養(yǎng)殖水體三種大型爆發(fā)性海洋藻類孢子/配子實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用初探?

繆 棟， 蘇 蕾， 張倩倩??， 包衛(wèi)洋， 龔 駿

(1. 揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2. 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東 煙臺(tái) 264003)

“青苔”是對(duì)養(yǎng)殖水體中易爆發(fā)的藻類生物的俗稱，如絲狀藻類、水綿、轉(zhuǎn)板藻、石莼等，包含綠藻門，藍(lán)藻門，褐藻門中的多種原核和真核藻類。近年來(lái)，海參池塘養(yǎng)殖過(guò)程中大型青苔藻類爆發(fā)有增加的趨勢(shì)，已經(jīng)嚴(yán)重危害到養(yǎng)殖生物的安全，給海參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。海參養(yǎng)殖環(huán)境中大型藻類爆發(fā)的危害體現(xiàn)在如下幾個(gè)方面：與有益微藻(硅藻等)競(jìng)爭(zhēng)光、營(yíng)養(yǎng)鹽等限制性資源，導(dǎo)致餌料生物生長(zhǎng)緩慢乃至缺乏，限制海參的生長(zhǎng)；藻類爆發(fā)可能伴隨毒素的分泌，對(duì)養(yǎng)殖生物和其他水生生物造成生理脅迫和化學(xué)毒害，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致生物大量死亡[2]；青苔的絲狀結(jié)構(gòu)會(huì)使海參困在其中，影響海參的運(yùn)動(dòng)和攝食；另外，藻類死后沉積在池底，在微生物作用下分解并消耗大量溶解氧，引起缺氧和底質(zhì)腐敗，并導(dǎo)致海參缺氧死亡[3-4]。在養(yǎng)殖過(guò)程中，當(dāng)藻類已經(jīng)長(zhǎng)成肉眼可見的青苔時(shí)，會(huì)進(jìn)行人工撈除或除草劑清除，但由于藻類絲狀體生長(zhǎng)迅速，在這些階段人工干預(yù)或清除，效果均不盡理想。若能在青苔大量形成以前檢測(cè)有關(guān)指標(biāo)并預(yù)警，則可能大大降低后期控制的難度，從而減輕青苔爆發(fā)的危害。

綠藻門的石莼屬(Ulva)和褐藻門的萱藻屬(Scytosiphon)是海參養(yǎng)殖過(guò)程中常見的青苔藻類。石莼是發(fā)生綠潮的典型藻類[5]，一般在春季繁殖，生活史中存在單性生殖、無(wú)性生殖和有性生殖[6]；萱藻(Scytosiphonlomentaria)一般在冬、春季繁殖，存在有性生殖和無(wú)性生殖共存的現(xiàn)象[7-8]。2種大型藻類生活史中均產(chǎn)生單細(xì)胞的游動(dòng)配子體和孢子體。青苔藻類生殖細(xì)胞的數(shù)量可能與后期形成的營(yíng)養(yǎng)體數(shù)量直接相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)鹽豐富時(shí)，石莼可釋放具有高耐受性、能快速附著的生殖細(xì)胞(孢子或配子)，對(duì)其形成綠潮起到關(guān)鍵作用[9]。對(duì)于上述青苔藻類，若能在成體形成前對(duì)藻類生殖細(xì)胞的數(shù)量和動(dòng)態(tài)進(jìn)行監(jiān)控，將有助于青苔爆發(fā)的早期預(yù)警。然而，因孢子體和配子體等生殖細(xì)胞個(gè)體較小(<10 μm)， 在光鏡下不易與其他單細(xì)胞原生生物(如自養(yǎng)型及混合營(yíng)養(yǎng)型鞭毛蟲)相區(qū)別，僅通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察難以確定其種類或生物量，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)自然水體中這類生殖細(xì)胞的數(shù)量檢測(cè)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

使用分子生物學(xué)方法，例如實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)，通過(guò)特異性引物對(duì)單細(xì)胞微生物的基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量，在一定程度上回避了形態(tài)學(xué)研究中微型生物難以鑒定和定量的難題[10]。利用qPCR技術(shù)開展對(duì)甲藻(Pyrrophyta)等單細(xì)胞赤潮藻的生物量檢測(cè)，顯示出高的特異性和敏感度[11-12]。何閃英等[11]利用18S rDNA特異性引物和Taqman探針，對(duì)紅色裸甲藻(Gymnodiniumsanguineum)進(jìn)行了物種鑒定，并構(gòu)建了qPCR檢測(cè)方法；其研究發(fā)現(xiàn)，qPCR方法的檢測(cè)下限遠(yuǎn)低于赤潮爆發(fā)時(shí)的藻密度，可對(duì)赤潮爆發(fā)進(jìn)行預(yù)警。然而，利用qPCR技術(shù)對(duì)大型藻類生殖細(xì)胞的檢測(cè)，已開展的應(yīng)用性研究還較少，缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)探討。

核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1-5.8S rDNA-ITS2，簡(jiǎn)稱ITS)，是分子生態(tài)學(xué)常用的分子標(biāo)記之一，具有豐富的基因變異信息，適用于類群特異性檢測(cè)和qPCR實(shí)驗(yàn)[13-14]。ITS的適用性已在甲藻(Pyrrophyta)和藍(lán)藻(Cyanophyta)等微型藻類的qPCR檢測(cè)中得以印證[15-16]。在石莼屬中，ITS作為分子標(biāo)記用于區(qū)分腸滸苔(Enteromorphaintestinalis)和扁滸苔(Enteromorphacompressa)的多個(gè)地理種群[17]，體現(xiàn)出種群特異性。對(duì)于石莼和萱藻兩類大型藻，目前可用的分子標(biāo)記僅涉及核糖體小亞基基因(18S rDNA)[18]，可用的ITS引物較少。

針對(duì)以上問(wèn)題，本工作對(duì)山東省煙臺(tái)市海參養(yǎng)殖池塘中常見的青苔藻(2種石莼和一種萱藻)進(jìn)行了采集，并在青苔爆發(fā)期間對(duì)海參養(yǎng)殖水體進(jìn)行了周年取樣，以獲取青苔孢子體和配子體。通過(guò)擴(kuò)增藻類的18S rDNA和ITS獲得藻體序列，對(duì)3種藻類分別設(shè)計(jì)了以ITS為靶區(qū)域的類群/物種特異性引物；建立了qPCR檢測(cè)方法，以期對(duì)養(yǎng)殖水體中非青苔爆發(fā)期藻類的孢子和配子體進(jìn)行定量檢測(cè)。另外，在本研究中，以萱藻為例定量描述了其孢子體/配子體在6個(gè)不同季度水體樣品中的相對(duì)數(shù)量，探索利用此方法對(duì)青苔爆發(fā)進(jìn)行早期預(yù)警的適用性。

1 材料與方法

1.1 藻類采集和樣品來(lái)源

本研究所用的藻類(石莼、萱藻及其他對(duì)照種類)均采自山東省煙臺(tái)市云溪村東方海洋海參養(yǎng)殖基地(37°26′44″N, 121°32′4″E)。在2014年12月—2016年3月間每3個(gè)月采集養(yǎng)殖水體水樣1次(共6次)用于分析孢子體/配子體。每次在養(yǎng)殖池不同位置設(shè)置2個(gè)采樣點(diǎn)(相隔約30 m)作為生物學(xué)重復(fù)，采集表層水樣。每份水樣約300 mL，經(jīng)200 μm孔徑的篩絹預(yù)過(guò)濾后，緩慢抽濾到0.22 μm孔徑的醋酸纖維素膜上(直徑47 mm；Millipore，美國(guó))，進(jìn)行包含孢子體/配子體在內(nèi)的微型生物富集，膜樣于-80 ℃超低溫保存，用于DNA提取。藻類絲狀體采集于2015年3月，處于青苔爆發(fā)期(優(yōu)勢(shì)種類為萱藻)。

1.2 DNA提取和核糖體基因測(cè)序

藻類絲狀體樣品經(jīng)去離子水沖洗10 min，去掉表面附著物，轉(zhuǎn)移至乘有300 mL 95%乙醇的燒杯中，玻璃棒輕微攪拌30 s；后移至300 mL 0.05%次氯酸鈉中，靜置漂洗2 min；再轉(zhuǎn)移至 300 mL 70%的乙醇中，靜置漂洗2 min；最后用滅菌超純水沖洗若干次。清洗干凈的藻類加入液氮研磨，稱取0.5 g研磨產(chǎn)物用于DNA提取。DNA提取采用植物DNA提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit，Tiangen，北京)，提取步驟參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。富集有微型生物樣品的膜樣使用FastDNA?土壤提取試劑盒(Mpbio，美國(guó))進(jìn)行總DNA提取，兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)的DNA樣品分開處理。

使用真核生物通用引物EukA(5’-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3’)和EukB (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對(duì)3種藻類絲狀體的核糖體小亞基基因(18S rDNA)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增使用Fermentas DreamtaqTMDNA 合成酶試劑盒(Thermo Scientific，美國(guó))，25 μL體系含有10×緩沖液(Mg2+)2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，Dream taq酶(500 U)0.2 μL，滅菌超純水19.8 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。使用ITS通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對(duì)藻類絲狀體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1-5.8S-ITS2)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系同上，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，使用TIANprep Midi 凝膠回收試劑盒(Tiangen，北京)進(jìn)行回收。回收產(chǎn)物經(jīng)InsTAclone PCR 克隆試劑盒(Thermo，Winmington，DE，美國(guó))載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5а感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白斑菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆送至上海生工公司進(jìn)行雙端測(cè)序(上海生工科技有限公司，中國(guó))。

1.3 引物設(shè)計(jì)

使用1.2中測(cè)得3種藻類18S rDNA和ITS序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中分別選取序列相似性高于90%的同屬或同科物種構(gòu)建數(shù)據(jù)集，查找涵蓋ITS部分或全長(zhǎng)的類群/物種特異性引物。在18S區(qū)域，所用數(shù)據(jù)集包含石莼屬新測(cè)序列7條，參考序列47條，涵蓋石莼屬11個(gè)物種和石莼科9個(gè)屬；萱藻數(shù)據(jù)集包含新測(cè)序列1條，萱藻屬和相近屬參考序列49條。在ITS區(qū)域，石莼數(shù)據(jù)集包含新測(cè)序列8條，參考序列49條，涵蓋物種Ulvascandinavica，U.armoricana，U.laetevirens，U.fenestrate，U.rigida，U.linza，U.prolifera，Enteromorphaahlneriana等40個(gè)石莼屬的物種/種群，以及7個(gè)Ulvella屬種類；萱藻數(shù)據(jù)集包含新測(cè)序列3條，參考序列34條，涵蓋Scytosiphonlomentaria的多個(gè)種群，S.canaliculatus、S.fascia、S.Petalonia、S.Colpomenia等種屬。數(shù)據(jù)集序列使用在線工具M(jìn)AFFT(http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)排列后，在18S rDNA右端和ITS區(qū)域查找目標(biāo)物種/類群特異于其他物種的位點(diǎn)，選取的引物序列包含多個(gè)特異性位點(diǎn)或以特異性位點(diǎn)為3’端。使用Intergrated DNA Technologies(http://sg.idtdna.com/site)網(wǎng)站對(duì)所選特異性引物的GC含量，Tm值，引物二聚體形成，發(fā)卡結(jié)構(gòu)產(chǎn)生等參數(shù)進(jìn)行在線評(píng)估，篩選高質(zhì)量引物對(duì)。

1.4 引物特異性檢驗(yàn)

利用NCBI的BLASTn功能和Primer-BLAST在線軟件對(duì)引物特異性進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)室條件下，以5種對(duì)照藻類(Ulvacf.linza、Ulvasp.、Scytosiphonlomentaria、U. cf.comperssa、U. cf.flexuosa)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)引物特異性。藻類PCR體系同文中1.2所述，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。利用環(huán)境水樣DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證引物特異性和適用性，所用PCR體系和反應(yīng)條件同上。藻類和環(huán)境水樣DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，克隆測(cè)序以確定產(chǎn)物的專一性，克隆測(cè)序方法同本文1.2所述。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)實(shí)驗(yàn)

利用上文所得ITS引物，分別進(jìn)行藻類和環(huán)境樣品DNA的qPCR實(shí)驗(yàn)，所用儀器為ABI 7500fast qPCR儀器(Applied BiosystemsTM，美國(guó))。擴(kuò)增體系采用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ體系(TaKaRa，日本)，20 μL反應(yīng)體系中含有2×SYBR Green ⅡMix溶液10 μL，DyeⅡ、前后引物(10 μmol/L)各0.4 μL，滅菌超純水7.8 μL，模板DNA 1 μL。所用程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃變性30 s，56 ℃/58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；程序在72 ℃時(shí)采集信號(hào)。

以1.4中藻類常規(guī)PCR所得陽(yáng)性克隆菌液為模板構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用通用引物M13F和M13R進(jìn)行質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，純化獲得含有藻類ITS片段的質(zhì)粒DNA。將質(zhì)粒DNA按1∶103～1∶108倍比稀釋為7個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)置3次重復(fù)，分別進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，得出臨界循環(huán)值(CT)。使用Nanodrop(Quawell，美國(guó))測(cè)量不同稀釋倍數(shù)下質(zhì)粒的DNA濃度，分別計(jì)算得出1 μL質(zhì)粒模板中含有的 ITS拷貝數(shù)，計(jì)算公式為：

copies(/μL)=(6.02×1023×(DNA濃度(ng/μL)×10-9))/(DNA長(zhǎng)度×660)[10]。

(1)

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線以質(zhì)粒DNA中ITS拷貝數(shù)(log10)為橫坐標(biāo)，CT值(3個(gè)重復(fù)值的平均數(shù))為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪制。后續(xù)qPCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增效率根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(k)計(jì)算，計(jì)算公式為：

E=(10-1/k-1)×100%[10]。

(2)

qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藻類和環(huán)境樣品DNA中的ITS拷貝數(shù)。將藻類DNA按1∶10～1∶108倍比稀釋，環(huán)境水樣DNA采用原始濃度，每個(gè)稀釋度或樣品設(shè)置三次重復(fù)，取1 μL DNA溶液為模板進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，獲取模板對(duì)應(yīng)的CT值。參照質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)CT值估算模板中所含ITS拷貝數(shù)。藻類DNA以梯度稀釋倍數(shù)(log10)為橫坐標(biāo)，ITS拷貝數(shù)(log10)為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖。養(yǎng)殖水樣DNA以時(shí)間跨度為橫坐標(biāo)，ITS拷貝數(shù)為縱坐標(biāo)繪制柱狀圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 藻類形態(tài)特征和核糖體基因序列

3種藻類的絲狀體形態(tài)，表層細(xì)胞結(jié)構(gòu)如圖1所示。藻1黃綠色至深綠色，帶狀，主支明顯，無(wú)分支(見圖1A)，表層細(xì)胞四角形至六角形，直徑約8～20 μm(見圖1C)，類似《中國(guó)海藻志》中緣管石莼特征(Ulvacf.linza，又名緣管滸苔Enteromorphalinza)[19]；藻2鮮綠色，薄葉狀，葉片形狀不規(guī)則，有波皺(見圖1D)，細(xì)胞呈多邊形，直徑約12～25 μm(見圖1F)，僅能確認(rèn)為石莼屬[19]，未能鑒定到種(Ulvasp.)；藻3褐色至深褐色，直徑1～2 mm，藻體呈圓柱形，多室配子囊位于葉狀體表面或分散各處(見圖1H)，表面細(xì)胞多邊形，含有色素體，直徑約12～20 μm(見圖1I)，依《中國(guó)黃渤海海藻》，吻合萱藻(Scytosiphonlomentaria)特征[20]。

提取的絲狀體藻類基因組DNA濃度，藻1為16.6 ng/μL，藻2為6.3 ng/μL，藻3為16 ng/μL。共獲得藻1、藻2、藻3的18S rDNA克隆序列分別有2、4、1條；獲得藻1、藻2、藻3的ITS序列分別有1、7、3條。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果顯示，藻1中18S rDNA和ITS序列與緣管石莼(U.linza)和滸苔(U.prolifera)的相似度均為99%；藻2 序列與多個(gè)石莼物種相似度達(dá)99%；藻3序列與萱藻相似度為99%～100%。所測(cè)藻類18S rDNA和ITS基因序列已提交GenBank，序列號(hào)為KY446810-KY446828。

圖1 3種藻類的絲狀體形態(tài)、表層細(xì)胞結(jié)構(gòu)(A～C，緣管石莼類似種；D～F，石莼未定種；G～I(xiàn)，萱藻 )Fig.1 The blades and cells in surface view of three algal species(A～C, Ulva cf. linza; D～F, Ulva sp.; G～I(xiàn), Scytosiphon lomentaria)

2.2 引物設(shè)計(jì)及其特異性檢測(cè)

在ITS1和ITS2區(qū)域，3種藻類各獲得1對(duì)類群/種類特異性引物，分別為Ul_linF171/Ul_linR496(緣管石莼類似種)；Ul_rigF79/Ul_rigR543(石莼未定種)；Scy_lomF269/Scy_lomR818(萱藻)。引物所在位置和目標(biāo)片段長(zhǎng)度如圖2所示。引物長(zhǎng)度、GC含量以及適用退火溫度(Tm)見表1。

圖2 3種藻類ITS區(qū)域特異性引物示意圖Fig.2 Schematic diagram of the specific primers designed for amplifying the ITS rDNA regions of three algal species

BLASTn和Primer-BlAST在線檢驗(yàn)引物特異性，結(jié)果顯示：在允許0～3個(gè)位點(diǎn)錯(cuò)配時(shí)，引物Ul_linF171/Ul_linR496僅能匹配到Ulvalinza和U.prolifera兩物種，具有種類特異性；引物對(duì)Ul_rigF79/Ul_rigR543僅能匹配到U.armoricana、U.sandinavica、U.rigida、U.laetevirens、U.fenestrate、U.lactuca6個(gè)物種，具有類群特異性；引物對(duì)Scy_lomF269/Scy_lomR818僅能匹配本研究的萱藻(S.lomentaria)種群序列和NCBI庫(kù)中萱藻物種的部分種群，具有種群特異性。

利用藻類DNA樣品進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，所得瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，3對(duì)引物擴(kuò)增藻類本身均可獲得單一高亮條帶，對(duì)照藻類均無(wú)條帶(見表2)。所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，分別獲得克隆序列緣管滸苔類似種8條，石莼未定種4條，萱藻4條。該部分序列結(jié)合2.1中所得藻類ITS序列，進(jìn)行種群內(nèi)ITS序列差異分析，發(fā)現(xiàn)種群內(nèi)ITS序列相似度在緣管滸苔類似種為98.8%(4個(gè)位點(diǎn)突變)，石莼未定種為98.67%(6個(gè)位點(diǎn)突變)，萱藻為100%，ITS序列在3種藻類中種群內(nèi)較保守，可用作類群/物種分子標(biāo)記。

表1 擴(kuò)增三種藻類ITS rDNA區(qū)域的特異性PCR引物參數(shù)

對(duì)原位養(yǎng)殖水體6個(gè)季度的樣品DNA檢測(cè)結(jié)果顯示，兩對(duì)石莼引物，Ul_linF171/Ul_linR496和Ul_rigF79/Ul_rigR543，對(duì)水樣DNA無(wú)擴(kuò)增結(jié)果；萱藻引物Scy_lomF269/Scy_lomR818可獲得單一條帶，且目標(biāo)片段長(zhǎng)度吻合。該條帶進(jìn)行切膠測(cè)序，所得2條序列與2.1中萱藻ITS序列相似度為99.8%(1個(gè)位點(diǎn)突變)，支持?jǐn)U增片段來(lái)自所研究萱藻種群的孢子或配子體。

表2 特異性引物擴(kuò)增藻類和原位水樣DNA結(jié)果Table 2 Results of primers sets evaluated by PCR on the genomic DNA of algae and environmental water samples

注:“+”和“—”表示引物對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果：“+”表示有單一條帶，“—”表示無(wú)條帶；*原位水樣來(lái)自2014年12月—2016年3月間6次采樣，“++”“--”是指每個(gè)檢查兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)?！?” and “—” indicate the result of primers targeted DNA,“+”indicates positive and presenting single band, “—”indicates negative；water samples were collected from December 2014 to March 2016*，“++” and“--” indicate each sample has two biological replications.

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

使用質(zhì)粒DNA所含ITS拷貝數(shù)的log10對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，臨界循環(huán)值CT為縱坐標(biāo)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3 A，C，E所示。其中，緣管石莼類似種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-3.3975x+ 37.127，回歸系數(shù)R2=0.997 8(見圖3A)，擴(kuò)增效率為96.9%；石莼未定種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-3.4787x+ 37.503，回歸系數(shù)R2= 0.996 1(見圖3C)，擴(kuò)增效率為93.8%；萱藻質(zhì)粒樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-3.430 1x+ 36.74，回歸系數(shù)R2= 0.998 8(見圖3E)，擴(kuò)增效率為95.7%。

ITS特異性引物對(duì)藻類DNA的qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，3種藻類熔解曲線均顯示單峰。qPCR檢出ITS拷貝數(shù)(log10值，y)與藻類DNA稀釋倍數(shù)(x)的相關(guān)性見圖3B、D、E所示。在1∶10～1∶105(石莼未定種1∶10～1∶106)的稀釋倍數(shù)下，3種藻類檢出ITS拷貝數(shù)(log10值)與稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系，且相關(guān)性較高(R2> 0.99)，表明qPCR檢出的ITS拷貝數(shù)可準(zhǔn)確反映樣品中的藻類DNA含量。在稀釋倍數(shù)高于105(石莼未定種106)時(shí)，藻類ITS拷貝數(shù)檢出值不隨稀釋倍數(shù)發(fā)生降低，該節(jié)點(diǎn)DNA濃度視為qPCR方法可檢出的藻類DNA的最低濃度，緣管石莼類似種和萱藻分別為1.66×10-4ng/μL，對(duì)應(yīng)200和400個(gè)ITS基因拷貝數(shù)；石莼未定種為6.6×10-6ng/μL，對(duì)應(yīng)200個(gè)ITS基因拷貝數(shù)。

(A，B.緣管石莼類似種；C，D.石莼未定種；E，F(xiàn) 萱藻。A, B. Ulva cf. linza; C, D. Ulva sp.; E, F. Scytosiphon lomentaria.)

以海參養(yǎng)殖池不同時(shí)期的原位水樣DNA為模板，使用萱藻特異性引物進(jìn)行qPCR檢測(cè)，獲得的熔解曲線顯示單峰，表明PCR過(guò)程中無(wú)非特異性擴(kuò)增。根據(jù)萱藻質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品DNA所含孢子/配子體ITS拷貝數(shù)，以ITS拷貝數(shù)為指標(biāo)對(duì)不同時(shí)期水樣中萱藻DNA含量進(jìn)行比較(見圖4)。結(jié)果顯示，2014年12月份水樣中萱藻孢子/配子體ITS拷貝數(shù)約為1.0×107拷貝/mL，2015年3月份達(dá)到最高，約2.5×107拷貝/mL；自2015年6月起萱藻孢子/配子體ITS拷貝數(shù)降低至5.0×106拷貝/mL，此后均低于4.0×106拷貝/mL(見圖4)。比較可得，萱藻爆發(fā)月份(2015年3月)前一時(shí)期(2014年12月)水體中藻類孢子/配子量高于其他非爆發(fā)月份；2016年3月份未發(fā)生萱藻爆發(fā)，當(dāng)月及其前期(2015年12月份)孢子量均處于較低水平。

3 討論

針對(duì)海參養(yǎng)殖池塘的大型藻類(青苔)災(zāi)害爆發(fā)，目前常用的防治辦法有人工撈除，加入除草劑清除等，耗費(fèi)大量人工和物力財(cái)力。然而藻類一旦爆發(fā)，人工撈除后會(huì)伴隨殘余藻類組織或絲狀體的再次大量增殖，效果并不明顯。除草劑的加入對(duì)于水體中的有益藻類、養(yǎng)殖生物(如海參)都會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的刺激作用，破壞水體的生態(tài)平衡。治理青苔時(shí)機(jī)選擇宜早不宜晚，使用分子生物學(xué)方法在爆發(fā)前期和非爆發(fā)期對(duì)大型藻類孢子數(shù)量進(jìn)行監(jiān)控和預(yù)測(cè)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?；诨?qū)用娴臋z測(cè)方法在大型危害藻類孢子和配子檢測(cè)中的應(yīng)用還有限，不過(guò)它在部分微型浮游藻類的研究中已經(jīng)展示出巨大的應(yīng)用潛力[11-12, 21-22]，是未來(lái)環(huán)境檢測(cè)使用的重要技術(shù)手段之一。本工作初步嘗試?yán)胵PCR技術(shù)，結(jié)合特異性引物對(duì)海參養(yǎng)殖水體的藻類孢子/配子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，顯示了一定的可行性和靈敏度。

(黑色和灰色表示每個(gè)月份兩組生物學(xué)重復(fù)。The black and grey columns indicate the two duplicates in a sampling period.)

圖4 表層水樣中不同時(shí)期萱藻孢子/配子體ITS拷貝數(shù)
Fig.4 The temporal variations in ITS abundance ofScytosiphonlomentariaspores in surface water samples

核糖體DNA(rDNA)是真核生物研究中最常用的分子標(biāo)記之一[13]。相對(duì)于18S rDNA的高度保守性，轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)具有較高的進(jìn)化速率，適用于區(qū)分低階元如屬級(jí)以下的物種或類群[15-17]。Blomster等[17]曾使用ITS特異性引物和探針對(duì)腸滸苔和扁滸苔兩個(gè)形態(tài)相似種進(jìn)行區(qū)分，并獲得了較好的效果。本工作針對(duì)ITS區(qū)域設(shè)計(jì)的萱藻特異性引物顯示出較高的物種(種群)特異性，在后續(xù)研究中也可應(yīng)用于萱藻的物種(種群)鑒定，與同屬的形態(tài)相似物種進(jìn)行區(qū)分。緣管石莼類似種的ITS引物除Ulvalinza外，還匹配NCBI庫(kù)中多條注釋為Ulvaprolifera的序列，原因?yàn)閁lvaprolifera序列與緣管石莼在ITS區(qū)具有一致的特異性位點(diǎn)，共同區(qū)別于其他藻類，但二者無(wú)法通過(guò)特定的特異性位點(diǎn)區(qū)分。因缺乏準(zhǔn)確形態(tài)鑒定的Ulvaprolifera材料，該引物對(duì)Ulvaprolifera的實(shí)際擴(kuò)增效果還有待檢測(cè)。在后續(xù)研究中采用ITS分子標(biāo)記對(duì)Ulvalinza和Ulvaprolifera進(jìn)行區(qū)分，需結(jié)合藻類特異性蛋白基因等標(biāo)記，使用雙重或多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)[23]。

qPCR方法對(duì)基因的最低檢出量，反映其檢出藻類細(xì)胞的靈敏程度，該檢出量與基因在細(xì)胞基因組/轉(zhuǎn)錄組中的含量，引物結(jié)合模板的難易程度等有關(guān)。何閃英等[11]使用18S rDNA 引物檢測(cè)紅色裸甲藻，最低檢出量為130個(gè)藻細(xì)胞；Touzet等[24]使用ITS物種特異性引物可最低檢測(cè)出1個(gè)亞歷山大藻細(xì)胞(Alexandriumminutum)；而邱圓圓等[25]使用微囊藻素合成酶基因(mcyE)和16S rDNA對(duì)微囊藻的定量研究，最低檢出限為50個(gè)基因拷貝。本工作選擇的ITS靶區(qū)域位于核糖體RNA基因，為真核細(xì)胞中含量最豐富的基因，易于擴(kuò)增和檢出。qPCR方法對(duì)3種藻類的最低檢出量，緣管石莼類似種和萱藻為1.66×10-4ng基因組DNA，分別對(duì)應(yīng)200和400個(gè)ITS拷貝數(shù)；在石莼未定種中為6.6×10-6ng DNA，對(duì)應(yīng)200個(gè)ITS拷貝數(shù)，該結(jié)果與已報(bào)道的微型藻類的最低檢出限具有可比性，呈現(xiàn)出一定的靈敏度。有關(guān)石莼和萱藻單個(gè)孢子體或配子體中所含rDNA拷貝數(shù)的信息還有待研究，用以推斷qPCR方法可最低檢出的孢子或配子體的細(xì)胞數(shù)量。

在對(duì)水體樣品DNA的檢測(cè)中，兩組石莼ITS引物均未獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。所用水體樣品富集了大量尺寸>0.22 μm的微型生物，包括細(xì)菌、原生生物、單胞藻類(硅藻，甲藻等)和其他大型藻類的生殖細(xì)胞，兩組引物未對(duì)其他藻類產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，在一定程度上說(shuō)明兩組引物具有較好的特異性。另一方面，在本研究所值青苔爆發(fā)期間(2015年3月)，優(yōu)勢(shì)藻類為萱藻，石莼種類數(shù)量相對(duì)較少，成體多沉積于水體底層，推斷其游動(dòng)孢子體和配子體多出現(xiàn)在藻類絲狀體或葉狀體附近，因數(shù)量較少，未能到達(dá)采樣水層。

本工作的主要目的是對(duì)ITS特異性引物進(jìn)行設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，對(duì)使用qPCR方法檢測(cè)大型藻類孢子和配子體的可行性進(jìn)行探討，故在實(shí)際樣品檢測(cè)方面僅做了初步嘗試。然而，所得養(yǎng)殖水樣的檢測(cè)結(jié)果給出了一些啟示：首先，非青苔爆發(fā)期萱藻孢子/配子量被檢出，且低于爆發(fā)期(見圖4)，表明qPCR方法的靈敏程度滿足對(duì)非爆發(fā)期萱藻孢子量的檢測(cè)；其次，不同月份萱藻游動(dòng)孢子/配子量的變化規(guī)律與養(yǎng)殖水體的萱藻爆發(fā)規(guī)律吻合(見結(jié)果2.3)，萱藻爆發(fā)前期伴隨水體中孢子量的增高，初步表現(xiàn)出對(duì)藻類爆發(fā)的預(yù)測(cè)作用。本工作得出的萱藻爆發(fā)規(guī)律仍需更詳盡的周年采樣和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行驗(yàn)證，需要綜合考慮多種因素對(duì)大型藻類爆發(fā)規(guī)律的影響，如養(yǎng)殖活動(dòng)，季節(jié)變化引起的水體溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽、微生物群落的波動(dòng)等。

4 結(jié)語(yǔ)

本工作針對(duì)海參養(yǎng)殖水體中常見的三種大型青苔藻，以高分辨率的ITS區(qū)為目標(biāo)設(shè)計(jì)類群/物種特異性引物，并測(cè)試了其在qPCR實(shí)驗(yàn)中的適用性，以期對(duì)水體中藻類的孢子量/配子量進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中分別測(cè)試了qPCR方法對(duì)3種藻類的最低檢出量，并初步嘗試監(jiān)測(cè)海參養(yǎng)殖水體中萱藻孢子量的變化規(guī)律，表現(xiàn)出一定的可行性和靈敏度。未來(lái)對(duì)養(yǎng)殖水體青苔藻類孢子的數(shù)量檢測(cè)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)研究，需測(cè)試最適采樣水層和樣品采集量，并綜合多種因素設(shè)計(jì)采樣計(jì)劃。青苔藻類爆發(fā)前期的孢子數(shù)量需要統(tǒng)計(jì)，以作為監(jiān)控和預(yù)警的標(biāo)準(zhǔn)。在檢測(cè)到孢子體數(shù)量超出標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需及時(shí)采取措施對(duì)來(lái)年的青苔爆發(fā)進(jìn)行預(yù)防，如適時(shí)安排水體循環(huán)、減少營(yíng)養(yǎng)鹽的攝入，增加有益藻類細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)等生物、物理、化學(xué)手段。

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