CD11c+細(xì)胞特異性敲除TAK1對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷的影響

周文娟，雷志明，魏雪濤，郝衛(wèi)東*

（北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系/食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191）

刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)可以通過(guò)尾靜脈注射，特異性作用于小鼠肝臟，造成肝臟損傷[1]。關(guān)于該損傷機(jī)制的研究顯示，Con A并不直接作用于小鼠肝細(xì)胞[2]，但可以引起肝臟內(nèi)免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子的聚集，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)的肝臟損傷[3]。Con A誘導(dǎo)的肝損傷常被用于模擬自身免疫性肝炎和乙型病毒性肝炎等，具有時(shí)間短和損傷具有劑量反應(yīng)關(guān)系等特點(diǎn)[1，4-6]。

研究表明，枯否細(xì)胞(Kupffer cell，KC)是Con A誘導(dǎo)免疫性肝損傷中的關(guān)鍵性非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)也在該損傷中起到一定的作用。CD11c是KCs和DCs的表面分子[7]，與KCs和DCs有關(guān)且參與Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷的細(xì)胞因子有腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、 γ 干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL-4/5/6 /12)等。這些因子中最關(guān)鍵的為TNF-α和IFN-γ。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β激活激酶1(TGFβ-activated kinase 1，TAK1)，是一種體內(nèi)常見(jiàn)的蛋白激酶，參與細(xì)胞的增殖與分化，在炎癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[8-9]。目前已有部分研究探討了TAK1與肝損傷之間的關(guān)系[10-11]。Song等[12]研究表明肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞敲除TAK1可以誘導(dǎo)自發(fā)性肝炎、肝纖維化和肝癌。然而僅有少量研究探討了肝中非實(shí)質(zhì)細(xì)胞TAK1在該損傷中的作用，尚未見(jiàn)有關(guān)CD11c+細(xì)胞中TAK1敲除對(duì)于該損傷的研究。因此，本文利用在CD11c+細(xì)胞中特異性敲除TAK1基因的動(dòng)物模型，研究免疫細(xì)胞中TAK1在Con A誘導(dǎo)的早期免疫性肝損傷中所起的作用，旨為臨床肝炎治療新靶點(diǎn)的探索提供理論線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

FloxedMap3k7(Map3k7fl/fl) 和CD11c-Cre小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，該小鼠為C57BL/6背景。將Map3k7fl/fl和CD11c-Cre小鼠進(jìn)行交配，產(chǎn)生Map3k7fl/flCD11c-Cre小鼠，該小鼠體內(nèi)CD11c+細(xì)胞中特異性缺失Map3k7(TA K1)基因。對(duì)照C57BL/6小鼠為帶有CD11c-Cre的小鼠，以排除Cre的影響[13]。

所有小鼠均選取雌性，8~12周齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量18~22g，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，溫度20~25℃，相對(duì)濕度40%~70%，12h/12h明暗交替循環(huán)，飼料為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)菌飼料，飲用水經(jīng)過(guò)濾除菌處理。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合北京大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

將CD11c+細(xì)胞特異性敲除TAK1的C57BL/6小鼠，經(jīng)鼠尾靜脈注射Con A(12mg/kg)或生理鹽水，分別作為Con A敲除組和生理鹽水敲除組。另選C57BL/6小鼠，鼠尾靜脈注射Con A(12mg/kg)或生理鹽水，作為Con A對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組，共4組，每組7只。注射6h之后取血，斷髓處死動(dòng)物，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2 試劑與儀器

Ⅳ型刀豆蛋白A(Con A)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alamine aminoteansferase，ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)以及乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自四川麥克生物科技股份有限公司；小鼠TNF-α、小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 試劑盒和多因子小鼠Th1/Th2檢測(cè)試劑盒(6因子)購(gòu)自eBioscience公司。

HITACHI-7170A全自動(dòng)生化分析儀為日本日立公司產(chǎn)品；ThermoMK3型酶標(biāo)儀為中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；正置熒光顯微鏡(Nikon E400)，realtime PCR擴(kuò)增儀為Bio-Rad產(chǎn)品。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 小鼠血清ALT、AST、LDH測(cè)定小鼠眼部取血，4℃靜置1h后，2500r/min離心10min，取上清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST和LDH活性。

1.3.2 小鼠臟器系數(shù)計(jì)算動(dòng)物麻醉后處死，摘取肝、脾、肺、腎和胸腺，稱取質(zhì)量并計(jì)算臟器系數(shù)。

1.3.3 小鼠肝臟病理學(xué)觀察及評(píng)分制備肝臟病理切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察，定性描述相關(guān)的病理學(xué)特征。根據(jù)肝臟病變程度按照如下標(biāo)準(zhǔn)分為4級(jí)：0級(jí)，正常肝組織，記0分；1級(jí)，輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，偶伴有單個(gè)肝細(xì)胞壞死，記1分；2級(jí)，中度肝細(xì)胞損害伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和局灶性肝細(xì)胞壞死，記2分；3級(jí)，匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴廣泛的肝細(xì)胞壞死[14]。

1.3.4 小鼠血清中白細(xì)胞介素、TNF-α和IFN-γ表達(dá)測(cè)定收集小鼠血清，酶標(biāo)儀測(cè)定450和570nm處白細(xì)胞介素IL-4/5/6/12、TNF-α和IFN-γ的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞因子含量。

1.3.5 小鼠肝中TNF-α和IFN-γ表達(dá)測(cè)定取少量肝組織進(jìn)行勻漿，12000r/min離心20min，取上清，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm和570nm處TNF-α和IFN-γ的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞因子含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，兩組均數(shù)之間比較采用t檢 驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用t檢驗(yàn)； α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。在對(duì)免疫相關(guān)細(xì)胞因子分析時(shí)，剔除數(shù)值超過(guò)兩倍標(biāo)準(zhǔn)差的異常數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 CD11c+細(xì)胞中特異性敲除TAK1對(duì)血清生化指標(biāo)的影響

與生理鹽水對(duì)照組相比，生理鹽水敲除組小鼠血清中ALT、AST和LDH水平無(wú)顯著改變，Con A對(duì)照組中血清ALT和LDH水平顯著升高(P均<0.05)。與Con A對(duì)照組相比，Con A敲除組小鼠血清ALT、AST和LDH水平均顯著升高(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CD11c+細(xì)胞中特異性敲除TAK1對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響(-x±s，n=7)

2.2 CD11c+細(xì)胞中特異性敲除TAK1對(duì)臟器系數(shù)的影響

與生理鹽水對(duì)照組相比，生理鹽水敲除組小鼠僅肝臟系數(shù)顯著升高(P<0.05)，Con A對(duì)照組肝臟和脾臟臟器系數(shù)顯著升高(P均<0.05)。與Con A對(duì)照組相比，Con A 敲除組 小 鼠的肝臟、肺臟和腎臟臟器系數(shù)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，脾臟和胸腺臟器系數(shù)無(wú)明顯改變。見(jiàn)表2。

表2 CD11c+細(xì)胞特異性敲除 TAK1對(duì)臟器系數(shù)的影響(-x±s，n=7)

2.3 CD11c+細(xì)胞中TAK1特異性敲除對(duì)Con A引起的肝組織病理?yè)p傷的影響

與生理鹽水對(duì)照組(0分)相比，生理鹽水敲除組小鼠肝臟病理評(píng)分(0.43±0.53)無(wú)明顯改變，Con A對(duì)照組病理評(píng)分(2.14±0.69)則顯著升高(P<0.05)。與Con A對(duì)照組相比，Con A敲除組病理評(píng)分(2.86±0.38)顯著升高(P<0.05)。Con A對(duì)照組損傷主要表現(xiàn)為點(diǎn)灶狀壞死或匯管區(qū)炎癥，其中前者表現(xiàn)更為顯著而普遍，匯管區(qū)周圍存在輕度壞死，肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞的壞死以點(diǎn)灶狀為主，無(wú)明顯的片狀或橋接壞死；Con A敲除組損傷類型由早期壞死轉(zhuǎn)變?yōu)槊黠@的灶狀壞死或匯管區(qū)炎癥，有明顯的片狀壞死和橋接壞死，同時(shí)存在多個(gè)出血壞死灶。所有肝臟均未見(jiàn)明顯纖維化表現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

2.4 CD11c+細(xì)胞中TAK1特異性敲除對(duì)Con A誘導(dǎo)的血清免疫因子表達(dá)的影響

與生理鹽水對(duì)照組相比，生理鹽水敲除組 小 鼠血清各細(xì)胞因子水平均未見(jiàn)明顯改變，Con A對(duì)照組血清TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-6水平均顯著升高(P均<0.05)，血清IL-12水平無(wú)明顯改變。與Con A對(duì)照組相比，Con A敲除組血清TNF-α、IL-4和IL-6水平均顯著升高(P均<0.05)，而血清IFN-γ、IL-5和IL-12水平無(wú)明顯改變。見(jiàn)圖2。

2.5 CD11c+細(xì)胞中TAK1特異性敲除對(duì)Con A誘導(dǎo)的肝組織中TNF-α和IFN-γ表達(dá)的影響

見(jiàn)圖 3。與生理鹽水對(duì)照組比較，生理鹽水敲除組 小 鼠肝組織中TNF-α的含量明顯下降(P<0.05)，IFN-γ水平無(wú)明顯改變；Con A對(duì)照組肝組織中兩因子均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與Con A對(duì)照組相比，Con A敲除組小鼠肝組織中IFN-γ水平顯著升高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TNF-α水平無(wú)明顯改變。

圖1 CD11c+ 細(xì) 胞特異性敲除TAK1 對(duì)C on A 引 起的肝臟病理組織學(xué)的影響(H E， ×200)

圖2 CD11c+ 細(xì) 胞中TAK1 特 異性敲除對(duì) C on A 誘 導(dǎo)的血清細(xì)胞免疫因子表達(dá)的影響(n=5)

圖3 CD11c+ 細(xì) 胞中TAK1 特 異性敲除對(duì)C on A 誘 導(dǎo)的肝細(xì)胞因子的影響(n=5)

3 討論

Con A是一種從刀豆中提取出來(lái)的蛋白。1992年Tiegs等[4]首次發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射Con A可以特異性引起小鼠的免疫性肝損傷。Con A入血之后主要聚集在肝中，并作用于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，使細(xì)胞破損。之后該蛋白會(huì)穿過(guò)肝竇內(nèi)皮與Kupffer細(xì)胞結(jié)合，激活肝中的免疫反應(yīng)，聚集的免疫細(xì)胞和因子會(huì)進(jìn)一步作用于肝細(xì)胞，造成肝細(xì)胞的變性和壞死[3]。Con A誘導(dǎo)免疫性肝損傷主要表現(xiàn)為血生化指標(biāo)升高和肝臟病理?yè)p傷加重[15]。本課題組前期研究顯示，當(dāng)Con A鼠尾靜脈注射劑量為12mg/kg時(shí)，實(shí)驗(yàn)小鼠的肝臟存在輕度損傷，肝和血清中TNF-α和IFN-γ的水平均升高。故本實(shí)驗(yàn)Con A注射劑量均為12mg/kg，以便于探索CD11c+細(xì)胞中TAK1蛋白對(duì)于Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷的作用。

本研究結(jié)果顯示，與生理鹽水對(duì)照組相比，Con A敲除組和Con A對(duì)照組反映肝損傷嚴(yán)重程度的血生化指標(biāo)顯著升高(P均<0.05)，而生理鹽水敲除組的血生化無(wú)明顯改變。Con A敲除組的血生化指標(biāo)明顯高于Con A對(duì)照組(P均<0.05)。肝臟病理及病理評(píng)分變化與血生化一致。提示單獨(dú)敲除CD11c+細(xì)胞中的TAK1并不會(huì)引起肝細(xì)胞明顯的損傷和死亡，造成肝臟的明顯損傷。這也說(shuō)明CD11c+細(xì)胞中的TAK1蛋白可能并不直接參與維持肝細(xì)胞的存活。但是CD11c+細(xì)胞中TAK1 的敲除對(duì)于Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷起協(xié)同作用，TAK1敲除可使肝臟對(duì)于外來(lái)刺激更加敏感。CD11c+細(xì)胞中的TAK1蛋白參與了Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷。Wang等[16]曾證明在CD11c+細(xì)胞特異性敲除TAK1的小鼠中TAK1缺失導(dǎo)致CD11c+細(xì)胞凋亡顯著上升，從而致淋巴和非淋巴組織中的DCs群體枯竭。DCs 的缺失可以進(jìn)一步導(dǎo)致肝中免疫穩(wěn)態(tài)失衡。Tomiyama 等[17]發(fā)現(xiàn)Con A給藥小鼠的肝樹(shù)突狀細(xì)胞過(guò)繼性轉(zhuǎn)移有抑制Con A誘導(dǎo)肝損傷的作用。提示CD11c+細(xì)胞中特異性敲除TAK1很有可能是通過(guò)DCs凋亡，造成肝中免疫穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而加重Con A誘導(dǎo)的肝損傷。然而近期也有報(bào)道稱CD11c-白喉毒素受體轉(zhuǎn)基因小鼠或用抗CD11c抗體導(dǎo)致小鼠CD11c+D C枯竭，可減輕Con A誘發(fā)的肝損傷[18]。該結(jié)果與本研究結(jié)果不一致，其可能原因?yàn)槲墨I(xiàn)中起關(guān)鍵作用的DCs為常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞(cDC)，而小鼠肝中的DC為漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(pDC)[19]，雖然均為樹(shù)突狀細(xì)胞，兩者在免疫反應(yīng)中所起作用不同。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞參與維持免疫耐受[20]。

KCs和DCs可以通過(guò)分泌一系列細(xì)胞因子，進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與生理鹽水對(duì)照組相比，生理鹽水敲除組的肝TNF-α水平降低(P<0.05)，而其他細(xì)胞因子均無(wú)明顯改變。Con A對(duì)照組中血清和肝勻漿中細(xì)胞因子除IL-12外水平均升高(P均<0.05)。與Con A對(duì)照組相比，Con A敲除組的肝IFN-γ，血清TNF-α、IL-4和IL-6水平均顯著升高(P均<0.05)，肝TNF-α和血清IFN-γ、IL-5和IL-12水平未見(jiàn)明顯改變。表明CD11c+細(xì)胞的TAK1蛋白與免疫性肝損傷有關(guān)，該細(xì)胞中TAK1敲除可影響Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷中細(xì)胞因子的分泌，加重肝臟炎癥。但CD11c+細(xì)胞中TAK1的敲除不會(huì)影響血清IL-5 和IL-12的分泌。

TNF-α和IFN-γ是Con A誘導(dǎo)免疫性肝損傷中的關(guān)鍵因子，而肝組織中IFN-γ主要由聚集到肝內(nèi)的T細(xì)胞分泌，TNF-α則主要由KCs分泌。肝外這兩個(gè)因子則主要由T細(xì)胞分泌。本研究結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，Con A對(duì)照組血清和肝 組 織TNF-α和IFN-γ水平均顯著升高(P均<0.05)，生理鹽水對(duì)照組血清和肝組織中IFN-γ，血清TNF-α水平均未見(jiàn)明顯改變，肝組織TNF-α水平顯著下降(P<0.05)。與Con A對(duì)照組相比，Con A敲除組肝 組 織中IFN-γ和血清中TNF-α均顯著升高(P均<0.05)，而肝 組 織TNF-α和血清IFN-γ水平無(wú)明顯改變，提示CD11c+細(xì)胞中TAK1的敲除影響了這兩種因子的分泌。肝 組 織中IFN-γ表達(dá)增加，血清中則無(wú)明顯改變，說(shuō)明TAK1的敲除可促進(jìn)已經(jīng)聚集在肝中的T細(xì)胞分泌IFN-γ，而對(duì)肝外的T細(xì)胞分泌IFN-γ則無(wú)直接影響。和Con A對(duì)照組相比，Con A敲除組中TNF-α在血清中顯著升高，但在肝勻漿中卻無(wú)明顯改變，而與生理鹽水對(duì)照組相比，肝中TNF-α分泌明顯降低，提示CD11c+細(xì)胞中TAK1的敲除可能抑制了肝中KCs分泌TNF-α。這些均提示CD11+細(xì)胞中的TAK1敲除可以抑制KCs分泌TNF-α，促進(jìn)肝中聚集的T細(xì)胞分泌IFN-γ，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。

Th1型細(xì)胞主要分泌TNF-α、IFN-γ和IL-2等細(xì)胞因子，Th2型細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子。IL-4主要由T細(xì)胞分泌，可以刺激單核、肥大細(xì)胞等增殖，增強(qiáng)抗原呈遞功能，刺激NK細(xì)胞等分泌IFN-γ。本研究中，和Con A對(duì)照組相比，Con A敲除組血清中該因子表達(dá)顯著升高，說(shuō)明TAK1的敲除可以刺激T細(xì)胞分泌IL-4，加重炎癥反應(yīng)。IL-6是一種主要由Th2型細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子，具有抗感染，促進(jìn)B細(xì)胞分泌抗體等多種生物活性作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CD11c+細(xì)胞TAK1的敲除可以明顯促使血清中IL-6分泌增加。IL-5也在急性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，有研究表明，IL-5的敲除可以明顯加重血液、脾和骨髓中嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，延長(zhǎng)該細(xì)胞的壽命[21]。而本研究中可以看到鼠尾靜脈注射Con A的小鼠其IL-5分泌明顯增加，但Con A敲除組和Con A對(duì)照組間無(wú)明顯差異，說(shuō)明Con A可以促進(jìn)肝中嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，但CD11c+細(xì)胞中TAK1的敲除不會(huì)影響IL-5的分泌，即不會(huì)影響機(jī)體嗜酸性粒細(xì)胞的增殖和分化。

IL-12主要由單核巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞以及B細(xì)胞分泌。中性粒細(xì)胞和Th細(xì)胞也可分泌該因子。而該因子可以有效刺激NKT細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，促進(jìn)Th1細(xì)胞的發(fā)育，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而加重炎癥[22]。而本研究結(jié)果顯示，經(jīng)鼠尾靜脈注射Con A之后，Con A對(duì)照組和Con A敲除組之間無(wú)明顯差異，說(shuō)明CD11c+細(xì)胞TAK1的敲除不會(huì)影響IL-12分泌。而其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

綜上所述，CD11c+細(xì)胞中TAK1的敲除可以促進(jìn)Con A誘導(dǎo)的肝損傷中肝細(xì)胞的壞死，加重肝組織損傷，抑制KCs中TNF-α的分泌，但不影響DCs等細(xì)胞分泌的IL-12，不影響嗜酸性粒細(xì)胞的增殖和分化。同時(shí)CD11c+細(xì)胞中TAK1的敲除可以促進(jìn)該損傷中部分Th1和Th2型細(xì)胞因子的分泌，提示CD11c+細(xì)胞中TAK1的功能可能為維持肝中的免疫穩(wěn)態(tài)。當(dāng)CD11c+細(xì)胞中TAK1被敲除時(shí)，可加重Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷。

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