肥胖小鼠胰腺組織腫瘤相關(guān)基因突變頻率的分析

王萍，劉冰峰，楊云風(fēng)，蔡羽薇，譚娜，姚麗娟，羅燃燃，張果*

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系，湖北武漢430030）

在我國(guó)，隨著癌癥發(fā)病率和死亡率的逐年增加，癌癥所造成的疾病負(fù)擔(dān)正逐漸加重[1]。其中胰腺癌發(fā)病率也逐年升高。2015年我國(guó)胰腺癌發(fā)病率已經(jīng)躍居至癌癥發(fā)病率第9位，死亡率位列第6位[2]。同時(shí)，肥胖率在我國(guó)也呈增加的趨勢(shì)。至2014年，中國(guó)的肥胖人數(shù)已位居全球首位[3]。

流行病學(xué)研究表明，肥胖是胰腺癌發(fā)生的潛在危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)隨著腰圍和腰臀比的增加，胰腺癌的相對(duì)危險(xiǎn)度也增加[4]。與體質(zhì)量正常的對(duì)照組相比，超重和肥胖者胰腺癌的發(fā)病年齡均顯著提前，診斷胰腺癌后的生存期也顯著縮短[5]。對(duì)于肥胖在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，研究大多從肥胖導(dǎo)致的慢性炎癥、胰島素抵抗和高胰島素血癥等方面入手[6]，而目前在基因組穩(wěn)定性方面的研究尚少。在人類胰腺癌中經(jīng)?？捎^察到癌基因 K ras，抑癌基因 Tp53、Smad4 等基因的突變[7-8]。在小鼠中，Kras突變與 Trp53或Smad4的缺失表現(xiàn)出胰腺導(dǎo)管腺癌的加速發(fā)展[9]。本研究利用小鼠模型探討高脂食物誘導(dǎo)的肥胖與胰腺組織腫瘤相關(guān)基因突變之間的關(guān)系，從基因組穩(wěn)定性這一層面探索肥胖與胰腺癌之間的關(guān)系，從而為研究肥胖與胰腺癌之間的關(guān)系提供新的線索，并且為胰腺癌的預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料

C57BL/6雄鼠及普通飼料均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。高脂飼料購(gòu)自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司，宏量營(yíng)養(yǎng)素供能百分比為：碳水化合物20%，蛋白質(zhì)20%，脂肪60%。脂肪的來(lái)源為90.7%豬油和9.3%大豆油。能量密度為5.24kcal/g。普通飼料宏量營(yíng)養(yǎng)素供能百分比為：碳水化合物75.9%，蛋白質(zhì)14.7%，脂肪9.4%。能量密度為3.85kcal/g。

1.2 主要儀器和試劑

體成分分析儀購(gòu)自德國(guó)Bruker公司；甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司；高保真DNA聚合酶購(gòu)自美國(guó)MCLab公司；兔抗Ki67購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Trizol、 SYBR Green I試 劑 購(gòu) 自 美 國(guó) Thermo Fisher公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自美國(guó)Progema公司；DNA測(cè)序由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司完成。

1.3 肥胖模型的建立和組織的收集

8周齡小鼠分為普通食物組50只和高脂食物組50只，分別用普通飼料和高脂飼料飼養(yǎng)，每組隨機(jī)選取8只 ， 每天稱量進(jìn)食量，最后計(jì)算每只小鼠24周的總進(jìn)食量。飼養(yǎng)24周后利用體成分分析儀測(cè)量活體小鼠的脂肪和瘦組織質(zhì)量，然后收集組織，稱量肝臟和附睪脂肪的質(zhì)量。組織保存于-80℃冰箱備用。

1.4 血漿甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定

小鼠禁食12h后，用抗凝毛細(xì)管在尾尖采血，500 g離心30min，取上層血漿，按照試劑盒說(shuō)明書步驟在96孔板中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品各2μL，均設(shè)置2個(gè)重復(fù)。每孔加入工作液200μL，37℃反應(yīng)10min。經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)得各樣品在波長(zhǎng)505 nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣品的甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的濃度。

1.5 胰腺組織基因組DNA的提取

取25mg左右胰腺組織置于1.5mL離心管中。將組織剪碎后加入300μL裂解液[配方：6.7mmol/L Tris、1.66mmol/L (NH4)2SO4、0.67mmol/LMgCl2、0.5%Triton X-100、1%β-巰基乙醇]，在95℃反應(yīng)10min。冷卻后加入30μmol/L的蛋白酶K(10mg/mL)于55℃反應(yīng)3h，然后95℃溫浴10min滅活蛋白酶K。冷卻后，1200g離心10min取上清。

1.6 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

用Primer5軟件針對(duì)小鼠 K ras基因第2外顯子，Trp53基因第8外顯子， S mad4第9外顯子設(shè)計(jì)引物，用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增出高脂食物組小鼠胰腺的上述基因片段。擴(kuò)增片段經(jīng)切膠回收后由公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Vector NTI軟件將測(cè)序得到的序列與NCBI中標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。為了避免序列兩端測(cè)序的不穩(wěn)定性，引物所擴(kuò)增出來(lái)的片段都長(zhǎng)于上述外顯子片段，且對(duì)所有樣本測(cè)序兩次。同時(shí)，比對(duì)測(cè)序結(jié)果時(shí)，用Chromas軟件檢查測(cè)序峰圖是否存在干擾峰。

1.7 免疫組化

Ki67是一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物，通過(guò)Ki67免疫組化檢測(cè)胰腺細(xì)胞增殖活性。取小鼠胰腺組織，經(jīng)Bouin’s固定液固定24h，然后用石蠟包埋并切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，100%、95%、75%酒精梯度復(fù)水，1×PBS洗滌后，在檸檬酸鈉緩沖液中煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)。然后進(jìn)行Ki67免疫組化：①1×PBS洗滌3次，每次5 min，滴加5%羊血清/0.3%Triton X-100室溫封閉30 min。②去掉封閉液，滴加1∶100稀釋的兔抗Ki67，4℃孵育過(guò)夜。③1×PBS洗滌3次，每次5min，然后滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育1h。④1×PBS洗滌3次，每次5min。滴加DAB顯色液，室溫反應(yīng)5 min后蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，最后用蘇木素染色液復(fù)染細(xì)胞核。⑤將玻片依次置于75%、95%、100%的酒精和二甲苯中各5min進(jìn)行梯度脫水和透明。⑥中性樹膠封片后用顯微鏡采集圖像。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取25mg左右胰腺組織置于1.5mL離心管，加入1 mL的Trizol提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用SYBR Green I試劑盒對(duì)胰腺組織Ki67的mRNA水平進(jìn)行相對(duì)定量，用 G APDH作內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果用-x±s表示。普通食物組和高脂食物組間體質(zhì)量、體成分、血脂水平和胰腺組織Ki67mRNA水平的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以 α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 高脂食物飼養(yǎng)引起小鼠肥胖和血脂異常

體質(zhì)量、體成分和血脂水平的結(jié)果見圖1。經(jīng)24周高脂食物飼養(yǎng)的小鼠，其平均體質(zhì)量顯著高于普通食物組，且高脂食物組小鼠攝入單位質(zhì)量飼料所增加的體質(zhì)量遠(yuǎn)高于普通食物組(P<0.05)，說(shuō)明高脂飼料能顯著誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生肥胖。體成分分析儀可根據(jù)氫原子的核磁共振信號(hào)強(qiáng)度和弛豫時(shí)間的差異，測(cè)量活體小鼠的脂肪和瘦組織質(zhì)量。瘦組織主要包括肌肉和水分。結(jié)果顯示，高脂食物組體脂質(zhì)量、肝體比、附睪脂肪脂體比遠(yuǎn)大于普通食物組(P<0.05)。瘦組織質(zhì)量在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明肥胖主要是由于體內(nèi)脂肪的增加引起。此外，高脂食物組小鼠血漿甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的水平均顯著高于普通食物組(P均<0.05)。

圖1 普通食物組和高脂食物組小鼠的體質(zhì)量、體成分和血脂水平

2.2 Kras基因在肥胖小鼠胰腺中存在突變

人和小鼠 K ras、 Trp53和Smad4的基因結(jié)構(gòu)見圖2A，本研究中擴(kuò)增的小鼠胰腺 K ras、Tr p53 和 Smad4這3個(gè)基因序列所編碼的多肽序列與人類該序列編碼的多肽序列高度同源，氨基酸序列同源性分別達(dá)到100%、82%和98%。COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)顯示[10]，人類這3個(gè)基因中， K ras基因第2外顯子、 Tp53基因第8外顯子和 S mad4基因第9外顯子存在多個(gè)突變頻率高的位點(diǎn)，因此本研究也選擇性擴(kuò)增相應(yīng)序列。3個(gè)基因片段PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2B，Kras、Trp53 和 Smad4基因的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為537、543和526bp。兩次測(cè)序結(jié)果均顯示，高脂食物組50個(gè)胰腺擴(kuò)增樣本中， K ras基因均有1個(gè)樣本存在突變。突變位置為 K ras基因CDS序列的第96位堿基，由T突變?yōu)镃(c.96T>C)，為第32位密碼子的同義突變(p.Tyr32Tyr)，結(jié)果見表2。DNA測(cè)序峰圖見圖3，未檢測(cè)到突變的樣本，測(cè)序峰為單峰，檢測(cè)到點(diǎn)突變的峰圖由T峰和C峰共同構(gòu)成，說(shuō)明此DNA樣本中存在以C為模板的序列。經(jīng)小鼠基因組多態(tài)性檢查，該位點(diǎn)不存在單核苷酸多態(tài)性。我們同時(shí)對(duì)50個(gè)普通食物組胰腺Kras樣本進(jìn)行了測(cè)序，但未發(fā)現(xiàn)任何突變。另外，高脂食物組胰腺中未檢測(cè)出 Trp53和Smad4基因的突變。

2.3 高脂食物組小鼠胰腺細(xì)胞增殖活性升高

胰腺癌的主要病理類型為胰腺導(dǎo)管腺癌，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其起源是胰腺內(nèi)的導(dǎo)管細(xì)胞。細(xì)胞增殖標(biāo)志基因 K i67免疫組化結(jié)果見圖4A和4B，高脂食物組小鼠胰腺導(dǎo)管內(nèi)可見多個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞(圖4B，棕色，紅色箭頭示)，遠(yuǎn)多于普通食物組。說(shuō)明高脂食物組小鼠胰腺導(dǎo)管細(xì)胞增殖活性升高。為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，利用qPCR對(duì)Ki67mRNA進(jìn)行分析。結(jié)果見圖4C，高脂食物組小鼠胰腺細(xì)胞Ki67mRNA表達(dá)水平較普通食物組明顯升高(P<0.05)。

圖3 小鼠 K ras基因測(cè)序峰圖

圖4 胰腺細(xì)胞增殖活性比較

3 討論

胰腺癌惡性程度高，早期起病隱匿，缺乏有效的診斷依據(jù)。疾病進(jìn)展快，許多患者就診時(shí)已到晚期，預(yù)后極差。因此闡明胰腺癌的病因，對(duì)胰腺癌進(jìn)行早期預(yù)防具有重要意義。

流行病學(xué)證據(jù)和實(shí)驗(yàn)性研究均提示肥胖可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4-5，11-14]，但其具體機(jī)制還未完全闡明。目前關(guān)于肥胖和胰腺癌的機(jī)制研究大部分側(cè)重于代謝和激素方面。肥胖者體內(nèi)常伴隨多種激素和細(xì)胞因子的紊亂，可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。比如，肥胖者體內(nèi)的高胰島素可使胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF-1R)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)過(guò)度激活，進(jìn)而激活其下游的磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)和有絲分裂原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)通路(Ras-Raf-MAPK)從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[15-18]。此外，肥胖人群體內(nèi)的慢性炎癥[6]、高瘦素[19]、高血糖[20]、低脂聯(lián)素[21-22]和過(guò)氧化物酶體激活物受體增加[23]也可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

肥胖促進(jìn)胰腺癌的可能機(jī)制除了代謝和激素因素外，對(duì)基因組穩(wěn)定性的影響也值得關(guān)注。有證據(jù)表明，肥胖者的基因組損傷增加并且其增加幅度與體質(zhì)量指數(shù)成正相關(guān)[24]。肥胖導(dǎo)致的DNA損傷很可能與氧自由基相關(guān)。活性氧(reactive oxygen species，ROS)在各種疾病中的作用研究較多。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是多種非傳染性疾病如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等的誘發(fā)因素。肥胖者慢性、低水平炎癥和ROS產(chǎn)生之間存在一定的關(guān)系，導(dǎo)致ROS相關(guān)的病理改變[25]。ROS可對(duì)核酸產(chǎn)生破壞作用。研究表明，熱量限制減少細(xì)胞內(nèi)ROS的形成[26]。長(zhǎng)期的熱量限制可降低癌癥的發(fā)病率，延長(zhǎng)不同動(dòng)物模型的壽命[27]?？傊逝终吆芸赡苡捎隗w內(nèi)ROS的增加，而對(duì)其基因組穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

本研究采用24周高脂食物飼養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肥胖，較長(zhǎng)時(shí)間高脂飼養(yǎng)使小鼠體成分以及血脂都發(fā)生了顯著的改變，符合肥胖者的生理狀態(tài)。Ki67是一種與細(xì)胞有絲分裂相關(guān)的核抗原，只存在于分裂期細(xì)胞中。本研究中，高脂食物組小鼠Ki67mRNA水平明顯高于普通食物組，說(shuō)明其胰腺細(xì)胞增殖活性增加，而細(xì)胞的增殖失控正是癌細(xì)胞的基本特征之一。此外，Ki67免疫組化的結(jié)果顯示，高脂食物組小鼠胰腺導(dǎo)管內(nèi)可見多個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞，而目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為胰腺導(dǎo)管細(xì)胞是胰腺導(dǎo)管腺癌的起源。

堿基突變是基因組損傷的一種常見形式。Kras，Tp53 與 Smad4是人胰腺癌中突變率最高的3個(gè)基因[10]。本研究中 K ras基因檢測(cè)的序列是第2外顯子，而該基因第12和13位密碼子正是位于該檢測(cè)序列中。大量研究顯示胰腺癌中存在第12或13位密碼子的突變[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠胰腺未見第12和13位密碼子突變，而第32位密碼子由TAT突變?yōu)門AC，突變頻率為2%，其編碼的氨基酸雖仍為酪氨酸，但提示肥胖可能對(duì)小鼠 K ras基因的穩(wěn)定性產(chǎn)生了一定影響。COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)顯示[10]， Tp53 和 Smad4這兩個(gè)基因分別在第8和第9外顯子有較高的突變頻率，因此本研究中分別擴(kuò)增了高脂食物組小鼠胰腺 Trp53 和 Smad4的第8和第9外顯子，測(cè)序結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)有突變位點(diǎn)。近期有研究顯示在分離的胰腺上皮內(nèi)瘤變樣本中，僅僅檢測(cè)到很少的Tp53 和 Smad4基因的改變，提示 Trp53 和 Smad4的失活可能是晚期遺傳改變[31]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)時(shí)間高脂飼養(yǎng)使小鼠出現(xiàn)肥胖，其胰腺細(xì)胞增殖活性增加。肥胖小鼠胰腺組織存在 K ras的點(diǎn)突變，突變頻率為2%。肥胖可能會(huì)增加胰腺組織中 K ras基因的不穩(wěn)定性，從而起到促進(jìn)胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用。

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