一步法逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶常溫擴增技術(shù)（RT-RPA）檢測大豆花葉病毒

袁俊杰 魏 霜 龍 陽 馬新華 楊卓瑜 盧乃會乾義柯 魏梅生 李桂芬 張永江*

（1.湛江出入境檢驗檢疫局 廣東湛江 524000；2.廣東出入境檢驗檢疫局；3.伊犁出入境檢驗檢疫局；4.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院）

1 前言

大豆花葉病毒 （Soybean mosaic virus，SMV）在分類學(xué)地位中屬馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），該病毒主要依靠種子和蚜蟲傳播[1]，在我國大豆品種上的種傳率為0%～38%，引起10%～30%的產(chǎn)量下降[2]，如果與菜豆莢斑駁病毒混合侵染大豆，則可造成大豆減產(chǎn)85%[3]，侵染大豆后引起11種大豆植株病狀，如花葉、葉片皺縮、頂枯致死、矮化畸莢、種粒斑駁等[4]，嚴重影響大豆籽粒外觀品質(zhì)和商業(yè)價值。

我國不僅是大豆的原產(chǎn)國，也是全球最大的進口國，“十一五”期間，我國大豆進境量由5 000多萬噸增長至8 000多萬噸，增幅達到60%。近2年大豆進口也一直處于高位增長態(tài)勢[5]，隨著進口大豆數(shù)量的急劇增加，植物病毒類有害生物傳入我國的風險也日益增高，近年來，上海、江蘇、福建、寧波等口岸多次從國外進境的大豆種子中截獲到SMV。為防范該病毒隨進境大豆種子傳播及擴散，迫切需要建立一套準確快速的檢測方法應(yīng)用于進出口快速檢疫。

PCR技術(shù)由于檢測靈敏度高，適用范圍廣，操作簡便等原因應(yīng)用尤為廣泛，但常見的PCR檢測技術(shù)檢測程序復(fù)雜、需要精密的儀器、檢測時間較長，不利于非實驗室環(huán)境下現(xiàn)場檢測以及基層實驗室的推廣應(yīng)用。恒溫擴增技術(shù)是繼PCR技術(shù)后發(fā)展起來的一門新型的體外核酸擴增技術(shù)，由于在恒定溫度下即可擴增，因此不需要熱循環(huán)儀，可用于基層實驗室或現(xiàn)場快速檢測，例如LAMP曾經(jīng)用于大豆花葉病毒檢測。重組酶聚合酶擴增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）是近幾年出現(xiàn)的一種等溫核酸體外擴增技術(shù)，目前在醫(yī)學(xué)病原菌、轉(zhuǎn)基因的檢測中應(yīng)用比較廣泛[6-10]，植物病毒研究中應(yīng)用較少，張娜等[11]曾應(yīng)用于葡萄卷葉伴隨病毒的檢測，特異性強，靈敏度高。RPA技術(shù)主要依賴于3種酶：能結(jié)合單鏈寡核苷酸引物的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶[12]，不需要模板鏈的熱變性、退火和延伸環(huán)節(jié)，可以在恒定的低溫條件下完成核酸的快速擴增。經(jīng)探索，發(fā)現(xiàn)加逆轉(zhuǎn)錄酶于RPA體系中可以將RNA作為模板合成cDNA后再進行擴增，實現(xiàn)一步法擴增，利于RNA病毒核酸檢測[13-14]。該技術(shù)擺脫了對核酸擴增儀的依賴，增大了核酸擴增的便捷度。

目前國內(nèi)利用RT-RPA技術(shù)檢測SMV尚未見報道，本研究根據(jù)SMV的外殼蛋白基因序列，設(shè)計特異性RPA引物，建立SMV的RT-RPA檢測方法，并驗證其特異性和靈敏度，旨在建立一種適用于口岸快速檢測SMV的簡單高效方法。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus，SMV）、菜豆莢斑駁病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）、南方菜豆花葉病毒（Southern bean mosaic virus，SBMV）、南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）及煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV） 樣品均保存于中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，同時設(shè)置陰性對照（健康大豆種子），樣品經(jīng)PCR檢測和序列測定確認后于-80℃凍干保存。植物總RNA提取試劑盒購自天 物科技有限公司；TwistAmp Basic RT為TwistDx Inc公司產(chǎn)品。

2.2 主要儀器與設(shè)備

金屬?。‥ppendorf ThermoMixer）、電泳儀（600SI，上海博彩生物科技有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（GBOX-F3，GENE 公司）。

2.3 方法

2.3.1 RNA提取

參照試劑盒操作，提取5種病毒樣品及陰性對照的總RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 引物設(shè)計

參考RPA引物設(shè)計的要求，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中SMV的外殼蛋白基因序列（ID：AH012604.2），設(shè)計檢測SMV的RPA引物，擴增條帶154 bp。上游引物 SMV-F：5′-AAGATGAATCTTCCAATGGTTGA AGGGAAGATC-3′；下游引物 SMV-R：5′-CAAGC TCATATTCATCTTTAACTGCATTGTACC-3′。 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2.3.3 RT-RPA檢測

以2.3.1中制備的RNA為模板，采用SMV-F和SMV-R引物進行RT-RPA擴增，同時設(shè)置陰性對照。RT-RPA擴增體系（50 μL）的配制方法如下：向含有凍干酶粉的反應(yīng)管中加入再水化緩沖液（Rehydration Buffer）29.5 μL，去離子水 12 μL，上、下游引物各 2 μL （終濃度為 0.4 μmol/L）， 模板RNA 2 μL，最后再加入醋酸鎂溶液 2.5 μL（280 mmol/L）。將RT-RPA擴增體系充分混勻，置于40℃的金屬浴上反應(yīng)40 min。RPA反應(yīng)結(jié)束后，向RTRPA擴增產(chǎn)物中加入50 μL苯酚/氯仿溶液，充分混勻后12 000 r/min離心2 min，取上清液5 μL于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

2.3.4 RT-RPA檢測方法特異性評價

按照2.3.3 RT-RPA檢測反應(yīng)體系，對供試樣品 SMV、BPMV、SBMV、ArMV 及 TRSV 共 5種病毒的RNA進行檢測，設(shè)置陰性對照，對所建立的RTRPA檢測方法特異性進行評價。

2.3.5 RT-RPA檢測方法靈敏度評價

將SMV樣品的總RNA進行10倍梯度稀釋，共5個稀釋度，以梯度稀釋的RNA為模板，按照2.3.3所示的反應(yīng)體系進行RT-RPA靈敏度實驗。

3 結(jié)果與分析

3.1 RT-RPA檢測方法的特異性評價

特異性評價結(jié)果顯示，SMV樣品能夠檢測到154 bp的特異性條帶，其他4種病毒樣品BPMV、SBMV、ArMV、TRSV及陰性對照均未檢測到條帶。同時將陽性擴增產(chǎn)物送公司測序，將測序結(jié)果在NCBI上比對，結(jié)果顯示與大豆花葉病毒序列同源性高達99%。證明該方法具有較強的特異性（圖1）。

圖1 SMV的RT-RPA特異性檢測結(jié)果

3.2 RT-RPA檢測方法的靈敏度評價

對SMV的RT-RPA檢測方法靈敏度檢測結(jié)果顯示（圖2），RPA 檢測方法反應(yīng)時間設(shè)置在40 min，當稀釋度為10-4時，可以檢測約154 bp的目的條帶，當稀釋度為10-5時，未能擴增到目的條帶。

圖2 SMV的RT-RPA檢測靈敏度

4 結(jié)論與討論

大豆花葉病毒是一種在全世界廣泛分布并且破壞性極大的植物病毒，可以導(dǎo)致大豆產(chǎn)量驟減以及種質(zhì)的衰退，每年都會導(dǎo)致許多大豆主產(chǎn)國的巨大經(jīng)濟損失。由SMV引發(fā)的大豆花葉病已經(jīng)在我國大豆產(chǎn)區(qū)大量發(fā)生，目前對該病毒防治方法主要依賴于化學(xué)防治及培育抗性品種，化學(xué)防治對環(huán)境產(chǎn)生巨大危害，而隨著大豆進口量的激增，全球范圍內(nèi)大豆種質(zhì)出現(xiàn)資源交流，新型病毒株系的出現(xiàn)和致病力強弱的變化也給我國大豆抗 SMV育種工作帶來了巨大挑戰(zhàn)[15]，因此在口岸檢疫部門建立快速、靈敏、簡單、高效的SMV檢測技術(shù)，防范該病毒隨進境大豆種子的傳入傳播，對保護我國大豆生產(chǎn)和種質(zhì)資源的安全具有重要意義。

相比其他的植物病毒檢測方法，本研究建立的RT-RPA方法擁有以下優(yōu)點：（1）引物設(shè)計簡單。僅需1對引物即可完成擴增，相比LAMP恒溫擴增技術(shù)簡單，不需要復(fù)雜的引物設(shè)計過程；（2）常溫擴增，不需要昂貴的熱循環(huán)儀。配備一臺小型的水浴鍋或者金屬浴等溫條件下就能實現(xiàn)核酸解鏈，并且逆轉(zhuǎn)錄和RPA恒溫擴增反應(yīng)在同一反應(yīng)管中連續(xù)進行，有效避免了RNA酶對反應(yīng)體系的污染。適合現(xiàn)場、野外檢測。（3）反應(yīng)時間短。目的DNA片段在短時間內(nèi)（15～30 min） 即可得到指數(shù)級積累。（4）結(jié)果易于判斷。產(chǎn)物根據(jù)引物設(shè)計位點有特定大小的條帶，相比LAMP產(chǎn)物的彌散帶結(jié)果更容易判斷。RPA技術(shù)檢測時只需配以瓊脂糖凝膠電泳1 h內(nèi)即可獲得準確的結(jié)果，操作簡單，能夠特異性檢測到供試帶毒樣品中的SMV條帶，對其他幾種植物病毒的檢測結(jié)果均為陰性，說明該方法特異性高。RPA檢測 SMV的靈敏度為10-4稀釋度樣品提取液，和已報導(dǎo)的普通PCR、組織印跡與RT-PCR[16]、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）[17]等檢測技術(shù)的靈敏度相當，說明RPA技術(shù)可作為現(xiàn)場快速篩查SMV的有效手段。

當然RPA作為一種新興的檢測技術(shù)，應(yīng)用于SMV的檢測還存在一些問題。首先，在引物設(shè)計過程中遇到兩方面的難點。一是SMV病株分子變異普遍，存在許多株系[18]，在設(shè)計SMV特異性擴增引物時應(yīng)盡可能多的覆蓋這些株系，否則容易產(chǎn)生漏檢現(xiàn)象。二是為了增強檢測方法的特異性，設(shè)計引物時不僅僅要考慮到SMV不同株系的種內(nèi)保守性，還要兼顧其與其他大豆病毒的種間差異性，這就縮小了引物設(shè)計的范圍。其次，RPA體系對于蛋白活性要求比較高，必須保證體系中任意1種酶均有活性，否則將導(dǎo)致RPA體系停止工作；最后，RPA擴增體系中存在大量蛋白酶，使得RPA擴增產(chǎn)物必須除去蛋白后才能電泳或進行后續(xù)試驗[19]。

傳統(tǒng)的種傳大豆病毒檢測需要檢測種子形成的植株[20-21]，這是因為發(fā)病的大豆葉片中含有大量病毒及病毒RNA，而大豆種子較大豆發(fā)病葉片病毒含量較少，另一方面，大豆種子中富含多糖及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，從種子中直接提取，RNA質(zhì)量和純度均不高，影響后續(xù)檢測，因此以往對進境大豆的病毒檢測經(jīng)常需要將疑似帶毒種子進行隔離培養(yǎng)直至長出葉片，再對葉片進行檢測得到確切結(jié)果，檢測周期長，耗時耗力。本研究建立的RT-RPA方法可直接對干種子進行檢測，且特異性強、靈敏度高，方便快捷，對于進境大豆的檢測具有快速的優(yōu)越性。

5 結(jié)語

我國煉油業(yè)規(guī)模巨大，大豆需求量大，需要長期大量的從國外進口，但是各種植物病害不斷出現(xiàn)，嚴重威脅著我國農(nóng)林產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。RPA技術(shù)操作方便，特異性強、檢測靈敏度高，擴增產(chǎn)物檢測方便，雖然存在一定的缺點，但隨著RPA技術(shù)的不斷發(fā)展、進一步完善以及檢測步驟的改良，將有望在大豆花葉病毒的田間診斷、預(yù)測預(yù)報和大豆脫毒苗的生產(chǎn)等研究領(lǐng)域得到更加廣泛的應(yīng)用，在我國植物病毒快速檢測和一線國門檢疫提供有效的技術(shù)支持。

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