遷徙生長現(xiàn)象在變形桿菌檢測中的應(yīng)用

陳冠武 蔡 穎* 王鳳軍 周廣彪 許如蘇 蘇建暉 張崢嶸 陳冬娥

（1.汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東汕頭 515000；2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院）

1 前言

變形桿菌屬（Proteus）細(xì)菌包括5個(gè)種：普通變形桿菌（P．vulgaris）、奇異變形菌（P．mirabilis）、潘氏變形桿菌（P．pennea）、產(chǎn)粘液變形桿菌（P．myxofaciens）和 P．hauseri[1]。 美國藥典（USP<1111>）、歐洲藥典（EP 5.1.4）對變形桿菌屬有明確的檢測要求，我國CHINET監(jiān)測（中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測）也將變形桿菌屬列為監(jiān)測菌類之一。變形桿菌還是引起食源性疾病的重要病原之一[2]?！斑w徙生長現(xiàn)象”是變形桿菌在合適條件下固有的生長特性，無論在國內(nèi)外微生物學(xué)經(jīng)典論著[1，3-4]，還是在文獻(xiàn)上[5-8]都有明確的描述，而該屬細(xì)菌也因此而命名。但經(jīng)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)將“遷徙生長現(xiàn)象”應(yīng)用于變形桿菌屬檢測鑒定的文獻(xiàn)和技術(shù)規(guī)范，可能的原因是在通常的培養(yǎng)條件下，這種特性并非能夠一直表現(xiàn)得那么穩(wěn)定和典型。筆者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)積累，并通過摸索，創(chuàng)新性地開發(fā)了 “克氏雙糖鐵長斜面遷徙生長試驗(yàn)”，能使變形桿菌的“遷徙生長現(xiàn)象”特性穩(wěn)定、典型表現(xiàn)，而且易于判斷。筆者采用多種細(xì)菌菌株、人工染菌模擬樣品等，驗(yàn)證了該方法能夠有效地應(yīng)用于變形桿菌的初篩檢驗(yàn)。

2 材料與方案

2.1 試驗(yàn)材料

本研究共選用了96株實(shí)驗(yàn)用菌，包括60株變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株和36株非變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株，其中，有購自ATCC（美國菌種保藏中心）、CMCC（中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心）、CICC（工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）、AS（中國普通微生物菌種保藏中心）菌種保藏中心的標(biāo)準(zhǔn)菌株，有汕頭檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室日常檢驗(yàn)分離鑒定的參考菌株和其他實(shí)驗(yàn)室提供（經(jīng)鑒定）的參考菌株。變形桿菌屬實(shí)驗(yàn)用菌編號在文中以“P+數(shù)字”表示代號，具體見表1；非變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株主要選擇生化上與變形桿菌屬較為“近親”、或環(huán)境中常見菌種，以“N+數(shù)字”表示代號，具體見表2。

表2 36株非變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株清單

2.2 主要設(shè)備與儀器、試劑

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 （上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），CLASSⅡA/B3型生物安全柜（美國FORMA公司），HV-85型自動(dòng)高壓滅菌器 （日本HIRAYAMA公司），細(xì)菌菌濁儀和VITEK 2 Compact微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司）等。

克氏雙糖鐵干粉培養(yǎng)基（同時(shí)選用了3個(gè)廠家：北京陸橋技術(shù)有限公司、廣東環(huán)凱科技有限公司、青島日水生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品；制成克氏雙糖鐵長斜面，在下文簡稱北克、廣克、青克）、腦心浸液干粉培養(yǎng)基（BAI）、麥康凱培養(yǎng)基（MAC）、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基（下文簡稱桿顯）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、血平板等均購自廣東環(huán)凱科技有限公司，API 20E生化試劑盒、氧化酶試劑、革蘭氏染色液均購自法國生物梅里埃公司，無抑菌劑、無表面活性劑化妝品基礎(chǔ)膏（下文簡稱基質(zhì)）購自廣東金奇日化有限公司。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)菌株的遷徙生長試驗(yàn)

（1）按標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.28的要求配制克氏雙糖鐵長斜面培養(yǎng)基（底層高度約2cm、斜面長度約6cm），在2周時(shí)間內(nèi)使用。3個(gè)廠家的干粉培養(yǎng)基按配制比例制成的斜面（北克、廣克、青克）后，在斜面的底部與試管壁之間都有約100 μL冷凝液，通常放置4℃冰箱4周內(nèi)不會(huì)完全變干。

（2）所有實(shí)驗(yàn)菌株均從磁珠凍存管各取1顆放入10 mL BAI中、置于 36±1℃復(fù)蘇增菌約 18 h，肉湯濁度均達(dá)2。

（3）用移液槍分別吸各菌種500 μL菌液，小心地將吸管伸入到斜面底部冷凝液中輕輕接入菌液，操作時(shí)移液槍吸頭不能碰到培養(yǎng)基，3個(gè)廠家的克氏雙糖鐵長斜面同時(shí)接種操作。置于36±1℃、培養(yǎng)24 h和 48 h。

（4）斜面菌苔的驗(yàn)證：分別用接種環(huán)在所有實(shí)驗(yàn)菌株的克氏雙糖鐵斜面頂往下≤1 cm位置斜面的表面做向上刮取動(dòng)作2次，分別劃線接種于血平板，置于36±1℃培養(yǎng)24 h和48 h。

3.2 遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)

選擇 P1、P3、P5、P7 4 株普通變形桿菌；P8、P9 2 株潘氏變形桿菌；P10、P21、P27、P28、P29、P31 6株奇異變形桿菌共12株作為代表菌株，做遷徙生長鑒定法的靈敏度試驗(yàn)。

分別挑取上述12株代表菌的菌苔，各制出1.0麥?zhǔn)隙鹊木鷿嵋?，然后?0倍數(shù)稀釋，分別取10-6、10-7、10-8、10-9稀釋液進(jìn)行檢測。按2.1的方法操作，置于36±1℃培養(yǎng)24 h。上述操作的同時(shí)，各菌株稀釋液按吸取量500 μL菌液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

3.3 人工染菌模擬化妝品樣品試驗(yàn)

3.3.1 檢測樣制作

選部分代表性實(shí)驗(yàn)菌菌苔調(diào)制成1.0麥?zhǔn)隙染?，參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[9]的增菌方法，以“無表面活性劑化妝品基礎(chǔ)膏（基質(zhì)液）0.5 g+干擾菌N 各 50 μL+變形桿菌 P 50 μL+SCDLP 4.5 mL”混合均勻，制出若干檢測模擬化妝品樣品增菌液（詳見表3），按2.1在3種培養(yǎng)基（北克、廣克、青克）上進(jìn)行遷徙生長試驗(yàn)。

表3 人工染菌模擬化妝品樣品配方列表

3.3.2 斜面菌苔的驗(yàn)證

按2.1的方法，分別將菌苔醮取物劃線接種于MAC、桿顯平板，36±1℃培養(yǎng)24 h后觀察平板上菌落特點(diǎn)。

4 結(jié)果與分析

4.1 實(shí)驗(yàn)菌株遷徙生長試驗(yàn)

結(jié)果見表4。變形桿菌和非變形桿菌遷徙生長試驗(yàn)典型結(jié)果見圖1。接種變形桿菌的克氏雙糖鐵長斜面，肉眼可見整個(gè)斜面被漫延性生長 （四周擴(kuò)散）的灰白色菌苔基本覆蓋，呈陽性反應(yīng)；而接種非變形桿菌的，菌株都未表現(xiàn)出向上的蔓延生長，有個(gè)別菌株出現(xiàn)了沿斜面向上浸潤生長 （液體附在固體表面上的漸漸滲入）的現(xiàn)象，其向上生長的菌苔沒有超過冷凝液面上1 cm（低于1/4斜面高度），呈陰性反應(yīng)。陽性與陰性的遷徙試驗(yàn)結(jié)果區(qū)分度明顯。

（續(xù)表4）

圖1 變形桿菌和非變形桿菌遷徙生長試驗(yàn)典型結(jié)果

斜面菌苔的驗(yàn)證結(jié)果：培養(yǎng)24 h、48 h后，在所有變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株的血平板上均出現(xiàn)覆蓋膜樣生長的菌苔，并有惡臭味，所有非變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株的血平板上均無菌生長。

4.2 遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)

遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果見表5。其中，P9號菌株遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果見圖2。由表5可見，在菌落計(jì)數(shù)為10 CFU/500 μL以下時(shí)，遷徙生長試驗(yàn)仍能呈現(xiàn)陽性結(jié)果。

表5 遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果（CFU/500 μL）

圖2 P9號菌株遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

4.3 人工模擬樣品遷徙生長試驗(yàn)結(jié)果

4.3.1 試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見表6、圖3。由表6、圖3可見，干擾菌對模擬樣品中變形桿菌遷徙試驗(yàn)結(jié)果沒有影響。

表6 人工染菌模擬樣品遷徙生長試驗(yàn)結(jié)果

圖3 人工模擬樣品遷徙生長試驗(yàn)結(jié)果

4.3.2 斜面菌苔驗(yàn)證結(jié)果

12個(gè)樣品劃線接種于MAC、桿顯平板培養(yǎng)24 h后，生長良好，在MAC平板上均為形態(tài)一致的無色半透明或透明、圓形菌落，大小1～2 mm，菌落生長處平板顏色由桔黃色變無色；在桿顯平板上均為形態(tài)一致的桔黃色至淺褐色菌落，大小1～3 mm，菌落生長處的培養(yǎng)基有的會(huì)變成黃色。經(jīng)生化鑒定分離菌都符合所加入的變形桿菌生化特征。

5 結(jié)論與討論

《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第8版[3]中第八部分腸桿菌科變形菌屬中，雖然沒有將“遷徙生長現(xiàn)象”在變形菌屬予以描述，但手冊的補(bǔ)充評注中將普通變形桿菌（P．vulgaris）和奇異變形桿菌（P．mirabilis）清楚描述“在固體培養(yǎng)基上有顯著的自發(fā)群集的特性；運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的一薄層以旋轉(zhuǎn)和帶狀的改變排列……”；雖然該版本將沒有“遷徙生長現(xiàn)象”特性的摩氏變形桿菌、無恒變形桿菌、雷氏變形桿菌也劃歸為變形桿菌屬，但作為《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》更新版的《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第2版[4]，將他們同時(shí)分別歸類為摩根氏菌屬、普羅威登斯菌屬、雷特菌屬，稱為同模式異名（homotypic synonym）。本研究結(jié)果顯示這種“遷徙生長現(xiàn)象”是變形桿菌屬中普通變形桿菌、奇異變形菌、潘氏變形桿菌固有的，與其他細(xì)菌明顯不同的特征性特點(diǎn)。

本試驗(yàn)應(yīng)用克氏雙糖鐵培養(yǎng)基（乳糖∶葡萄糖為10∶1）而沒有應(yīng)用TSI三糖鐵培養(yǎng)基（乳糖∶蔗糖∶葡萄糖為10∶10∶1），是因?yàn)楹笳弑惹罢叨嗪崽?，普通變形桿菌和潘氏變形桿菌都能分解蔗糖使斜面變黃、部分菌株除產(chǎn)硫化氫還會(huì)出現(xiàn)底層培養(yǎng)基離底，而奇異變形桿菌因不能分解蔗糖斜面為橘紅色或紅色；在克氏雙糖鐵上3種變形桿菌在斜面上都是一致的橘紅色或紅色，底層產(chǎn)酸產(chǎn)硫化氫但不會(huì)出現(xiàn)離底或培養(yǎng)基破裂的現(xiàn)象。本試驗(yàn)也沒有像文獻(xiàn)[10]那樣采用普通營養(yǎng)瓊脂斜面，因?yàn)樽冃螚U菌在普通營養(yǎng)瓊脂斜面上沒有糖發(fā)酵及產(chǎn)酸產(chǎn)硫化氫特點(diǎn)，而且沿斜面產(chǎn)生菌苔遷徙生長沒有克氏雙糖培養(yǎng)基明顯，對于變形桿菌的鑒定效果不好。因此，本文最終選擇應(yīng)用克氏雙糖鐵斜面作為檢測載體。為了防止國產(chǎn)試劑配方差異導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定，選用國內(nèi)市場占有率較高的3個(gè)廠家的克氏雙糖試劑制成斜面，同時(shí)進(jìn)行以上3個(gè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，所有變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株均從斜面底的冷凝液中向上長出灰白色菌苔，并沿斜面向上蔓延生長，可覆蓋整個(gè)斜面，且“動(dòng)力十足”地向下往斜面底層生長并產(chǎn)硫化氫，為遷徙生長試驗(yàn)陽性；非變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株中，多數(shù)未出現(xiàn)肉眼可見的向上生長現(xiàn)象，個(gè)別出現(xiàn)輕微向上浸潤生長現(xiàn)象 （液體附在固體表面上的漸漸滲入現(xiàn)象），且不會(huì)超過冷凝水液面之上1 cm（小于斜面高度1/4位置），遷徙生長現(xiàn)象均呈陰性。遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明，檢測低限可至少達(dá)到 3～7 CFU/500 μL，與文獻(xiàn)中 PCR 檢測方法相當(dāng)[11]。

變形桿菌屬細(xì)菌遷徙生長的影響因素與特定的酸堿度環(huán)境等有關(guān)，它的螺紋遷徙生長現(xiàn)象產(chǎn)生可能與其遺傳特性和地球的自轉(zhuǎn)有關(guān)[8]、瓊脂濃度和表面水分含量有關(guān)[6]、與細(xì)菌的傳代次數(shù)無關(guān)[7]、35℃、培養(yǎng)4 h就能開始遷徙生長[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在克氏雙糖鐵長斜面36±1℃、培養(yǎng)24 h，變形桿菌能很好地顯示其遷徙生長特性。

本研究結(jié)果表明，應(yīng)用本研究開發(fā)的克氏雙糖鐵遷徙生長試驗(yàn)方法，能充分展示變形桿菌的遷徙生長特性，并且能方便、明顯地與其他細(xì)菌區(qū)分出來。人工染菌模擬樣品試驗(yàn)結(jié)果表明，將化妝品樣品的首次增菌液按本文方法進(jìn)行遷徙生長試驗(yàn)，可以很方便地篩查出樣品中含有的微量變形桿菌。所以，遷徙生長現(xiàn)象可應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測。本文首創(chuàng)的“遷徙生長試驗(yàn)”可應(yīng)用于食品、化妝品等樣品變形桿菌的初篩檢測，既可以首次增菌液是否產(chǎn)生遷徙生長現(xiàn)象作為是否含有變形桿菌的初篩判斷依據(jù)之一，也可以在細(xì)菌分純培養(yǎng)后的遷徙生長試驗(yàn)陽性作為變形桿菌的特征性生化鑒定項(xiàng)目之一。

本研究首創(chuàng)的“遷徙生長試驗(yàn)”操作簡單、成本低廉、易于判斷結(jié)果，可作為變形桿菌屬檢測的初篩項(xiàng)目或特征性生化鑒定項(xiàng)目之一。

致謝：向?yàn)楸驹囼?yàn)提供部分實(shí)驗(yàn)菌種的天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染性疾病研究所和深圳龍崗區(qū)疾控中心表示衷心感謝！

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