吳異蘭,王晗
(1. 福建中醫(yī)藥大學護理學院,福建福州350122;2. 福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤科,福建福州350001)
在中國,肺癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的首位[1],其中80%以上為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),70%左右的NSCLC患者在就診時已失去了手術治療的機會,化療是治療晚期NSCLC的主要手段。紫杉醇是治療NSCLC的有效藥物之一[2],但其療效受到耐藥問題的影響[3]。白藜蘆醇(resveratrol,Res)不但能對人類的鼻咽癌、肺癌、食管癌、胃癌、肝細胞癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、表皮癌及白血病等多種腫瘤細胞產生抑制作用[4-7],還可通過誘導凋亡增強耐藥細胞對化療藥物的敏感性[8]。但白藜蘆醇對肺癌紫杉醇耐藥性的作用國內外鮮有報道,本研究通過建立人肺腺癌紫杉醇耐藥細胞A549/Taxol-R,觀察白藜蘆醇作用后A549/Taxol-R細胞對紫杉醇敏感性的改變,并檢測凋亡相關蛋白的表達,探討白藜蘆醇影響A549/Taxol-R細胞紫杉醇敏感性的分子機制。
人肺腺癌細胞A549,購于中國科學院上海細胞生物研究所;白藜蘆醇(98%,HPLC)購于西安賽德公司,紫杉醇購于美國百時美施貴寶公司,Ham’s F12培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國HyClone公司,DMSO、MTT購于美國Sigma公司,Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于凱基生物公司,細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購于美國Corning公司,兔抗人 β-actin單抗、兔抗人Caspase-3 單抗、兔抗人Bcl-2單抗、兔抗人Bax單抗購于美國Cell Signaling Technology公司,羊抗兔二抗購于上海碧云天生物技術有限公司。
1.2.1 人肺腺癌紫杉醇耐藥細胞A549/Taxol-R的構建在含有10%胎牛血清的 H am’s F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)人肺腺癌細胞A549,并置于37℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中備用。參考Sun等[9]的方法,用含有低濃度紫杉醇(初始濃度為10ng/mL)的培養(yǎng)液干預細胞,在濃度遞增的作用下,連續(xù)培養(yǎng)10個月,直到細胞能于含紫杉醇的培養(yǎng)液中長期穩(wěn)定生長后將細胞凍存,2個月后復蘇,細胞仍維持在含紫杉醇培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長的能力,初步構建A549/Taxol-R細胞。
1.2.2 人肺腺癌紫杉醇耐藥株A549/Taxol-R的鑒定繪制A549/Taxol-R細胞和人肺腺癌細胞A549的生長增殖曲線,并按Patterson公式計算二者不同的細胞群體倍增時間(doubling time, tD) , tD= tC× lg2/(lgNt - lgNo),其中 No指初始細胞數, Nt指終末細胞數, tC指培養(yǎng)的時間(h)。另用MTT藥敏實驗計算A549/Taxol-R的耐藥指數(R I值)。 R I=I C50(A549/Taxol-R)/I C50(A549)。通過以上方法鑒定是否成功構建A549/Taxol-R細胞。
1.2.3 MTT法將A549/Taxol-R細胞懸液按5×104/mL分別等量接種于96孔板,將培養(yǎng)板置于37℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換含不同濃度(5、10、20、50、100、200μmol/L)白藜蘆醇的培養(yǎng)基,每個濃度再分為3組,每組設8個復孔。測定時間點分別為繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后,同時以DMSO為對照組。在各組測定時間點每孔加入5mg/mL的MTT20 μL,繼續(xù)孵育4h,吸棄培養(yǎng)液加入DMSO,在酶標儀上測定其在490nm處的吸光度 D (490)值,取其平均值計算細胞抑制率,觀察白藜蘆醇對A549/Taxol-R細胞的影響。細胞存活率=[D( 4 90)實驗組/ D(490)對照組]×100%;細胞抑制率=[1-D( 4 90)實驗組/ D(490)對照組]×100%。用上述方法備板及MTT方法觀察不同濃度(5、10、20、50、100μmol/L)白藜蘆醇處理A549/Taxol-R 細胞24h后,紫杉醇對各處理組細胞的 IC50,判斷白藜蘆醇對A549/Taxol-R細胞紫杉醇敏感性的影響。
1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡實驗分為4組,分別為空白對照組、20μmol/L白藜蘆醇組、2.5μg/mL紫杉醇組、2.5μg/mL紫杉醇+20μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合組。分別處理A549/Taxol-R細胞24h后用0.25%胰酶消化細胞,800r/min離心5min,棄上清液后用預冷的4℃ PBS洗滌細胞2次,充分去除胰酶和EDTA的干擾,重懸細胞,調節(jié)細胞濃度至約1×106/mL,按照說明用無染色細胞為存活細胞,Annexin V-FITC/PI試劑盒進行染色。室溫下避光孵育15min,加入Bingding Buffer,上機檢測。實驗結果判讀:無染色細胞為存活細胞,Annexin V單染細胞為早期凋亡細胞,Annexin V、PI雙染細胞為晚期凋亡或壞死細胞,PI單染細胞為機械性損傷細胞(實驗操作過程誤差)。
1.2.5 Western blot檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達實驗分組同1.2.4,分別處理A549/Taxol-R細胞24h后,收集細胞,提取總蛋白,BCA試劑盒定量。上樣同樣質量總蛋白后電泳、轉膜、封閉,一抗4℃振搖孵育過夜,二抗室溫孵育2h后用ECL顯色系統(tǒng)顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描曝光后的膠片,用ImageJ軟件分析圖片中條帶灰度值。實驗重復3次。
使用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以表示,多組之間均數比較使用單因素方差分析,MTT試驗中 IC50值(95%可信區(qū)間)使用Probit回歸分析。檢驗水準 α=0.05。
體外細胞生長增殖曲線顯示,A549/Taxol-R細胞較其親本細胞增殖速度有所減慢,細胞群體倍增時間有所延長,由(31.66±0.57)h增加到(36.46±1.09)h,但仍符合腫瘤細胞增殖特征。經MTT實驗測得紫杉醇對A549的 IC50為(1.58±0.45)μg/mL,紫杉醇對A549/Taxol-R的 IC50為(18.00±4.71)μg/mL, R I值為11.4,屬于中度耐藥[10],符合實驗要求。
MTT試驗檢測結果見圖1,可見隨著濃度的提高和作用時間的延長,白藜蘆醇對A549/Taxol-R細胞的抑制率上升,白藜蘆醇對A549/Taxol-R細胞的抑制率具有濃度效應和時間效應(P均<0.05)。白藜蘆醇3個不同干預時間(24、48和72h)對A549/Taxol-R細胞的 IC50值分別為55.7、39.2、29.5μmol/L。
圖1 不同時間和濃度的白藜蘆醇對 A 549/Taxol-R細胞的影響
MTT檢測結果(圖2)顯示,隨著白藜蘆醇濃度的提高 (5、 10、 20、 50、 100μmol/L), 紫 杉 醇 對 A549/Taxol-R細胞的IC50值下降,分別為(17.50±1.24)、(13.40±1.12)、(9.39±0.97)、(6.36±0.80)和(4.18±0.62)μg/mL,即A549/Taxol-R細胞對紫杉醇敏感性上升。
圖2 紫杉醇對不同濃度白藜蘆醇處理組 A 549/Taxol-R細胞的IC50
根據2.3實驗結果,選擇2.5μg/mL的紫杉醇和20 μmol/L的白藜蘆醇用于后續(xù)細胞凋亡研究。流式細胞儀檢測結果見表1,由儀器自動計數細胞得出各亞群細胞比例,依照試劑盒說明書進行實驗結果判讀。白藜蘆醇和紫杉醇聯(lián)合干預組的A549/Taxol-R早期凋亡率、晚期凋亡率+壞死率均高于紫杉醇單獨干預組,白藜蘆醇和紫杉醇聯(lián)合干預組的細胞存活率低于紫杉醇單獨干預組(P 均<0.05)。
表1 白藜蘆醇-和紫杉醇聯(lián)合干預對 A 549/Taxol-R細胞凋亡率和壞死率的影響(%,x±s)
Western blot結果顯示,白藜蘆醇和紫杉醇聯(lián)合處理組與單獨使用紫杉醇組相比,Bax、Caspase-3的表達明顯上調,而Bcl-2的表達明顯下調。見圖3和表2。
圖3 凋亡相關蛋白 B ax、 B cl-2 和C aspase-3的表達
目前有大量研究表明白藜蘆醇可誘導多種腫瘤細胞凋亡[11],并通過抑制細胞色素P450酶、誘導解毒酶、抑制環(huán)氧酶2、干擾細胞周期、抑制血管合成、抗核轉錄因子NF-κB和促進腫瘤細胞凋亡和分化等途徑對腫瘤的起始、促進和進展3個階段起到抑制作用[12]。 因此可推測,白藜蘆醇可通過誘導A549/Taxol-R細胞凋亡逆轉其對紫杉醇的耐藥性,本研究進一步證實了這一觀點。
Bcl-2家族、Caspase家族在細胞凋亡過程中起到重要的作用。 B cl-2基因可以通過抑制細胞凋亡,延長細胞壽命來促進腫瘤的發(fā)生[13]。Bcl-2的過表達可通過抑制細胞色素C等從線粒體的釋放來抑制Caspase-3 的活化,而Caspase-3同時又是Bcl-2的生理性蛋白酶[14]。Bax也屬于 B cl-2基因家族,是重要的促凋亡蛋白,未激活時存在于胞漿中,誘導凋亡時活化的Bax 移位至線粒體建立膜通道,促使線粒體釋放細胞色素C和其他的促凋亡因子,激活Caspase家族蛋白使細胞凋亡,Bcl-2基因則參與調控這一過程[15-16]。 B cl-2 基因與Bax基因表達產物的比例對于細胞最終是否進入細胞凋亡程序極為重要,而Caspase-3則是細胞凋亡終末途徑的效應蛋白,其活性受到兩者調控[17-18]。
課題組前期的體外研究也證明了白藜蘆醇不但能夠抑制胃癌細胞株的增殖[19],而且能誘導其發(fā)生凋亡[20];體內研究證實了白藜蘆醇能夠誘導裸鼠胃癌移植瘤細胞的凋亡作用,并且與上調Bax和下調Bcl-2表達有關[21]。白藜蘆醇誘導細胞凋亡的效應也被證實受Caspase-3活性決定,同時還受到Bax、Bcl-2調控[21]。
本研究中觀察到 , 白藜蘆醇和紫杉醇聯(lián)合干預組相較于單獨使用紫杉醇組,細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率或壞死率均升高,其Bax、Caspase-3的表達明顯上調,而Bcl-2的表達明顯下調。說明白藜蘆醇可能通過促進細胞的凋亡及壞死來提高A549/Taxol-R細胞對紫杉醇的敏感性,其機制可能通過促進Bax、Caspase-3的表達, 下調Bcl-2的表達而實現(xiàn)。
由于白藜蘆醇在植物中分布十分廣泛而且含量較高,故白藜蘆醇對非小細胞肺癌耐藥的影響作用研究,不但可望降低NSCLC的耐藥性,提高化療藥物的治療效果,節(jié)約醫(yī)療資源,提高人群的健康水平,同時也可促進含白藜蘆醇的天然植物資源的開發(fā)利用,其應用和發(fā)展前景十分廣闊,具有良好的社會效益和經濟效益。
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