矮壯素對(duì)小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1骨骼發(fā)育相關(guān)基因及蛋白的影響及其機(jī)制

賈麗霞，張琪，侯曉紅，孟慶賀，黃堯，周文娟，郝衛(wèi)東*

（北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191）

矮壯素是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可抑制植物中赤霉素的合成，促進(jìn)植株生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)品的質(zhì)量[1]。作為谷物主要的抗倒伏植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，殘留的矮壯素極有可能通過(guò)谷物秸稈作為動(dòng)物飼料的方式進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，然后通過(guò)肉類產(chǎn)品進(jìn)入人體[2]。目前我國(guó)矮壯素的殘留問(wèn)題還比較突出，2012年李春梅等[3]檢測(cè)出我國(guó)部分肉類產(chǎn)品中矮壯素的濃度范圍為0.4~636.0μg/kg，其中雞肉和羊肉的含量最高，分別為636.0和486.0μg/kg。本實(shí)驗(yàn)室前期一項(xiàng)對(duì)青春發(fā)育期大鼠的研究顯示，矮壯素對(duì)大鼠的骨骼發(fā)育有明顯影響。通過(guò)對(duì)大鼠灌胃給予矮壯素，發(fā)現(xiàn)在150和300 mg/kg的劑量下大鼠的股骨和脛骨長(zhǎng)度都明顯變小，高劑量組下骨密度值也發(fā)生明顯變化，病理檢查發(fā)現(xiàn)股骨近端生長(zhǎng)板明顯變薄[4]。

本研究選用MC3T3-E1小鼠前成骨細(xì)胞對(duì)矮壯素的毒性作用進(jìn)行研究。MC3T3-E1細(xì)胞可以表達(dá)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2，BMP2)、生長(zhǎng)激素受體(growth hormonereceptor，GHR)等促進(jìn)骨骼發(fā)育的功能蛋白。本研究通過(guò)檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞中骨骼發(fā)育相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)以及MAPK信號(hào)通路的變化情況，進(jìn)一步探討矮壯素對(duì)骨骼發(fā)育的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)集存庫(kù)(American Type Culture Collection，ATCC)細(xì)胞庫(kù)。將MC3T3-E1小鼠前成骨細(xì)胞培養(yǎng)于FBS體積分?jǐn)?shù)為10%的 α-MEM培養(yǎng)液中(含100U/mL的青霉素和鏈霉素)，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿80%瓶底面積時(shí)，用0.25%胰酶消化，按1∶3比例傳代。

1.2 藥物與試劑

矮壯素購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；TransZol Up試劑購(gòu)于中國(guó)北京全式金生物(TransGen Biotech)公司；Prime-ScriptTMRT-PCR Kit試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒均購(gòu)于日本TaKaRa公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白裂解液購(gòu)于中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；BMP2抗體、GHR抗體、Tubulin抗體均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；Runx2抗體、ALP抗體均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；MAPK通路抗體(p-ERK、ERK、p-JNK、JNK)均購(gòu)于美國(guó)CST公司；硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT)購(gòu)于北京欣熙源生物科技有限公司，所用引物均由北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成；其他常用試劑均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

1.3 器材與儀器

超凈工作臺(tái)購(gòu)于日本AirTech公司；熒光定量PCR(iCycler)、基因擴(kuò)增儀、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；超聲破碎儀(VerSonic100)購(gòu)于美國(guó)VirTis公司；核酸蛋白濃度測(cè)定儀(nanophotometer P330)購(gòu)于美國(guó)Implen公司；二氧化碳培養(yǎng)箱(HERA Cell型)購(gòu)于德國(guó)Heraeus公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于德國(guó)Omega公司；倒置顯微鏡購(gòu)于重慶儀器廠；化學(xué)發(fā)光儀(Tanon-4500型)購(gòu)于北京平原皓生物技術(shù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 MTT法檢測(cè)矮壯素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)存活率的影響將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1用0.25%胰酶消化，以含10%FBS的 α-MEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，然后按5×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μL，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞完全貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，分別更換濃度為8、40、200、1000 μg/mL的矮壯素染毒液，以不含矮壯素的細(xì)胞孔作為正常對(duì)照組，不含細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照組，每組重復(fù)6孔，隔天換液，染毒時(shí)間分別為24、48、72h。待染毒結(jié)束前4h于板孔中加入5mg/mL的MTT20μL，繼續(xù)孵育4h后，取出培養(yǎng)板，輕輕吸棄孔內(nèi)液體，于每孔中加入150μL DMSO(分析純)，室溫振蕩，使結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀562nm處測(cè)定各孔吸光度 D (562)值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率=[D(562)實(shí)驗(yàn)組- D(562)空白組]/[D( 5 62)對(duì)照組-D (562)空白組]。

1.4.2 熒光定量PCR檢測(cè)矮壯素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞骨骼發(fā)育相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響PCR基因引物由奧科生物公司合成，結(jié)果見(jiàn)表1。以0μg/mL矮壯素作為對(duì)照組，8、40、200、1000μg/mL矮壯素染毒48h后經(jīng)消化處理，收集細(xì)胞，酚氯仿法提取總RNA，驗(yàn)證總RNA完整性，使用Nano-drop2000測(cè)定總RNA樣品純度和濃度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime-ScriptTMRTPCR Kit)以O(shè)ligo dT為引物將1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-Time PCR按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△CT計(jì)算各基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 檢測(cè)基因引物序列

1.4.3 Western blot檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)及MAPK信號(hào)通路的變化情況矮壯素染毒48h后經(jīng)消化處理，收集細(xì)胞。使用RIPA提取細(xì)胞總蛋白，然后使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。使用SDSPAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)至NC膜，使用3%BSA進(jìn)行磷酸化蛋白的封閉，5%脫脂奶粉進(jìn)行非磷酸化蛋白的封閉，室溫孵育2h后，各自分別按照1∶1000的稀釋比例加入相應(yīng)測(cè)定蛋白(ALP、BMP2、Runx2、GHR、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、Tunbulin)的一抗，包括，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌5min， 共5次，山羊抗小鼠二抗(1∶5000)和山羊抗兔二抗(1∶5000)室溫輕搖孵育2h，TBST洗滌5min，共2次，TBS洗滌 1次。將化學(xué)發(fā)光試劑盒A液和B液混合并覆蓋于NC膜上，于凝膠成像系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組指標(biāo)比較均采用單因素方差分析，以 α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 矮壯素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1，不同劑量(8~1000μg/mL)矮壯素在染毒24、48h時(shí)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性，染毒72 h 時(shí)，1 0 00 μ g/mL組的細(xì)胞相對(duì)存活率與對(duì)照組相比雖然降低(P<0.05)，但其相對(duì)存活率仍高于80%。

圖1 矮壯素染毒不同時(shí)間對(duì)M C3T3-E1細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

2.2 矮壯素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

熒光定量PCR檢測(cè)矮壯素染毒48h后細(xì)胞中ALP、OCN、GHR、IGF-1mRNA表達(dá)情況，如圖2所示：ALP和OCN作為成骨細(xì)胞定向分化的標(biāo)志物，其mRNA表達(dá)量隨著矮壯素劑量的升高呈上升趨勢(shì)，在1000 μg/mL劑量組mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05或P<0.01)；GHR和IGF-1的mRNA的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。

圖2 不同濃度矮壯素染毒 4 8h后對(duì)MC3T3-E1 細(xì) 胞成骨相關(guān)基因 m RNA 表達(dá)的影響

2.3 矮壯素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞破骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

熒光定量PCR檢測(cè)矮壯素染毒48h后細(xì)胞中RANKL、OPG、IGF-1mRNA表達(dá)情況，如圖3所示：在1000μg/mL的劑量組，RANKL mRNA表達(dá)明顯上升(P<0.01)，M-CSF和OPG mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RANKL與OPG的比值，在1000μg/mL劑量組明顯升高(P<0.05)。

圖3 不同濃度矮壯素染毒 4 8h后對(duì)MC3T3-E1 細(xì) 胞破骨相關(guān)基因 m RNA 表達(dá)的影響

2.4 矮壯素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞骨骼發(fā)育相關(guān)蛋白的影響

Westerm blot檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、BMP2、GHR、Runx2蛋白的表達(dá)情況，如圖4所示：矮壯素染毒48h后，ALP蛋白的表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生明顯的變化；BMP2、Runx2蛋白的表達(dá)量在1000μg/mL劑量組明顯降低；GHR蛋白在8、40、200、1000μg/mL劑量組均明顯降低。

圖4 矮壯素染毒 4 8h后對(duì)M C3T3-E1細(xì)胞骨骼發(fā)育相關(guān)蛋白的影響

2.5 矮壯素染毒48h后MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化

Western blot檢測(cè)矮壯素染毒48h后MC3T3-E1細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化情況，如圖5所示：不同濃度矮壯素染毒48h后，磷酸化JNK的表達(dá)量明顯升高，而磷酸化ERK的表達(dá)量明顯降低。

圖5 矮壯素染毒48h后MC3T3-E1細(xì)胞MAPK通路相關(guān)蛋白的變化情況

3 討論

骨骼發(fā)育一般通過(guò)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行調(diào)節(jié)[5]。成骨細(xì)胞是體內(nèi)骨發(fā)育形成的關(guān)鍵細(xì)胞，對(duì)骨的發(fā)育、損傷修復(fù)、以及骨的代謝平衡和骨量的維持起著至關(guān)重要的作用?；钴S的成骨細(xì)胞具有典型的蛋白合成結(jié)構(gòu)，富含線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體發(fā)達(dá)等。成骨細(xì)胞富含較高的ALP，可以合成I型膠原，合成并分泌骨基質(zhì)，表達(dá) O CN和OPN基因，能夠吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子，具有在條件培養(yǎng)基中鈣化的能力等，因此在骨形成過(guò)程中起到極其重要的作用[6]。

研究結(jié)果顯示，矮壯素對(duì)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1無(wú)明顯細(xì)胞毒性，但可影響其骨骼發(fā)育相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)。ALP作為成骨細(xì)胞早期分化標(biāo)志，其表達(dá)量的多少影響著成骨細(xì)胞的分化[7-8]。OCN是由分化期成骨細(xì)胞分泌的蛋白，可反映成骨細(xì)胞的活躍程度[9]。生長(zhǎng)激素(GH)和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)具有促進(jìn)合成的作用，可以增加骨形成蛋白的表達(dá)量，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。同時(shí)，GH與靶器官的GHR結(jié)合發(fā)揮直接和間接的促生長(zhǎng)作用，可以通過(guò)增強(qiáng)成骨細(xì)胞的功能從而增加骨的厚度而增加骨強(qiáng)度[10]。研究中測(cè)定ALP和OCN的mRNA的變化情況，發(fā)現(xiàn)矮壯素染毒48h后，ALP和OCN的 mRNA表達(dá)量均明顯上升，但ALP蛋白表達(dá)量并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。同時(shí)在基因水平上檢測(cè)生長(zhǎng)激素受體(GHR)和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)的變化情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白的mRNA表達(dá)量并未發(fā)生明顯變化；但在蛋白水平上，隨著染毒劑量的增加，GHR蛋白表達(dá)量明顯減少。該結(jié)果表明，矮壯素可能影響ALP和OCN的轉(zhuǎn)錄水平，但對(duì)ALP蛋白的翻譯影響作用較小。并且矮壯素對(duì)GHR和IGF-1的轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯作用，但是抑制了GHR的翻譯，導(dǎo)致GHR的表達(dá)量明顯減少，這可能會(huì)影響生長(zhǎng)激素對(duì)成骨細(xì)胞的作用，從而抑制成骨細(xì)胞的分化。

RANKL/RANK/OPG是研究骨骼發(fā)育的一個(gè)重要信號(hào)通路，主要調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的信息交流。RANKL是核因子 κB受體活化因子配體，是RANK的相關(guān)配體，RANK是一種Ⅰ型跨膜蛋白，屬于TNF受體家族，表達(dá)于許多細(xì)胞的表面，如破骨細(xì)胞前體[11-12]。在M-CSF存在的前提下，RANKL結(jié)合表達(dá)于破骨細(xì)胞前體的受體RANK，通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟與分化。與RANK和RANKL不同，OPG不具有跨膜和胞質(zhì)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，OPG通過(guò)阻止RANKL與RANK的結(jié)合，起負(fù)調(diào)節(jié)作用[13]。因此當(dāng)RANKL/OPG的比例發(fā)生變化則可能影響破骨細(xì)胞的分化。本研究在mRNA水平上檢測(cè)M-CSF、RANKL、OPG的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)RANKL的表達(dá)量明顯上升(P<0.01)；MCSF 的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，OPG的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，但其變化趨勢(shì)都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析RANKL/OPG其相對(duì)表達(dá)量，顯示出明顯升高(P<0.01)，因此推測(cè)矮壯素會(huì)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化成熟。

Runx2作為骨形成最早的標(biāo)志基因，是成骨細(xì)胞開(kāi)始分化的標(biāo)志，能夠激活骨鈣蛋白、骨橋素、骨涎蛋白和Col1等成骨功能蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，缺乏Runx2的參與，成骨細(xì)胞無(wú)法完成分化和成熟等生理過(guò)程；Runx2在協(xié)調(diào)涉及成骨細(xì)胞分化的多個(gè)信號(hào)中發(fā)揮中心作用[14]。研究結(jié)果顯示，矮壯素抑制了Runx2蛋白的表達(dá)。并且BMP2蛋白表達(dá)量也明顯減少。BMP2作為重要的骨形成蛋白，對(duì)成骨細(xì)胞的分化成熟有著重要作用[8]。BMP2表達(dá)量的減少說(shuō)明矮壯素抑制了MC3T3-E1向成熟成骨細(xì)胞的分化。

MAPK通路在骨骼發(fā)育過(guò)程中起著重要作用[15]。成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)[16]。己有研究顯示，MAPK通路中，ERK通路可轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動(dòng)成骨細(xì)胞分化所需的信號(hào)[17]，ERK通路可以在成骨細(xì)胞分化早期通過(guò)調(diào)節(jié)Runx2的磷酸化和活性，從而影響成骨細(xì)胞的分化[18]。本研究中發(fā)現(xiàn)矮壯素染毒后，MC3T3-E1細(xì)胞的分化可能與MAPK通路有關(guān)，推測(cè)可能與ERK通路和JNK通路相關(guān)。ERK蛋白的磷酸化水平被抑制，并且Runx2蛋白水平也減少。推測(cè)矮壯素有可能通過(guò)抑制ERK的磷酸化水平，進(jìn)而抑制Runx2蛋白的表達(dá)，抑制了MC3T3-E1向成熟成骨細(xì)胞的分化。對(duì)于JNK通路對(duì)成骨細(xì)胞分化的作用，目前還沒(méi)有定論[19]。有研究顯示，JNK磷酸化水平的升高或者降低都有可能會(huì)抑制成骨細(xì)胞的分化[20-21]。 本研究中觀察到，JNK磷酸化水平升高，可能在抑制MC3T3-E1成骨功能蛋白表達(dá)中發(fā)揮作用。

矮壯素作為常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。本實(shí)驗(yàn)使用小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1對(duì)矮壯素的骨骼發(fā)育毒性進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)矮壯素會(huì)影響該細(xì)胞骨骼發(fā)育相關(guān)蛋白的表達(dá)，且該作用可能與ERK和JNK信號(hào)通路有關(guān)，這為全面評(píng)價(jià)矮壯素的骨骼發(fā)育毒性提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。但骨骼發(fā)育受體內(nèi)激素分泌和細(xì)胞因子等多種因素共同調(diào)節(jié)，矮壯素對(duì)骨骼發(fā)育的作用機(jī)制還需從不同方面因素進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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