鼠神經(jīng)生長因子穴位注射聯(lián)合通督調(diào)神針法對大鼠腦卒中后抑郁模型的影響

李善華，周 利，張 霞，李 莉

(1.十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院,湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

腦卒中后抑郁(Post-stroke depression，PSD)屬繼發(fā)性抑郁癥，是腦卒中后恢復(fù)期最常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，因其神經(jīng)功能恢復(fù)延緩，患者常有情緒低落、興趣減退及睡眠障礙等臨床表現(xiàn)，且嚴(yán)重PSD者有自殺行為(或)傾向，因此，研究如何治療PSD具有重要意義[1]。研究表明，穴位注射鼠神經(jīng)生長因子(Mouse nerve growth factor，mNGF)可起到營養(yǎng)神經(jīng)、促進(jìn)受損中樞神經(jīng)元生長分化、恢復(fù)損傷神經(jīng)功能的作用[2-3]。此外，大量臨床治療表明，在治療PSD時，運用通督調(diào)神針法針刺神庭、水溝、大椎、百會等穴位可顯著改善PSD患者神經(jīng)功能[4]。目前兩者在治療PSD時相互作用的機(jī)制還不太明確，本實驗采用膜片鉗技術(shù)記錄海馬CA1區(qū)自發(fā)性動作電位(Action potential，AP)和群峰電位(Population spike，PS)及與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)、相關(guān)蛋白，并結(jié)合行為測試來分析穴位注射mNGF聯(lián)合通督調(diào)神針法對PSD模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響，分析其治療PSD的機(jī)制，力圖在此類研究中有所突破，為臨床治療PSD提供實驗及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選經(jīng)曠場實驗(OPEN-FIELD)行為學(xué)評分篩選合格的健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量160～170 g，購自湖北醫(yī)藥學(xué)院動物中心，所有動物均于實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.1.2 實驗儀器和試劑 WMT-100型Morris水迷宮(成都泰盟)；鼠神經(jīng)生長因子[舒泰神(北京)生物制藥股份有限公司，批號：017S20060023]；水合氯醛(武漢博菜特化工有限公司)；玻璃電極拉制儀(日本Narishige公司，型號：PP-83)；振動切片機(jī)(英國Campden公司，型號：752M)；膜片鉗放大器(英國Campden公司，型號：Mul-ticlamp700A)；S100B蛋白和神經(jīng)絲蛋白(NFP)ELISA試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備和分組 大鼠PSD模型制備[5]：采用OPEN-FIELD篩選合格的健康雄性SD大鼠50只，將評分接近的40只造模。用10%水合氯醛(35 mg·kg-1)腹腔注射，待麻醉后俯臥位固定，剪去頸部皮膚,消毒，鋪無菌巾，切開頸部皮膚，分離左側(cè)頸內(nèi)動脈，結(jié)扎左側(cè)頸內(nèi)動脈(結(jié)扎時可在動脈平行放一6號半針頭，拉緊絲線，然后抽出針頭，這樣可使頸內(nèi)動脈內(nèi)徑縮小1/2)造成大鼠局灶性腦缺血。術(shù)后2 h以大鼠行走向?qū)?cè)倒體或行走轉(zhuǎn)圈、靜止時向?qū)?cè)前肢蜷曲、Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評分為1～4分為納入標(biāo)準(zhǔn)，0和5分棄去[6]。納入的動物在術(shù)后1周內(nèi)每天給予1次中等強(qiáng)度的慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激刺激(Chronic unpredicta-ble mild stress，CUMS),共處理3周。CUMS刺激方法：每天選擇以下7種刺激中的一種(或按順序選擇其中的一種)，包括禁食24 h、禁水24 h、夾尾1 min、45℃烤箱烘烤5 min、利用燈光使動物活動晝夜顛倒、4℃冰水游泳5 min、振蕩機(jī)高速水平振蕩30 min等7種刺激方法。以上應(yīng)激刺激交替進(jìn)行，刺激后將造模大鼠單獨飼養(yǎng)(孤養(yǎng))。3周后再經(jīng)過OPEN-FIELD行為學(xué)評分篩選成模大鼠進(jìn)行分組和治療[7]。

分組：將以上應(yīng)激孤養(yǎng)3周的造模大鼠再經(jīng)過OPEN-FIELD行為學(xué)評分篩選，保留其中合格(成模)的PSD大鼠20只，隨機(jī)分為模型組(PSD組)和治療組,各10只，另10只正常SD大鼠作為正常組。正常組不造模，并且5只共養(yǎng)，不做CUMS處理。

1.2.2 治療方法 正常組和PSD組不做任何治療。治療組針刺取穴參照《實驗針灸學(xué)》，針刺取“神庭、水溝、大椎、百會”穴位[8]。針刺每日1次，每次25 min，運用“通督調(diào)神針法”，中間行針3次，針刺治療每周 6次為1個療程，治療 4 個療程。針刺后于以上諸穴注射mNGF，注射前參照動物用藥計算公式準(zhǔn)確計算用藥劑量。將mNGF用注射用生理鹽水配制成0.1%溶液，按1 mg·kg-1穴位注射，間隔1天注射治療1次，共注射14天。

1.2.3 Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評分方法 分6個等級，其中無功能障礙記0分；不能伸展前肢記1分；向一側(cè)旋轉(zhuǎn)記2分；向一側(cè)傾倒記3分；無自主活動伴意識抑制記4 分；死亡記5 分。

1.2.4 CA1區(qū)腦薄片的制備和膜片鉗技術(shù) 先配制人工腦脊液并通95%O2+5%CO2飽和，置于4℃冰箱備用。斷頭處死大鼠，咬去頂骨，迅速分離腦組織，放入4℃飽和人工腦脊液中修整分離出海馬CA1區(qū)組織，用振動切片機(jī)切片(厚約300～400 μm)。孵育1 h后進(jìn)行膜片鉗技術(shù)記錄海馬CA1區(qū)自發(fā)性動作電位(Action potential，AP)和群峰電位(Population spike，PS)[9]。

1.2.5 免疫組化檢測 取CA1區(qū)海馬腦薄片，石蠟包埋，切片、烤干、脫蠟，用3%HO溶液沖洗10 s，滴一抗，4℃過夜，陰性對照滴加PBS溶液。隔日后室溫下復(fù)溫，滴二抗工作液，37℃孵育10 min，辣根酶標(biāo)記10 min；用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，然后分化、返藍(lán)、脫水、封片。腦薄片SP染色后乙酰膽堿(Ach)和神經(jīng)絲蛋白(NFP)蛋白陽性為胞漿棕黃色或黃褐色。用圖像分析軟件統(tǒng)計各組平均光密度值(IOD)。在處死動物前取斷尾取0.2 mL尾靜脈血，采用免疫吸附法檢測靜脈血清乙酰膽堿脂酶(AChE)和S100B 蛋白含量[10]。

1.2.6 Morris水迷宮實驗 于治療結(jié)束后用WMT-100型Morris水迷宮分析系統(tǒng)中定位航行試驗和空間探索實驗以確定逃避潛伏期和60 s內(nèi)穿越原平臺次數(shù)，結(jié)合Zea Langa神經(jīng)行為學(xué)評分評定大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬CA1區(qū)AP和PS膜電位電位值比較

正常組大鼠海馬CA1區(qū)AP膜電位電位值和PS記錄的膜電位均保持在正常范圍(61.32±4.69)mV。PSD組大鼠海馬CA1區(qū)AP和PS記錄的膜電位異常增高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療組AP和PS記錄的膜電位明顯低于PSD組(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠海馬CA1區(qū)AP和PS膜電位電位值比較

注：與正常組比較，1)P<0.05;與PSD組比較，2)P<0.05

2.2 大鼠海馬CA1區(qū)組織中Ach和NFP比較

PSD組大鼠CA1區(qū)組織中Ach和NFP含量降低，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組則明顯增多，與PSD組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠海馬CA1區(qū)組織中Ach和NFP比較

注：與正常組比較，1)P<0.05;與PSD組比較，2)P<0.05

2.3 大鼠靜脈血清AChE和S100B蛋白含量比較

PSD組大鼠血清AChE和S100B蛋白含量均增高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療組大鼠血清AChE和S100B蛋白含量均降低，與PSD組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠靜脈血清AChE和S100B 蛋白含量比較

注：與正常組比較，1)P<0.05;與PSD組比較，2)P<0.05

2.4 大鼠Morris水迷宮測試結(jié)果及Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評分比較

PSD組大鼠定位航行試驗逃避潛伏期明顯升高，在空間探索試驗撤去平臺60 s中，PSD組跨越平臺次數(shù)減少，且大鼠Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評分增大，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而治療組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，跨越平臺次數(shù)明顯增多，且大鼠Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評分較PSD組明顯降低，與PSD組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 大鼠Morris水迷宮測試結(jié)果及Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評分比較

注：與正常組比較，1)P<0.05;與PSD組比較，2)P<0.05

3 討論

“PSD”屬中醫(yī)學(xué)郁證的“因病致郁”范疇，患者在腦神失常后又會出現(xiàn)五臟神紊亂現(xiàn)象，故其病位雖在腦，但隨病性加重而致心、肝、脾、肺、腎等五臟功能異常[11]。鼠神經(jīng)生長因子(mNGF)是從小鼠頜下腺中提取的一類具有營養(yǎng)神經(jīng)功能的蛋白，在動物實驗中發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，改善己二酮或丙烯胺致小鼠中毒性周圍神經(jīng)炎引起的運動障礙[12]。而針刺能起到安神定志、調(diào)理氣血、醒腦開竅的治療作用[13]。本實驗通過穴位直接注射mNGF，結(jié)合通督調(diào)神針法針刺神庭、水溝、大椎、百會穴，觀察其對PSD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及行為學(xué)的影響。

觀察發(fā)現(xiàn)，治療組大鼠在干預(yù)性治療后，膜片鉗記錄顯示治療組AP和PS電位值明顯降低，免疫組化發(fā)現(xiàn)CA1區(qū)組織中Ach表達(dá)上調(diào)，靜脈血AChE降低，這可能是針刺產(chǎn)生的治療作用。有研究表明，針刺可糾正病灶產(chǎn)生的異常電活動，因PSD模型腦組織存在持續(xù)性缺血，這會導(dǎo)致持續(xù)Na通道開放，Na+內(nèi)流增加，這樣細(xì)胞內(nèi)Na+濃度持續(xù)增加引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，這也是PSD組大鼠海馬CA1區(qū)AP和PS記錄的膜電位異常增高的離子基礎(chǔ)。而針刺治療能促進(jìn)持續(xù)開放的Na通道關(guān)閉，使Na+內(nèi)流減少，細(xì)胞內(nèi)外離子水平重新恢復(fù)平衡，防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，使神經(jīng)細(xì)胞功能得以逐漸恢復(fù)[14]。Ach是中樞釋放的神經(jīng)遞質(zhì),其與大腦的學(xué)習(xí)、記憶功能密切相關(guān)，Ach對于維持意識的清醒及學(xué)習(xí)記憶起重要作用，而AchE可水解神經(jīng)突觸Ach，降低中樞神經(jīng)突觸Ach含量，造成學(xué)習(xí)和記憶力下降[15]。本實驗中治療組CA1區(qū)組織中Ach表達(dá)上調(diào)，靜脈血AChE降低，提示針刺可提高中樞膽堿能神經(jīng)釋放神經(jīng)遞質(zhì)Ach，并抑制AChE釋放，使神經(jīng)突觸Ach水解減少，這樣，中樞神經(jīng)突觸Ach增多，膽堿能神經(jīng)興奮性恢復(fù)，使PSD導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙得以改善。S100B蛋白主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的室管膜細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和樹突膠質(zhì)細(xì)胞，大量臨床檢測發(fā)現(xiàn)，PSD患者血清S100B蛋白濃度明顯提高，S100B蛋白增高可導(dǎo)致腦組織對缺血缺氧的敏感性，增加神經(jīng)元損傷及衰亡的風(fēng)險，而抗抑郁治療后則顯著下降，說明其濃度變化與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[16]。NFP主要分布于神經(jīng)細(xì)胞胞體和神經(jīng)突觸內(nèi)，由神經(jīng)元胞體合成，主要發(fā)揮維持神經(jīng)元功能及軸漿運輸作用，可促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)和再生以盡快恢復(fù)神經(jīng)功能的作用[17]。治療組CA1區(qū)組織中NFP的表達(dá)上調(diào)，靜脈血S100B蛋白含量降低。提示穴位注射mNGF可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞胞體和神經(jīng)突觸內(nèi)NFP的合成，修復(fù)受損神經(jīng)元，同時抑制S100B蛋白合成，降低腦組織對缺血缺氧的敏感性，在一定程度降低神經(jīng)元持續(xù)損傷的風(fēng)險。治療組在以上綜合作用下，Morris水迷宮實驗顯示治療組定位航行實驗逃避潛伏期縮短，空間探索實驗跨越平臺次數(shù)明顯增多，Zea Langa評分提高，說明穴位注射mNGF聯(lián)合通督調(diào)神針法可改善PSD模型大鼠腦組織及神經(jīng)系統(tǒng)所處的微環(huán)境，消除學(xué)習(xí)記憶障礙。

總之，在本實驗中，穴位注射mNGF可促進(jìn)NFP的合成，修復(fù)受損神經(jīng)元，同時抑制S100B蛋白合成，降低PSD后腦組織對缺血缺氧的敏感性，起到直接修復(fù)和保護(hù)受損神經(jīng)元作用。而采用通督調(diào)神針法針刺神庭、水溝、大椎、百會等穴，一方面起到安神定志、醒腦開竅的作用，還可通過提高膽堿能神經(jīng)突觸釋放Ach，抑制異常升高的膜電位，減輕神經(jīng)功能損傷和退化，進(jìn)而改善PSD大鼠學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能。

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