針刺療法對腹瀉型腸易激綜合征大鼠Nrf2-Keap1-ARE信號通路的影響*

李湘力,胡 濤,劉小寧,蔡敬宙,柯 姍

(1.廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180;2.武漢市兒童福利院，湖北 武漢 430060)

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是以腹痛或腹部不適，大便習(xí)慣改變，并伴有一系列胃腸道癥狀及精神癥狀而腸道缺乏明顯病理性改變?yōu)樘卣鞯墓δ芪蓙y性疾病，其中以腹瀉型腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome with diarrhea,IBS-D)多見[1]。最近國內(nèi)外一系列重要臨床研究結(jié)果認(rèn)為針灸對治療和緩解IBS-D癥狀有著明顯的成效[2-4]，然而其更加深入的分子生物學(xué)機制研究還十分有限。

本研究利用Wistar大鼠建立IBS-D模型，并針刺穴位，觀察針刺對IBS-D的緩解作用以及體內(nèi)Nrf2-Keap1-ARE通路表達(dá)情況，并利用siRNA技術(shù)，沉默大鼠體內(nèi)Nrf2基因，探討此通路在IBS-D的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

4周齡Wistar大鼠50只，雄性，體質(zhì)量100～120 g，由廣州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,所有動物均依據(jù)動物實驗倫理委員會的要求進(jìn)行實驗。在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，50只Wistar大鼠隨機分為IBS-D模型組、藥物致瀉模型+強行應(yīng)激法(Chronic and acute stress,CAS)刺激組、CAS+針刺組、CAS+針刺+Nrf2 siRNA(Nrf2sh)組和正常組，每組10只。

1.2 主要儀器與試劑

Bio-Rad CFX96 System PCR儀(美國伯樂公司)；0.30 mm×15 mm華佗牌一次性無菌針灸毫針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);RNAiso Plus試劑盒(日本Takara公司)；5-HT、NPY試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；MDA、GSH/GSSG試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SOD試劑盒(日本同仁化學(xué)公司)；ROS試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；Real-time PCR 相關(guān)試劑盒(上海基爾頓生物科技有限公司)；相關(guān)Western-blot一抗及二抗(美國Abcom or Cell signaling公司)。

1.3 造模方法

大鼠通宵光照12 h→45℃環(huán)境溫度刺激5 min→飲水剝奪24 h→4℃低溫環(huán)境3 min→鼠尾夾刺激1 min→水平振動(120/min)刺激40 min→食物剝奪24 h，持續(xù)3周[5]，獲得IBS-D模型大鼠。大鼠在CAS刺激前1 h灌胃番木液(6 g/kg)，其后實施CAS刺激 (模型強化)，操作步驟可根據(jù)相關(guān)研究[6-7]，以獲得藥物致瀉+CAS模型大鼠。

1.4 各組處理方法

CAS+針刺組：10只，CAS刺激后，根據(jù)李忠仁編寫的《實驗針灸學(xué)》選取穴位，雙側(cè)取穴：ST25(天樞)、ST36(足三里)和LR3(太沖)，針刺深度3 mm，留針30 min，每隔10 min行針1次。

CAS+針刺+Nrf2sh組[8]：10只大鼠，參照Genebank中，鼠Nrf2基因mRNA序列，按照siRNA序列設(shè)計原則進(jìn)行設(shè)計：從mRNA中AUG起始密碼下游75-100堿基位置開始，尋找“AA”二連序列，并記錄下其3′端19個堿基序列，選擇G:C在40～55%之間的靶序列。并利用BLAST軟件和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫比較潛在的siRNA靶序列，排除和其他編碼序列/EST同源的序列，選擇3條siRNA序列和1條隨機對照序列。慢病毒載體構(gòu)建siRNA，分別設(shè)計4對引物并進(jìn)行體外構(gòu)建(NFE2L2-HOMO-1498: 5′GCCCAUUGAUGUUUCUGAUTT&3′AUCAGAAACAUCAAUGGGCTT、NFE2L2-HOMO-934: 5′CCCGUUUGUAGAUGACAAUTT&3′AUUGUCAUCUACAAACGGGTT、NFE2L2-HOMO-2226:5′GCACCUUAUAUCUCGAAGUTT&3′ACUUCGAGAUAUAAGGUGCTT和NC-siRNA:5′UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT&3′ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT)，額外取Wister大鼠1只，使用微量注射器取對照病毒稀釋液，在鼠尾靜脈處注射6 μL病毒稀釋液，在注射完后12 h、24 h、72 h、7天和14天時，利用RNAiso Plus試劑盒提取腸道組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Realtime-PCR結(jié)果選取沉默效果最佳的1條siRNA干擾慢病毒。再進(jìn)行鼠尾靜脈注射，注射3周后進(jìn)行CAS刺激和針刺治療。

正常組：10只大鼠，正常飼養(yǎng)，無任何物理、化學(xué)及其它額外干預(yù)。

1.5 觀測指標(biāo)及檢測方法

利用ELISA法檢測5-HT和NPY的表達(dá)水平：終末次干預(yù)后，禁食12 h，全部實驗組大鼠進(jìn)行深度麻醉 (烏拉坦, 6 mL/kg, i.p.)。取末端結(jié)腸檢測5-羥色胺(5-HT)和神經(jīng)肽Y(NPY)。操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

末端結(jié)腸抗氧化性酶活力和脂質(zhì)過氧化水平檢測：取末端結(jié)腸進(jìn)行蛋白定量，并利用生化試劑盒檢測MDA的含量、GSH、GSSG的含量，利用WST-1法檢測SOD的含量和利用DCFH熒光探針檢測組織中ROS的水平。操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

利用Real-time PCR檢測Nrf2信號通路基因表達(dá)水平：取末端結(jié)腸，4條基因的擴增引物見表1，按以下兩步法 PCR 擴增標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行程序的設(shè)置：Stage 1：預(yù)變性(1 Cycle)95℃ 30 s；Stage 2：PCR反應(yīng)(40 Cycles)95℃ 5 s～60℃ 30 s；Stage 3：溶解曲線分析95℃ 0 s 65℃ 15 s 95℃ 0 s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴增曲線和融解曲線，此外定量時由軟件直接得到Ct值，然后用2■ΔΔCt方法進(jìn)行分析，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算待測Nrf2、Keap-1、HO-1和JNK基因的mRNA含量。

表1 引物序列信息

利用Western-blot檢測Nrf2信號通路蛋白表達(dá)水平：取小鼠末端結(jié)腸約50 mg，剪碎后加入1 mL裂解液(其中RIPA:PMSF=99∶1)，置于冰上充分勻漿，然后將勻漿混合物置于4℃充分裂解2 h，離心15 min(12 000 rpm，4℃)后留取上清。并用BSA法進(jìn)行蛋白定量，上樣量約為40 μg/μL，電泳1 h后，濕轉(zhuǎn)法2 h，5%脫脂牛奶封閉，一抗(1∶1000，Cell Signaling)孵育過夜(4 ℃)，二抗(兔抗鼠，1∶10 000，4 h，Cell Signaling)，其后TBS-T洗脫。將PVDF膜置于吸水紙上吸干水分，而后蛋白面朝上平鋪于玻璃板上，將顯影液均勻而緩慢地澆于膜上，使顯影液布滿整個膜，約5 min后吸干發(fā)光液并將其置于暗盒中，迅速關(guān)閉暗盒。根據(jù)顯影情況適當(dāng)調(diào)整曝光時間，用GeneSnap進(jìn)行圖像拍攝，隨后可使用Photoshop軟件對蛋白采取半定量分析。目的蛋白的相對表達(dá)量為目的蛋白積分光密度/β-actin積分光密度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)使用means±SEM(standard error of the mean)表示，采用方差分析(ANOVA)和Student-Newman-Keuls多重檢驗(SNK-test)比較計量資料的組間差異，而計數(shù)資料則采用卡方檢驗(Chi-square test)和Fisher's確切概率法(Fisher's Exact Propability Test)進(jìn)行統(tǒng)計分析。P<0.05或P<0.01表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化水平比較

通過針刺療法后，IBS模型組、藥物致瀉模型+CAS刺激組和CAS+針刺+Nrf2sh組的ROS和MDA水平高于CAS+針刺組(P<0.01)和正常組(P<0.01)。其中，CAS+針刺+Nrf2sh組的MDA水平最高，說明IBS與脂質(zhì)過氧化有關(guān)，并且在沉默Nrf2的表達(dá)后，脂質(zhì)過氧化的水平上升。然而，藥物致瀉模型+CAS刺激組和CAS+針刺組之間的MDA水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異，可能是針刺并不是通過抑制脂質(zhì)過氧化來起到作用。在抗氧化酶活性的檢測中，可以觀察到IBS-D模型組、藥物致瀉模型 + CAS刺激組和CAS+針刺+Nrf2sh組的GSH水平均低于CAS+針刺組(P<0.01)和正常對照組(P<0.01)，而GSSG水平呈相反趨勢(P<0.01)，表明GSH的耗竭現(xiàn)象及低效率的氧化還原現(xiàn)象。此外，SOD作為生物體內(nèi)捕捉陰離子最有效的抗氧化酶，在通過針刺后有較高的活性水平。結(jié)果表明：正常組和CAS+針刺組的SOD水平均高于其他組(P<0.01)。這也預(yù)示了，針刺可能是通過調(diào)節(jié)抗氧化酶來抑制IBS-D模型中的氧化性損傷。見表2。

表2 各組抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化水平比較

注:與正常組比較,*P<0.01；與CAS+針刺組比較,#P<0.01

2.2 各組腸神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)水平比較

通過針刺治療后，正常組和CAS+針刺組的5-HT和NPY的水平均低于其他組(P<0.01)。其中CAS+針刺+Nrf2sh組5-HT的表達(dá)最高，這也表明在IBS-D模型中Nrf2的過度抑制表達(dá)可能與過度腸蠕動有關(guān)。見表3。

表3 各組腸神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)水平比較

注：與正常組比較,*P<0.01;與CAS+針刺組比較,#P<0.01

2.3 各組腸組織中Hrf2和相關(guān)通路靶點的基因及蛋白質(zhì)表達(dá)水平比較

本研究中，正常組和CAS+針刺組的JNK的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)明顯低于其他干預(yù)組(P<0.01)。因此，在下游的信號通路靶點中也可以觀察到正常組和CAS + 針刺組的Nrf2、Keap-1和HO-1的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)均與其他干預(yù)組有差異(P<0.01)。見表4及圖1。這也與本研究中抗氧化酶水平的趨勢相似。因此，推測IBS-D模型中的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)JNK的過度表達(dá)造成了Nrf2的表達(dá)抑制，最終促成腸道氧化性損傷。

表4 各組腸組織中Hrf2和相關(guān)通路靶點的基因及蛋白質(zhì)表達(dá)水平比較

注：與正常組比較,*P<0.01；與CAS+針刺組比較,#P<0.01

圖1 各組大鼠Nrf2、Keap-1、JNK和HO-1的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平比較

3 討論

IBS-D是一種臨床常見的胃腸功能性疾病，該病易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。其發(fā)病機制尚未明確，西醫(yī)治療以對癥治療為主，如利用胃腸解痙藥、止瀉藥、瀉藥(便秘型)、腸道動力感覺調(diào)節(jié)藥、抗抑郁藥和腸道菌群調(diào)節(jié)藥物等來進(jìn)行治療。藥物治療雖然可以取得一定療效，但停藥后易反復(fù)，且長期服用不良反應(yīng)明顯[8]。

國內(nèi)外研究表明針灸對治療和緩解IBS-D有著明顯的成效。有研究者[9]就針灸對IBS-D的治療機理做出了詳細(xì)的系統(tǒng)性回顧。認(rèn)為其作用機制主要分為調(diào)節(jié)腸道蠕動能力、降低腸道的敏感性、調(diào)節(jié)腦-腸軸和神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)、調(diào)節(jié)椎體神經(jīng)元的敏感性、調(diào)節(jié)腸道菌群的比例。雖然，在眾多的研究中已經(jīng)觀察到針灸能夠降低IBS-D的臨床癥狀和改善其生化等指標(biāo)[10]。然而，基于針灸對IBS-D治療(人群和動物模型)的分子機制研究還非常有限，特別是缺乏探究針灸與具體信號通路之間關(guān)系的研究[11]。

轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor2, Nrf2) 是機體內(nèi)一個重要的保護(hù)性轉(zhuǎn)錄分子，廣泛分布于機體的各個器官中。在生理狀態(tài)下，Nrf2以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；當(dāng)機體處于應(yīng)激狀態(tài)時被激活，并通過多種途徑來增強機體的抗氧化、解毒、抗凋亡等功能。其中，以Nrf2和抗氧化轉(zhuǎn)錄元件(ARE)為核心的Nrf2-ARE(Nrf2-Keap-1-HO-1)信號路徑是Nrf2增強機體抗氧化、解毒功能最重要的保護(hù)性信號路徑。在某些特定情況下，如：在長期-慢性感染中，細(xì)菌脂多糖(LPS)能夠造成組織氧化性損傷(有些IBS的病因也與此極其相似)，在Nrf2上調(diào)表達(dá)后，能夠協(xié)同性的磷酸化細(xì)胞內(nèi)血紅素氧合酶-1(Hemeoxgenase-1,HO-1)的表達(dá)上調(diào)，共同降低由感染造成的細(xì)胞內(nèi)氧化性損傷[12-13]。這些結(jié)果也提示了：Nrf2-Keap1-ARE通路可作為針灸治療IBS的重要切入點。

本研究以Keap-1/Nrf2作為分子機制的切入點，結(jié)合氧化應(yīng)激理論，研究針刺通過調(diào)節(jié)此信號通路的表達(dá)。經(jīng)本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過針刺后IBS-D大鼠抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化水平上升，這提示針刺可能是通過調(diào)節(jié)抗氧化酶來抑制IBS-D大鼠模型的氧化性損傷。同時，針刺治療后，IBS-D大鼠模型5-HT和NPY的表達(dá)最高，這也表明在IBS模型中Nrf2的過度抑制表達(dá)可能與過度腸蠕動有關(guān)，因為5-HT和NPY作為是生物體內(nèi)重要的神經(jīng)信號遞質(zhì)、飽食信號遞質(zhì)和腸蠕動信號遞質(zhì)之一，起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)機制和反饋機制[14]，但在病理因子的刺激(如凋亡、炎性因子和氧化性損傷)下，過度表達(dá)可能會導(dǎo)致生物體體內(nèi)或器官的不正常機能。另外，本次研究中，各組腸組織中Hrf2和相關(guān)通路靶點的基因及蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生了改變，其中，JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPK(Mitogen-activated protein kinase)通路中重要分支，它在細(xì)胞周期、生殖、凋亡和細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用[15]。筆者推測IBS-D模型中的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)JNK的過度表達(dá)造成了Nrf2的表達(dá)抑制，最終促成腸道氧化性損傷。

本研究以Keap-1/Nrf2作為分子機制的切入點，表明了針刺通過調(diào)節(jié)此信號通路的表達(dá)，然而，由于基因表達(dá)的“空間性”和“時間性”的網(wǎng)絡(luò)特征，針刺應(yīng)用于IBS-D的治療是否還與其他信號通路有關(guān)，還需未來更多的研究提供客觀依據(jù)。

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