rèn)識(shí)到高毒高殘留農(nóng)藥的危害，鼓勵(lì)他們?cè)谒幮?duì)等情況下選用低毒、脂溶性農(nóng)藥；③大力推進(jìn)中藥材規(guī)范化種植、生態(tài)種植等模式。

表4 人參中農(nóng)藥殘留在人工胃腸液中的溶出轉(zhuǎn)移情況(μg·kg-1，n=3)

注：“N.D.”表示低于LOQ。

[1] 郭蘭萍，王鐵霖，楊婉珍，等.生態(tài)農(nóng)業(yè)——中藥農(nóng)業(yè)的必由之路[J].中國中藥雜志，2017，42(2)：231-238.

[2] 李璇.重金屬對(duì)《中國藥典》收載6種中藥材品質(zhì)的影響及其限量標(biāo)準(zhǔn)的制定[D].成都：西南交通大學(xué)，2012.

[3] 楊婉珍，康傳志，紀(jì)瑞鋒，等.中藥材殘留農(nóng)藥情況分析及其標(biāo)準(zhǔn)研制的思考[J].中國中藥雜志，2017，42(12)：2284-2290.

[4] 佚名.淺談中草藥湯劑的制法與服法[J].新醫(yī)學(xué)，1977，8(6)：295-299.

[5] 易錦錦，劉盡禮.淺談中藥湯劑的傳統(tǒng)煎法[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6(24)：131-131.

[6] 趙玉清，莊志宏.再談中藥煎服法[J].首都食品與醫(yī)藥，2016，23(12)：68-69.

[7] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[8] 周良云，岳紅，李璇，等.野生青蒿體內(nèi)重金屬的生物可給性及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J].中國中藥雜志，2015，40(10)：1904-1907.

[9] 顧炎，薛健，常琪，等.人參中殘留有機(jī)氯農(nóng)藥在人工胃腸液中的生物有效性[J].中成藥，2014，36(6)：1250-1253.

[10] GB/T 23204-2008茶葉中519種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[11] Europe pharmacopoeia:8th edition[M].Strasbourg:European Directorate for the quality of medicines and healthcare of council of europe，2013.

[12] 中國分析計(jì)量網(wǎng).以茶湯農(nóng)殘水平為依據(jù)制定茶葉MRL標(biāo)準(zhǔn)成為國際共識(shí)[J].化學(xué)分析計(jì)量，2014，23(4)：47-47.

[13] Chen H，Pan M，Liu X，et al.Evaluation of transfer rates of multiple pesticides from green tea into infusion using water as pressurized liquid extraction solvent and ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.[J].Food Chem，2017，216：1-9.