弧菌科分類學(xué)研究進(jìn)展?

張曉華， 林禾雨， 孫 浩

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003)

弧菌科(Vibrionaceae)隸屬于細(xì)菌域變形菌門γ-變形菌綱弧菌目，由Véron[1]在1965年首次提出。弧菌科是弧菌目中唯一的科，目前其包括以弧菌屬(Vibrio)為代表的8個(gè)屬，共計(jì)159個(gè)種，主要分布在海洋環(huán)境中，某些種類是水產(chǎn)動(dòng)物與人類重要的病原菌，具有潛在的環(huán)境效應(yīng)[2]。

弧菌科成員是一類遺傳與代謝多樣性很高的異養(yǎng)細(xì)菌。其生活方式包含自由生活與附著生活[3]；其分布區(qū)域涵蓋了邊緣海與大洋、表層海水與深層海水、熱液口與冷泉等幾乎所有的海洋環(huán)境[4-5]；在與其它生物的關(guān)系中也扮演了共生菌[6]、病原菌[7]、益生菌[8]等多種角色。另外，弧菌科成員廣泛參與到幾丁質(zhì)[9]、褐藻膠[10]等大分子有機(jī)物降解的過程中，是生物地球化學(xué)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。早期對(duì)弧菌科的研究關(guān)注其致病性[11]，最近弧菌科的物種多樣性與生態(tài)作用，以及測序技術(shù)發(fā)展帶來的弧菌科遺傳學(xué)特征與分子進(jìn)化的研究引起了廣泛的關(guān)注[12]。

弧菌科自確立一來，一直處于細(xì)菌分類學(xué)研究的前端[13-15]。其多樣化的表型特點(diǎn)和較高的16S rRNA基因序列相似性，使得準(zhǔn)確判斷該科成員的分類學(xué)地位十分困難[2]。然而，弧菌科成員的這一特點(diǎn)也恰恰使其成為人們研究分類學(xué)、改進(jìn)分類方法的絕佳模型，而且對(duì)弧菌科的分類研究是了解其諸多生物學(xué)特性的基礎(chǔ)條件。因此，通過回顧弧菌科分類方法在近50年間的進(jìn)展，總結(jié)目前在弧菌科成員分類地位中已取得的成果，進(jìn)而對(duì)弧菌科的分類學(xué)研究提出展望，從而促進(jìn)未來的科研工作者更進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)弧菌科的研究。

1 弧菌科細(xì)菌特征概述

圖1 不同種類弧菌在TCBS培養(yǎng)基上的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of different types of vibrios cultured on TCBS agar medium

由于弧菌科成員的數(shù)目在不斷擴(kuò)增，目前有一些種類可能缺少如上所述的一個(gè)或多個(gè)共同特性，已有多個(gè)能夠產(chǎn)氣、固氮、光合營養(yǎng)或者不具有運(yùn)動(dòng)性的種類作為特例被報(bào)道[17]?；【萍?xì)菌主要廣泛分布在海洋與河口環(huán)境中，在淡水環(huán)境中偶爾也有發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常與水生動(dòng)植物相關(guān)。有些種類是人類的病原菌，另外還有一些種類是魚類、貝類、珊瑚等水生生物的病原菌。

2 弧菌科分類學(xué)研究方法的遞進(jìn)

2.1 經(jīng)典分類

直到20世紀(jì)中期，弧菌科細(xì)菌的分類主要是通過“經(jīng)典分類”法，即表型鑒定來完成的，其試圖根據(jù)少數(shù)幾種表型特征(如菌體特征、菌落形態(tài)或生理學(xué)特征等)來對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類[18]。隨著弧菌科成員的不斷增多，僅僅通過有限的表型特征來確定上百個(gè)成員的分類地位顯然已經(jīng)不太可能，而且有時(shí)生物體的表型在其不同的生命時(shí)期或者不同的生活條件下會(huì)表現(xiàn)出相異的特征，這無疑給僅僅基于形態(tài)學(xué)來進(jìn)行分類的手段提出了很多難題。例如，第八版《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中將哈維氏弧菌歸入了“射光桿菌屬(Lucibacterium)”，其分類標(biāo)準(zhǔn)是弧菌屬細(xì)菌具有極生鞭毛，而射光桿菌屬細(xì)菌具有側(cè)生鞭毛(或稱周生鞭毛)。而事實(shí)上，在以后的研究中人們發(fā)現(xiàn)弧菌屬細(xì)菌在液體環(huán)境中生長時(shí)為極生鞭毛，而在固體中時(shí)基本都能夠形成側(cè)生鞭毛，因而在1980年又將射光桿菌屬歸并到弧菌屬中[19]。另外，弧菌科細(xì)菌的成員在不斷擴(kuò)充，事實(shí)上人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了該科許多細(xì)菌根本不具有其原來被認(rèn)為應(yīng)該具有的特征。如王燕等[20]報(bào)道的非典型弧菌(V.atypicus)呈過氧化氫酶陰性，并不符合以前我們對(duì)于弧菌屬細(xì)菌的認(rèn)識(shí)。因此，僅僅基于表型的細(xì)菌分類學(xué)在如今已經(jīng)不能滿足確定弧菌科成員分類學(xué)地位的要求。

2.2 多相分類與分子分類

1970年代左右，在弧菌科細(xì)菌中應(yīng)用的DDH(DNA-DNA hybridization，DNA-DNA雜交)[21-22]方法，通過分子操作手段來考察其物種間的DNA組成相似性，從而確定遺傳距離。這種方法規(guī)定，在退火溫度ΔTm低于5 ℃時(shí)DNA間的雜交率大于70%，可作為判斷物種屬于同一種的黃金標(biāo)準(zhǔn)。然而這種方法在實(shí)際操作中卻存在諸多問題，比如確定DNA-DNA雜交率的方法不同會(huì)得到不同的結(jié)果，而且對(duì)于70%這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)有時(shí)也會(huì)根據(jù)情況而改變[23]。

多相分類(Polyphasic taxonomy)方法由Colwell[24]在1970年首次提出并應(yīng)用于弧菌屬中，其宗旨是考察物種的基因型、表型和系統(tǒng)發(fā)育等全部信息來對(duì)物種進(jìn)行分類。后來，隨著1977年Sanger測序技術(shù)的發(fā)明，利用核糖體RNA基因相似性的分類方法逐漸興起，并在弧菌科中得到大量應(yīng)用[25]。DNA測序連同分子指紋圖譜方法的出現(xiàn)又進(jìn)一步補(bǔ)充了當(dāng)時(shí)多相分類學(xué)的不足，在弧菌科細(xì)菌分類中應(yīng)用的分子指紋圖譜方法包括rep-PCR(細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù))[26]、AFLP(Amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)[27]等，這些分子生物學(xué)技術(shù)的加入使得多相分類學(xué)得到了很大的補(bǔ)充，其中16S rRNA基因測序法迄今仍為物種多相分類學(xué)鑒定的重要組成部分[18]。多相分類學(xué)的出現(xiàn)為弧菌科成員分類地位的確立提供了重要手段，糾正了很多以前僅僅利用少數(shù)幾個(gè)表型特征就確立的物種分類地位。例如以前存在于弧菌科中的異單胞菌屬(Allomonas)就是通過多相分類學(xué)的方法被重新判定了分類學(xué)地位[28]。

2.3基因組分類

進(jìn)入21世紀(jì)后，全基因組測序(Whole Genome Sequencing，WGS)的興起將細(xì)菌的分類學(xué)推入全新的時(shí)代。基因組分類法包括MLSA(Multilocus Sequence Analysis，多位點(diǎn)序列分析)、核心基因組樹(超級(jí)樹)、ANI(Average Nucleotide Identity，平均核苷酸一致性)、AAI(Average Amino Acid Identity，平均氨基酸一致性)、基因組特征相異性(genome signature dissimilarity)等類型[14]，這些方法具有信息量大、可重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)。很多研究證明，這些方法在弧菌的分類中具有較高的分辨率，能夠用于精確估計(jì)弧菌科成員的分類地位。尤其是MLSA方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，因?yàn)檫@種方法事實(shí)上并不需要得到完整的細(xì)菌基因組，只需利用一些基因的組合即可得到分辨率高、可信度強(qiáng)的結(jié)果。例如“費(fèi)氏弧菌(V.fischeri)”等幾個(gè)原來弧菌屬種類的分類學(xué)地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系一直存在疑問，2007年Urbanczyk等[29]利用MLSA的方法將包括費(fèi)氏弧菌在內(nèi)的4個(gè)種歸并為弧菌科內(nèi)的新屬另類弧菌屬。再比如，Sawabe等[15]利用8個(gè)管家基因(gapA、gyrB、ftsZ、mreB、pyrH、recA、ropA和ropA)建立了弧菌科中58個(gè)種的高質(zhì)量系統(tǒng)發(fā)育樹，而此種方法也與基于全基因組水平的核心基因組樹具有相似的樹形。多項(xiàng)研究表明，MLSA與核心基因組樹為弧菌科細(xì)菌的分類提供了更好的分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[14, 17]?；诨蚪M分類的方法把弧菌科細(xì)菌中的種定義為：在MLSA和核心基因組的基因序列中享有>95%的DNA一致性、>96%的AAI、≤10的基因組特征相異性和>61%的蛋白組一致性，且同種不同株和同屬不同種的物種會(huì)在MLSA和核心基因組樹中聚為單系群(Monophyletic group)[17]。隨著近年來全基因組測序便利性的增高，傳統(tǒng)的多相分類學(xué)方法必然將會(huì)向基因組分類方法轉(zhuǎn)變[30]。

3 弧菌科細(xì)菌的分類地位與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的發(fā)展

3.1 弧菌科分類地位的歷史變化

弧菌科在1965年被Véron[1]首次提出，其成員的分類地位歷經(jīng)多次調(diào)整，并不斷有新屬被添加進(jìn)該科中?，F(xiàn)存的弧菌屬與發(fā)光桿菌屬存在于最初定義的弧菌科中。首次提出的弧菌科成員中還包括氣單胞菌屬(Aeromonas)和鄰單胞菌屬(Plesiomonas)，這兩個(gè)屬后來被歸并到其它科中[31]。2002年出版的《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中收錄了弧菌科的7個(gè)屬[17]，除了原有的弧菌屬和發(fā)光桿菌屬外，新添加了異單胞菌屬、鏈狀球菌屬(Catenococcus)、腸弧菌屬(Enterovibrio)、利斯頓氏菌屬(Listonella)和鹽弧菌屬(Salinivibrio)。隨后根據(jù)分子生物學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)異單胞菌屬和利斯頓氏菌屬在16S rRNA基因序列、DNA雜交率和表型性狀等特征上與弧菌屬內(nèi)某些種的相似性很高，因此又被重新歸于弧菌屬[28, 32]，而新屬格里蒙氏菌屬[33]和另類弧菌屬[29]則被提議納入弧菌科。最后，2013年又報(bào)道了分離自海膽的新種成為弧菌科的新屬海膽單胞菌屬[34]，該屬至今仍然只包含一個(gè)種。至此，弧菌科形成了目前包括8個(gè)有效屬的狀態(tài)。

弧菌科中新種的發(fā)表近些年呈爆發(fā)趨勢(見圖2)?；仡櫥【菩路N的報(bào)道歷史，第一株發(fā)表的弧菌科成員為霍亂弧菌(V.cholerae)，于1854年由意大利著名科學(xué)家Filippo Pacini在席卷全球的第三次霍亂大流行中從一個(gè)感染霍亂病的病人身上分離得到[35]。雖然局限于當(dāng)時(shí)的條件而僅僅是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了顯微鏡下觀察，但這一發(fā)現(xiàn)為后來霍亂病的防治提供了重要依據(jù)。然而，在其后的近100年中，弧菌科成員的新種鮮有報(bào)道，直到1960年弧菌科中僅有10個(gè)種被報(bào)道。在1970年以后，弧菌科內(nèi)的新種數(shù)開始逐步增加，尤其是在2000年以后，弧菌科的新種報(bào)道出現(xiàn)激增，僅2003年報(bào)道的弧菌新種就達(dá)到14種。近10年來(2006—2016)弧菌科共新增78個(gè)新種，幾乎占目前弧菌科所有種數(shù)目的一半。

圖2 弧菌科細(xì)菌有效種數(shù)隨發(fā)表年代的累積曲線Fig. 2 The cumulative number of valid Vibrionaceae species against the year in which they were proposed

3.2 弧菌科目前最新的分類狀態(tài)

弧菌科屬于γ-變形菌綱，與腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)、氣單胞菌科(Aeromonadaceae)和交替單胞菌科(Alteromonadaceae)在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中緊鄰[36]。根據(jù)最新的LPSN(具有命名地位的原核生物名錄，http://www.bacterio.net)，弧菌科中現(xiàn)共包括有效的8個(gè)屬，共計(jì)159個(gè)種，分別是另類弧菌屬(Aliivibrio，6個(gè)種)、鏈狀球菌屬(Catenococcus，1個(gè)種)、海膽單胞菌屬(Echinimonas，1個(gè)種)、腸弧菌屬(Enterovibrio，5個(gè)種)、格里蒙氏菌屬(Grimontia，3個(gè)種)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium，25個(gè)種)、鹽弧菌屬(Salinivibrio，4個(gè)種)和弧菌屬(Vibrio，114個(gè)種)。其中發(fā)光桿菌屬、鹽弧菌屬和弧菌屬中都有亞種存在(見表1)。

通過對(duì)這些有效的弧菌科成員進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)充分研究，本文列出了其分離地位的拉丁學(xué)名、標(biāo)準(zhǔn)菌株保藏號(hào)、分離地點(diǎn)與時(shí)間、生物體來源、16S rRNA基因登錄號(hào)和新種首次發(fā)表年代等信息，還對(duì)近些年來已發(fā)表但未有中文譯名的新種參照其拉丁學(xué)名語義進(jìn)行了中文翻譯(見表1)。

根據(jù)弧菌科成員的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3)顯示，弧菌屬與另類弧菌屬關(guān)系最為緊密而聚為一簇；鹽弧菌屬、格里蒙氏菌屬、腸弧菌屬聚為一簇，其共同祖先與發(fā)光桿菌屬聚為一簇；海膽單胞菌屬作為以上兩個(gè)大簇的旁系群(Sister group)單獨(dú)存在。值得一提的是，硫循環(huán)鏈狀球菌(C.thiocycli)作為鏈狀球菌屬中的唯一種，其在進(jìn)化樹中的位置處于弧菌屬之中，事實(shí)上在有些報(bào)道中已經(jīng)建議該屬不應(yīng)該與弧菌屬區(qū)分開來[37]。

表1 弧菌科細(xì)菌所有有效種的基本信息Table 1 Basic information of all the valid species of Vibrionaceae

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

Note：*該屬的標(biāo)準(zhǔn)種。*Type species of each genus.

(比例尺代表每位點(diǎn)的替換率為0.5。 Bar 0.5 substitutions per site.)

4 中國的弧菌科分類學(xué)研究

我國對(duì)弧菌科細(xì)菌新種的分類鑒定研究在國際上起步較晚。1980年代由Yang等[38]報(bào)道了中國首個(gè)弧菌科新種——東方弧菌(V.orientalis)。目前由我國學(xué)者參與的在中國及其周邊地區(qū)分離的弧菌科新種有12個(gè)，其中有1個(gè)種屬于發(fā)光桿菌屬(P.aquae)，其它11個(gè)種均屬于弧菌屬(見表1)。自我國分離的弧菌科細(xì)菌來源多種多樣，其中以海水和水產(chǎn)動(dòng)物來源的菌株較多，也有來自于鹽水湖和紅樹林土壤等環(huán)境的菌株。除去新種報(bào)道，我國對(duì)其他弧菌科細(xì)菌的分離鑒定大多來自病人和經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動(dòng)物的病原菌，我國在這一方面的研究起步時(shí)間很早，可查到的記錄最早可追溯到1976年由遼寧省盤錦地區(qū)衛(wèi)生防疫站[39]報(bào)道的一次有69例食物中毒群發(fā)事件的病原菌是副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)；其它還有很多水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的分離鑒定，如王保坤等[40]通過64項(xiàng)形態(tài)和生理生化指標(biāo)鑒定出青島膠南海區(qū)一次花鱸(Lateolabraxjaponicus)幼魚的傳染病主要是由哈維氏弧菌引起；柯韶文[41]對(duì)我國南海西沙海域的珊瑚白化現(xiàn)象進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌(V.alginolytics)的入侵是引起這一現(xiàn)象的病原菌株。

值得一提的是，分離自我國山東省一處苗期對(duì)蝦養(yǎng)殖水體的徐氏弧菌(V.xuii)的命名是為了紀(jì)念我國著名海洋微生物科學(xué)家徐懷恕先生而確立的[42]。另外，本實(shí)驗(yàn)室還于2010年報(bào)道分離自中國對(duì)蝦(PenaeuschinensisO'sbeck)消化道的非典型弧菌(V.atypicus)[20]，于2011年報(bào)道分離自黃海冷水團(tuán)表層海水的黃?；【?V.marisflavi)[43]。

5 總結(jié)與展望

自弧菌科被確立的50余年間，弧菌科細(xì)菌的分類學(xué)研究一直在不斷發(fā)展。從1965開始的經(jīng)典分類法，到1970年以后的多相分類與分子分類法相結(jié)合，再到現(xiàn)在的基因組分類法，弧菌科細(xì)菌一直作為模式物種被最新的分類學(xué)方法所檢驗(yàn)，也見證了整個(gè)細(xì)菌分類學(xué)的發(fā)展歷程。在這幾十年里，細(xì)菌分類學(xué)變得可靠性越來越強(qiáng)、可重復(fù)性越來越高、操作方法越來越簡單便利且易于標(biāo)準(zhǔn)化?；【瞥蓡T的分類學(xué)地位與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系也被一步步更清晰準(zhǔn)確地揭示。然而，弧菌科細(xì)菌種類近些年來爆發(fā)式的增長也必然向分類學(xué)手段提出新的挑戰(zhàn)，而如何利用有限的數(shù)據(jù)資源建立模型，從而準(zhǔn)確評(píng)估其分類地位是解決問題的關(guān)鍵。另外，弧菌科細(xì)菌不僅在海水環(huán)境中無處不在，其某些種類也是人類和多種水產(chǎn)動(dòng)物的致病菌。由弧菌引起的疾病已在我國有非常多的報(bào)道，準(zhǔn)確快速地對(duì)病原體進(jìn)行分類學(xué)地位的鑒定是進(jìn)行疾病防治的首要任務(wù)。MLSA已經(jīng)為我們打開了一扇大門，接下來將對(duì)用于MLSA分析的基因進(jìn)行優(yōu)化，建立MLSA比對(duì)的數(shù)據(jù)庫，從而創(chuàng)建快速進(jìn)行MLSA檢測的方法，將是這一工作的重點(diǎn)。比起國外對(duì)弧菌科細(xì)菌的研究，我國雖早年對(duì)其研究甚少，但近些年來關(guān)于弧菌科細(xì)菌分類鑒定的報(bào)道越來越多，這將有助于我們更加重視弧菌科在生態(tài)學(xué)、致病性和生物多樣性等研究領(lǐng)域中的作用，引導(dǎo)我們開啟對(duì)弧菌科更多方面的科學(xué)研究。

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