針刺“足三里”對免疫抑制大鼠的作用及穴區(qū)CGRP表達影響的研究*

代巧妹，王美嶠，顏培宇，2△，尚艷琦，梁 慧，蔡文輝，王 垚

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.澳門科技大學(xué)，中國 澳門 519020)

足三里為胃經(jīng)合穴，有補益脾胃、調(diào)和氣血、祛邪防病之功。對針刺腧穴的作用機理研究證明：腧穴作用中的“調(diào)和氣血”即包括了現(xiàn)代解剖學(xué)中的淋巴系統(tǒng)[1-4]。有報道針刺可以調(diào)整人體白細(xì)胞總數(shù)，使之趨向正常；家兔動物實驗亦證實針灸足三里穴對白細(xì)胞總數(shù)有一定影響，且中性粒細(xì)胞的變化與白細(xì)胞總數(shù)的變化呈平行關(guān)系。另有研究顯示針刺足三里治療瘧疾可以使淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率提高[5]。這些研究表明足三里穴可能對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一定作用，但缺乏相關(guān)動物實驗研究的進一步證實。皮膚重要神經(jīng)遞質(zhì)的降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)與表皮和真皮內(nèi)的多種靶細(xì)胞接觸，可直接影響皮膚內(nèi)重要的具有抗原提呈功能的樹枝狀細(xì)胞-郎格漢斯細(xì)胞以及微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。針刺調(diào)節(jié)神經(jīng)末梢CGRP的釋放，與針刺的神經(jīng)保護、抗缺血、調(diào)節(jié)血壓、調(diào)節(jié)胃腸運動、保護胃黏膜、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛作用等均有密切聯(lián)系，這些研究結(jié)果提示CGRP可能參與針刺效應(yīng)，而這種效應(yīng)在不同的疾病中會引起不同靶器官效應(yīng)[6-8]。在本研究中，筆者用免疫抑制劑環(huán)磷酰胺建立免疫抑制大鼠模型，使用傳統(tǒng)針刺和電針兩種方法針刺大鼠足三里穴，并研究局部穴區(qū)CGRP變化，從而揭示針刺治療疾病的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

健康SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量280～350 g。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：scxk(京)2007-0001。

1.2 藥品和試劑

Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)，RNA simple Total RNA Kit(天根生化科技北京有限公司)，環(huán)磷酰胺(上海谷研實業(yè)有限公司)，2×Power Taq PCR MasterMix(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)，RNase固相清除劑(北京天恩澤基因科技有限公司)，引物(生工生物工程上海有限公司)。

1.3 儀器

電針儀(汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠)，凝膠成像分析儀(北京六一生物科技有限公司)，水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，PCR儀(杭州博日科技有限公司)，ADVIA 120血球分析儀(德國西門子公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗分組及造模

正常SD雄性大鼠30只，隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、針刺組和電針組共5組，每組各6只。正常組小鼠不做任何處理，假手術(shù)組腹腔注射0.9%無菌生理鹽水3天，第4天加強注射1次。其余各組均腹腔注射新鮮配制的環(huán)磷酰胺注射液(50 mg/kg)，連用3天，第4天加強注射1次，制備免疫抑制模型[9]。

2.2 針刺選穴及針刺操作方法

根據(jù)華興邦《大鼠穴位針灸圖譜》，取 “足三里”穴。針具選擇30號針，進針3 mm。針刺手法：補法(重插輕提、徐徐捻轉(zhuǎn)、吸氣時進針)[8]。針刺組施行補法治療，留針30 min，每日1次。電針組給予電針補法治療，連續(xù)波，頻率20 Hz，強度1～2 mA，持續(xù)30 min，每日1次。實驗各組大鼠綁縛固定操作，正常組、假手術(shù)組及模型組分別綁縛但不針刺，治療7天。

2.3 測定白細(xì)胞計數(shù)

大鼠尾靜脈取血，用乙二胺四乙酸(EDTA)作為抗凝劑，用ADVIA-120 血球分析儀檢測白細(xì)胞計數(shù)。

2.4 測定脾臟、胸腺指數(shù)

各組大鼠稱重，無菌取大鼠脾與胸腺，稱重，根據(jù)文獻計算脾臟與胸腺指數(shù)[9]。

2.5 總RNA提取及cDNA的制備

治療結(jié)束后，處死大鼠，取“足三里”區(qū)大約皮下10 mm×3 mm區(qū)域組織，迅速冷凍于液氮瓶。研砵預(yù)冷，加入液氮充分研磨組織，待組織呈粉末狀加入1 mL RZ裂解液，充分混勻，在室溫下放置5 min。利用總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA。比色杯測RNA濃度，用1 μg的RNA去逆轉(zhuǎn)錄，每12 μL體系中加入oligo (dT)151 μL，random 1 μL，dNTP(2.5 mMeach) 2 μL，5×Buffer 4 μL，RNasin 0.5 μL，M-MLV 1 μL，實驗樣品RNA 2 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃溫浴10 min， 42℃溫浴50 min，95 ℃ 加熱5 min終止反應(yīng)，將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物置于-20℃保存。

2.6 PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系， 2×Taq PCR Master-mix 10 μL，CDNA 1 μL，上游特異性引物1 μL，下游特異性引物1 μL，ddH2O補足至20 μL。β-actin引物序列：上游引物：5′GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TAG C3′，下游引物：5′GGC CGG ACT CAT CGT ACT CCT GCT T3′，β-actin擴增條件：95 ℃ 5 min預(yù)變性，95 ℃ 20 s變性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 延伸，4 ℃ 5 min終末延伸。30循環(huán)，4℃保溫。CGRP引物序列：上游引物：5′CAG GAG GAG GAA CAG GAG GCT3′，下游引物：5′CAG GTG CTC CAA CCC CAA T3′[8]，CGRP擴增條件：95 ℃ 5 min預(yù)變性，95 ℃ 20 s變性，62 ℃ 20 s退火，72 ℃延伸，4 ℃ 5 min終末延伸。30循環(huán)，4℃保溫。

2.7 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 各組免疫抑制相關(guān)指標(biāo)評價

針刺組大鼠體重、脾臟、胸腺指數(shù)及白細(xì)胞計數(shù)與模型組相比顯著增加，電針組大鼠體重、胸腺指數(shù)與模型組相比顯著增加，見表1。

3.2 各組穴區(qū)內(nèi)CGRP表達比較

RT-PCR結(jié)果顯示：電針組和針刺組治療后，穴區(qū)CGRPmRNA表達量顯著下降，與模型組比較有顯著性差異；針刺組下降程度顯著高于電針組，兩組比較有顯著性差異。見圖1、表2。

圖1 針刺對“足三里”穴區(qū)CGRPmRNA表達的影響注：M：Marker;MJ：模型組；AJ：電針組；BJ：針刺組

組別體重(g)WBC(×103/ul)脾臟指數(shù)胸腺指數(shù)正常組300.41±62.5911.27±3.882.37±0. 762.15±0. 64假手術(shù)組287.19±59.2810.93±3.562.25±0. 581.93±0. 74模型組234.21±66.574.92±1.991.46±0. 621.18±0. 49電針組254.59±70.62*6.55±2.351.61±0. 601.57±0. 60*針刺組266.43±72.73*9.23±3.18**1.98±0. 73**1.8±0.005 6**

注:與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

表2 各組大鼠“足三里”穴區(qū)內(nèi)CGRP表達情況比較

注:與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與電針組比較，▲P<0.05

4 討論

環(huán)磷酰胺是一種周期特異性烷化劑，主要作用于細(xì)胞周期的S期，影響DNA合成。其免疫抑制作用強而持久，能抑制體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[9]。本實驗用環(huán)磷酰胺制造免疫抑制大鼠模型，大鼠注射環(huán)磷酰胺后出現(xiàn)體重減輕、尿血、脫毛等免疫抑制癥狀。在本研究中，筆者用補法針刺免疫抑制大鼠足三里穴，結(jié)果顯示：針刺組大鼠體重、脾臟、胸腺指數(shù)及白細(xì)胞計數(shù)與模型組相比顯著增加，電針組大鼠體重、胸腺指數(shù)與模型組相比顯著增加。環(huán)磷酰胺具有骨髓抑制作用，可以導(dǎo)致粒細(xì)胞減少，針刺組與模型組相比大鼠白細(xì)胞計數(shù)顯著增加，而電針組與模型組相比大鼠白細(xì)胞計數(shù)雖然增加，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。胸腺屬于中樞免疫器官，脾臟屬于外周免疫器官，通過對大鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)的檢測，可以考察針刺對免疫抑制大鼠免疫功能的影響。針刺組與模型組相比脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)均顯著增加，而電針組與模型組相比僅胸腺指數(shù)顯著增加。《靈樞經(jīng)》云：“虛實之要，九針最妙，補瀉之時，以針為之”。傳統(tǒng)針灸的補法、次數(shù)與留針時間對疾病的療效具有重要影響。體現(xiàn)在本研究中，對于免疫抑制大鼠模型的治療效果，針刺組要優(yōu)于電針組。

針刺起效的過程可分為局部進針，啟動針刺信息，信息沿復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)途徑傳導(dǎo)，最后在靶器官發(fā)揮針刺效應(yīng)等幾個環(huán)節(jié)。其中進針后啟動針刺信息為重要的始動環(huán)節(jié)。通過穴位進針，捻轉(zhuǎn)補瀉，引起穴位周邊微環(huán)境各種特異性應(yīng)答變化，例如：交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的興奮，各種化學(xué)介質(zhì)的釋放，不同細(xì)胞功能被激活等，最后作用于靶器官，引起靶器官針刺效應(yīng)[10]。CGRP是感覺神經(jīng)主要遞質(zhì)，主要由背神經(jīng)節(jié)合成，某些非神經(jīng)細(xì)胞也可表達，如淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。CGRP具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞功能，它可調(diào)節(jié)離體T淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒作用，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞分泌IL-2和巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 、IL-12、CXC趨化因子KC和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2以及一氧化氮和前列腺素[11-12]。RT-PCR結(jié)果顯示：電針組和針刺組處理后，穴區(qū)CGRPmRNA表達量顯著下降，與模型組比較有顯著性差異；針刺組下降程度顯著高于電針組，兩組比較有顯著性差異，其原因可能為針刺局部的神經(jīng)遞質(zhì)CGRP與機體的皮膚樹突細(xì)胞相互作用，通過分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子，影響了T細(xì)胞的分化和功能，參與了機體的免疫過程。本研究使中醫(yī)傳統(tǒng)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合，豐富了神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫的研究內(nèi)容，促進了針灸免疫學(xué)這一邊緣學(xué)科的發(fā)展，而CGRP對皮膚樹突細(xì)胞分化的影響及對機體T細(xì)胞應(yīng)答方向的調(diào)控，將是今后研究的重點。

[1] 郭孟瑋,趙雅芳,王順.電針“百會”“足三里”穴對IBS模型大鼠行為及丘腦中CGRP mRNA表達的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2017,33(1):31-33.

[2] Liu C, Zhou ZG,Li B,et al.Overview of researches on central action mechanism of needling Zusanli(ST 36)[J].Journal of Acupuncture and Tuina Science,2017,15(3):191-198.

[3] 李嫻,覃永貞,趙彩嬌.針灸足三里穴延緩衰老的實驗研究[J].中國民族民間醫(yī)藥,2014,12(6):16,21.

[4] 陳文婷,傅國強,沈衛(wèi)東.電針足三里對胃黏膜保護機制的研究進展[J].遼寧中醫(yī)雜志,2015,42(3):658-661.

[5] 劉良.針灸對細(xì)胞免疫功能的影響[J].陜西中醫(yī),1984,5(1):40-41.

[6] 張毅民.降鈣素基因相關(guān)肽合成與釋放調(diào)節(jié)[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志,2010,30(2)：153-157.

[7] 秦蔚,顧炳全.針刺慢性萎縮性胃炎患者足三里穴后血漿ET、NO、CGRP和EGF水平的檢測[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2015,36(17):2512-2513.

[8] 王麗,井明,鑫建梅.捻轉(zhuǎn)補瀉手法對應(yīng)激性高血壓大鼠CGRP、NO含量的影響[J].中國針灸,2011,31(4):337-341.

[9] 張俊,Yong-Seong Shin,胡安君,等.環(huán)磷酰胺致大鼠免疫抑制和免疫亢進模型的建立與評價[J].中國實驗動物學(xué)報,2015,23(4):395-400.

[10] 潘麗佳,趙雪,郭義.CGRP與針刺效應(yīng)相關(guān)性的研究進展[J].上海針灸雜志,2016,35(1):117-120.

[11] Raes G,De Baetselier P,Van Ginderachter JA.Clinical and fundamental aspects of monocyte, macrophage and dendritic cell plasticity[J].Eur J Immunol,2012,42(1):13-16.

[12] 陳慧誠,李健峰.降鈣素基因相關(guān)肽及其在免疫系統(tǒng)的功能[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2006,27(6):50-52.