肉蓯蓉苯乙醇總苷抗肝癌作用的實(shí)驗(yàn)研究

胡瓊，由淑萍，劉濤， *，汪波，劉昕，蔣遠(yuǎn)東

（1．新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆烏魯木齊830011；2．新疆醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，新疆烏魯木齊830011）

肉蓯蓉(cistanche)主產(chǎn)于新疆、內(nèi)蒙古阿拉善盟，素有“沙漠人參”之美譽(yù)，具有極高的藥用價(jià)值，是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，其味甘、咸，性溫，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血、潤(rùn)腸通便的作用，常用于治療男子陽(yáng)痿、女子不孕、腰膝冷痛、血枯便秘等癥[2]。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)肉蓯蓉的化學(xué)成分進(jìn)行了大量的研究，包括苯乙醇總苷(phenylethanol glycosides from cistanche，CPhGs)、環(huán)烯醚萜類、木脂素類、多糖、生物堿等，其中最主要的成分為CPhGs[3-4]，現(xiàn)代藥理研究表明CPhGs具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)記憶、助陽(yáng)等多種藥理活性，同時(shí)課題組成員前期對(duì)CPhGs進(jìn)行的大量研究表明CPhGs具有抗肝纖維化的作用[5-7]。本實(shí)驗(yàn)用肉蓯蓉藥材中分離得到的CPhGs，研究其對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠的抗肝癌作用，旨在為CPhGs的抗肝癌作用機(jī)制及相關(guān)健康產(chǎn)品及藥品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

肉蓯蓉苯乙醇總苷(CPhGs)由新疆藥物研究所趙軍研究員提取分離并鑒定，純度為70%[8]，試驗(yàn)時(shí)用0.5%羧甲基纖維素鈉(0.5%CMC-Na)溶解，配制成不同濃度，4℃保存，1周內(nèi)使用。

SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，60只，體質(zhì)量18~22 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)為SCXK(新)2016-0002，使用許可證號(hào) 為 SYXK(新)2016-0003。

1.2 細(xì)胞株

小鼠H22肝癌細(xì)胞株，由武漢普諾賽生命科技有限公司提供，貨號(hào)CL-0341。

1.3 儀器及主要試劑

低速離心機(jī)(70L-5-A型，上海安亭)；CO2培養(yǎng)箱(Heal Force，HF240)；電熱恒溫水槽(DK-8D，上海一恒科技有限公司)；酶標(biāo)儀(Bio-rad)；游標(biāo)卡尺(上海將來(lái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電子天平(常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司)。

肝復(fù)樂(lè)為康普藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20060389)；RPMI-1640培養(yǎng)基和1%雙抗(以色列BI公司)；胎牛血清(Gibco，美國(guó))；0.4%臺(tái)盼藍(lán)和4%多聚甲醛(北京索萊寶)；小鼠腫瘤壞死因子 α( TNF- α)、白介素2(IL-2)、甲胎蛋白(AFP)ELISA試劑盒(武漢華美)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 肝癌H22荷瘤小鼠模型的建立于37℃復(fù)蘇H22細(xì)胞，離心棄上清，加入新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞快速?gòu)?fù)蘇，體外培養(yǎng)活細(xì)胞達(dá)95%以上，至細(xì)胞密度達(dá)1×106/mL時(shí)接種于小鼠腹腔，每只0.2mL。約8~l0d傳代一次。無(wú)菌抽取培養(yǎng)至8d左右的小鼠腹腔H22瘤液，生理鹽水稀釋調(diào)整瘤細(xì)胞數(shù)為l×107/mL，充分混勻，備用。除空白對(duì)照組在同部位注射等量生理鹽水外，其余各組小鼠經(jīng)消毒后，于其前肢右側(cè)腋下接種H22瘤細(xì)胞懸液，每只0.2 mL[9-10]，造模24h后每天觀察瘤體生長(zhǎng)情況。

1.4.2 分組及給藥隨機(jī)將上述造模的H22荷瘤小鼠分為5組，分別為模型組，陽(yáng)性治療組(肝復(fù)樂(lè)1351.5 mg/kg)[11]，CPhGs高(500mg/kg)、中(250mg/kg)、低(125 mg/kg)劑量組，每組10只。于造模24h后開始灌胃給藥，除空白對(duì)照組和模型組給予同體積的0.5%CMCNa溶液外，其余各組分別按照給定劑量灌胃給予陽(yáng)性藥物或CPhGs，連續(xù)10d[12-13]。期間每天觀察荷瘤小鼠精神活動(dòng)狀態(tài)、右腋膨隆大小及出現(xiàn)時(shí)間、毛色及食欲等情況。末次給藥24h后，稱質(zhì)量，摘眼球取血，分離血清備用；頸椎脫臼法處死小鼠，分離脾臟、肝臟，稱質(zhì)量，計(jì)算肝脾系數(shù)；完整剝?nèi)×鲶w，濾紙拭干凈后稱質(zhì)量，計(jì)算各組小鼠的腫瘤抑制率；瘤體組織行病理組織學(xué)檢測(cè)。

1.4.3 檢測(cè)指標(biāo)①脾臟和肝臟系數(shù)測(cè)定：各組小鼠處死后分別剪取脾臟和肝臟并稱質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。②瘤質(zhì)量及抑瘤率測(cè)定：末次給藥24h后，頸椎脫臼法處死小鼠并稱體質(zhì)量，完整剝?nèi)×鲶w，用濾紙擦拭干凈后置電子天平上稱瘤質(zhì)量，根據(jù)瘤質(zhì)量計(jì)算各給藥組小鼠的腫瘤抑制率，抑癌率=(模型組瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量)/模型組瘤質(zhì)量×100%。③摘眼球取血后，分離血清-80℃保存待檢。按ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清中IL-2、TNF-α和AFP含量。④腫瘤組織病理學(xué)檢查：各組瘤體用4%多聚甲醛固定24h后，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察腫瘤組織病理學(xué)改變，以腫瘤細(xì)胞壞死的面積大小初步判定CPhGs藥物的治療效果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，以單因素方差分析進(jìn)行多組 間 數(shù)據(jù)比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況觀察

給藥前，各組間小鼠體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組在試驗(yàn)過(guò)程中由于灌胃操作有2只小鼠死亡。給藥后，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量隨腫瘤的生長(zhǎng)而增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性治療組和CPhGs各劑量組小鼠體質(zhì)量均有一定的下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。試驗(yàn)第4d開始，小鼠腋下開始出現(xiàn)膨隆，動(dòng)物精神活動(dòng)狀態(tài)變差，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，食欲減退，毛色變暗淡。模型組最先出現(xiàn)腫瘤塊，且生長(zhǎng)速度最快，以上反應(yīng)最明顯，CPhGs低、中劑量組次之，高劑量組和陽(yáng)性治療組腫瘤生長(zhǎng)較慢，生存質(zhì)量較好，未見明顯的不良反應(yīng)(見表1)。

表1 肉蓯蓉CPhGs對(duì)H22荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響(-x±s)

2.2 肉蓯蓉CPhGs對(duì)H22荷瘤小鼠脾臟和肝臟系數(shù)的影響

表2結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組脾臟系數(shù)明顯減少、肝臟系數(shù)明顯增大(P均<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性治療組、CPhGs各劑量組脾臟系數(shù)明顯增大、肝臟系數(shù)明顯降低(P均<0.01)，表明CPhGs可在一定程度上提高荷瘤小鼠的免疫功能，抑制肝臟受損。

表2 肉蓯蓉 C PhGs對(duì) H 22荷瘤小鼠臟器系數(shù)的影響(-x± s)

2.3 肉蓯蓉CPhGs對(duì)H22荷瘤小鼠瘤體生長(zhǎng)的影響

表3結(jié)果顯示，與模型組比較，陽(yáng)性治療組與CPhGs中、高劑量組H22荷瘤小鼠瘤質(zhì)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，陽(yáng)性治療組及CPhGs中、高劑量組腫瘤抑制率分別為56.91%、52.97%和35.80%。

2.4 肉蓯蓉CPhGs對(duì)H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α和AFP含量的影響

由表4可見，與空白對(duì)照組比較，模型組TNF-α和AFP含量顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性治療組與CPhGs中、高劑量組IL-2含量均明顯增加(P均<0.05)；陽(yáng)性治療組和CPhGs各劑量組TNF-α含量均明顯減少(P<0.05)；陽(yáng)性治療組與CPhGs中、高劑量組AFP含量均明顯下降(P<0.05)；CPhGs高劑量組IL-2含量、TNF-α含量及AFP含量與陽(yáng)性治療組更接近，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示肉蓯蓉CPhGs可促進(jìn)IL-2的表達(dá)，抑制TNF-α與AFP的表達(dá)，且高劑量組效果更好。

表3 肉蓯蓉CPhGs對(duì)H22荷瘤小鼠瘤體生長(zhǎng)的影響(-x±s)

表4 肉蓯蓉CPhGs對(duì)H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α和AFP含量的影響(-x±s)

2.5 腫瘤組織病理學(xué)觀察

大體可見：模型組瘤體較大，表面顏色淡紅，質(zhì)地較軟，與周圍組織分界較清楚，剖面滲血較多。CPhGs各劑量組腫瘤組織邊緣區(qū)毛細(xì)血管明顯減少，腫瘤瘤體較小，表面灰白，質(zhì)地較韌，剖面灰白，中央?yún)^(qū)可見壞死，切面滲血較少。

光鏡HE染色(圖1)可見：模型組荷瘤小鼠的癌組織中，有大量的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核著色均勻，形態(tài)清晰，細(xì)胞間質(zhì)較少。與模型組相比較，給藥組腫瘤組織中細(xì)胞數(shù)明顯減少，形態(tài)不規(guī)則，異質(zhì)性降低，細(xì)胞核破碎，并伴有大量細(xì)胞壞死，壞死周邊有大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)(包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，如圖中箭頭所示)，且高劑量組CPhGs腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)域出現(xiàn)肉芽組織的修復(fù)，其中CPhGs不同劑量組隨著給藥劑量的增加，腫瘤細(xì)胞的壞死面積也在增大，而CPhGs高劑量組與陽(yáng)性治療組有相當(dāng)量的腫瘤細(xì)胞壞死，因此，可以初步判斷CPhGs對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠具有良好的治療效果。

圖1 CPhGs對(duì)肝癌荷H22 瘤 小鼠的治療效果(H E染 色，× 2 00)

3 討論

原發(fā)性肝癌是一種臨床上常見的惡性腫瘤，占我國(guó)腫瘤發(fā)病率的第4位，死亡率的第2位[14]，其防治仍是我國(guó)目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。傳統(tǒng)中藥在控制患者病情發(fā)展、改善癥狀體征及提高生存質(zhì)量等方面的優(yōu)勢(shì)日漸顯現(xiàn)，為從我國(guó)中藥中尋找低毒、高效的抗肝癌作用的藥物，本課題采用H22肝癌細(xì)胞制備H22荷瘤小鼠腫瘤模型，將不同劑量的CPhGs處理組與模型對(duì)照組和肝復(fù)樂(lè)陽(yáng)性治療組進(jìn)行比較，探索CPhGs對(duì)H22荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤的作用及其機(jī)制。

結(jié)果顯示，模型組最先出現(xiàn)腋下腫瘤膨隆且生長(zhǎng)最快，小鼠精神狀態(tài)變差、食欲下降、毛色開始暗淡等反應(yīng)，CPhGs低、中劑量組次之，高劑量組和肝復(fù)樂(lè)陽(yáng)性治療組較慢，且CPhGs各劑量組小鼠體質(zhì)量和肝復(fù)樂(lè)陽(yáng)性治療組均無(wú)明顯的下降，提示CPhGs藥物可以相對(duì)改善H22荷瘤小鼠的生存質(zhì)量、降低腫瘤對(duì)機(jī)體的毒性。CPhGs各劑量組、肝復(fù)樂(lè)陽(yáng)性治療組瘤質(zhì)量均明顯低于模型對(duì)照組，且高劑量組腫瘤抑制率與肝復(fù)樂(lè)陽(yáng)性治療組相當(dāng)，提示CPhGs對(duì)H22荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤具有一定的抑制作用，另外，本研究結(jié)果顯示，肝復(fù)樂(lè)陽(yáng)性治療組和CPhGs各劑量組的脾臟系數(shù)均高于模型組，而肝臟系數(shù)均低于模型對(duì)照組，提示CPhGs在發(fā)揮抑制腫瘤作用的同時(shí)在一定程度上提高了荷瘤小鼠的免疫功能且對(duì)肝臟也有保護(hù)作用，但對(duì)脾臟及肝臟的作用與肝復(fù)樂(lè)無(wú)明顯差異。

IL-2是免疫系統(tǒng)中的一類細(xì)胞生長(zhǎng)因子，參與細(xì)胞免疫，在機(jī)體復(fù)雜免疫網(wǎng)絡(luò)中起中心調(diào)節(jié)作用，能夠通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞增殖和分化等作用提高機(jī)體的免疫機(jī)能，并能產(chǎn)生具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)IL-2可促進(jìn)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞的存活、擴(kuò)增及活化，這種細(xì)胞是淋巴細(xì)胞與IL-2接觸后產(chǎn)生的一種具有高效抗腫瘤細(xì)胞的殺傷細(xì)胞，且這種殺傷細(xì)胞只識(shí)別腫瘤抗原，對(duì)宿主正常細(xì)胞無(wú)影響[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CPhGs高、中劑量組可顯著提高小鼠IL-2的含量，表明CPhGs可增強(qiáng)H22荷瘤小鼠的免疫能力，有利于機(jī)體殺傷腫瘤細(xì)胞。

TNF-α是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接抗腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一[17-18]。TNF通過(guò)與受體結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)宿主免疫功能、作用腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管功能紊亂，繼而引起腫瘤出血壞死等途徑來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[19]，但TNF-α在腫瘤中表現(xiàn)出兩重性，既可致腫瘤壞死，也可促腫瘤的生長(zhǎng)[20-21]。在正常機(jī)體內(nèi)TNF-α的濃度較低，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管形成血栓而發(fā)生出血壞死、增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫功能等作用；同時(shí)TNF作為一個(gè)內(nèi)源性的腫瘤促進(jìn)因素，由腫瘤細(xì)胞本身產(chǎn)生的TNF-α可以刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用；因此，TNF-α的生物學(xué)作用與其體內(nèi)的水平高低密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組TNF-α明顯升高，這與腫瘤的TNF-α升高一致，CPhGs各劑量組小鼠TNF-α水平顯著下降，表明CPhGs具有抑制H22荷瘤小鼠血清中TNF-α異常升高的作用，抑制腫瘤的發(fā)生。

正常情況下，AFP主要來(lái)自胚胎的肝細(xì)胞，胎兒出生后約兩周AFP從血液中消失，因此正常成年人血清中AFP的含量尚不到20μg/mL[22]。在成人，AFP可以在大約80%肝癌患者血清中升高[23]。當(dāng)人肝細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，其恢復(fù)產(chǎn)生AFP這種蛋白的功能，而且隨著病情惡化它在血清中的含量也會(huì)急劇增加。AFP作為診斷原發(fā)性肝癌的一個(gè)特異型臨床指標(biāo)，血清AFP濃度通常與肝癌大小呈正相關(guān)[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CPhGs高、中劑量組可顯著降低小鼠AFP的含量，表明CPhGs能夠抑制H22荷瘤小鼠血清中AFP的表達(dá)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

HE染色可見，與模型組比較，CPhGs能明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，瘤細(xì)胞異質(zhì)性降低，并伴有大量細(xì)胞壞死，其中CPhGs不同劑量組隨著給藥劑量的增加，腫瘤細(xì)胞的壞死面積也在增大，而CPhGs高劑量組與肝復(fù)樂(lè)陽(yáng)性治療組有相當(dāng)量的腫瘤細(xì)胞壞死，提示CPhGs對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠具有良好的抑瘤效果。

綜上，CPhGs具有良好的抗肝癌作用，可能與CPhGs降低荷瘤小鼠血清中AFP含量及提高荷瘤小鼠免疫能力有關(guān)。本研究為利用肉蓯蓉中CPhGs成分開發(fā)新的抗肝癌藥物提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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