留蘭香環(huán)糊精抑菌緩釋功能改性對聚丙烯基薄膜包裝性能及乳化香腸貨架期的影響

賈曉云，張順亮，劉文營，李迎楠，趙 燕，楊 凱，王 樂，李 享，王守偉，成曉瑜*

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068）

隨著生活水平的提升，人們更多地關注食品的安全與新鮮，對食品的貯藏與流通環(huán)節(jié)提出了更高的要求，一種好的包裝方式既要滿足保證食品的營養(yǎng)、品質(zhì)、風味以及安全，又要能延長食品的貨架期[1-5]。

將功能性的天然物質(zhì)添加到高分子聚合物中，是最近研究的熱點[6-9]。緩釋抗菌包裝有著很大優(yōu)勢，可以極大地延長食物的保鮮期，且抗菌效果既具有徹底性還具有長期性，抗菌成分以某種速率緩慢釋放，使得抗菌效果持續(xù)且明顯?？梢酝ㄟ^選用包材物質(zhì)改變添加劑的油溶性和水溶性，從而更適合實際使用。

環(huán)糊精是外親水內(nèi)疏水的立體手性環(huán)狀特殊結構，β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）是7 個葡萄糖單元的環(huán)糊精，與客體分子通常以范德華力或者氫鍵相結合[10]。β-CD具有很好的熱穩(wěn)定性，280 ℃時發(fā)生熱重損失，分子結構被破壞，開始發(fā)生降解，因此適合200 ℃以下的熱加工處理，有利于提高客體分子的利用率[11]。

乳化香腸是經(jīng)過絞肉、斬拌、真空充填、蒸煮等步驟制備而成的方便、快捷且深受消費者喜愛的常見肉制品。與采用中溫技術殺菌制備的中溫肉制品和普通的高溫殺菌產(chǎn)品相比，乳化香腸產(chǎn)品水分活度高，微生物風險高，產(chǎn)品貨架期短，導致產(chǎn)品在流通環(huán)節(jié)極易腐敗變質(zhì)，造成大量經(jīng)濟損失。肉制品腐敗變質(zhì)主要表現(xiàn)為顏色褐變、風味變化、油脂氧化及微生物增長等現(xiàn)象。肉制品的微生物增長首先是在食品表面，然后逐漸深入肉品內(nèi)部，所以采用抗菌活性薄膜可以有效抑制微生物在肉制品表面生長，從而進一步延長產(chǎn)品的貨架期。隨著生鮮電商行業(yè)飛速發(fā)展，研究活性包裝材料，建立生物活性抗菌包裝技術和抑菌物質(zhì)緩釋技術延長產(chǎn)品的貨架期，具有很強的現(xiàn)實意義。

本研究采用β-CD作為包埋介質(zhì)，可以極大地避免在薄膜加工過程中溫度對留蘭香（spearmint，S）提取物有效成分的破壞。采用β-CD包埋留蘭香提取物的同時可以解決留蘭香難溶于水、易揮發(fā)、易氧化的問題，為留蘭香在肉制品包裝領域的應用擴大了范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

留蘭香提取物 美國KEMIN公司；聚丙烯（polypropylene，PP） 中國石油化工集團公司；β-CD、氯化鈉、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、三氯乙酸、冰醋酸、淀粉、碘化鉀、石油醚國藥集團化學試劑有限公司；平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯 北京陸橋技術有限責任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌于中國肉類食品綜合研究中心檢測中心實驗室保藏。

1.2 儀器與設備

AL104電子天平、SG2-FK SevenGo pH測定儀瑞士Mettler-Toledo公司；LCH-18恒溫水槽 日本三洋株式會社；FC-42恒溫鼓風烘箱、F1-45培養(yǎng)箱 日本東洋公司；UV2800可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、DZ-600/2S真空包裝機 山東小康機械有限公司；GI54DWS高壓蒸汽滅菌 致微儀器有限公司；XSS-300轉(zhuǎn)矩流變儀、LSSJ-20雙螺桿擠出機、LSC-120吹膜機 上海科創(chuàng)橡塑機械設備有限公司；Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；WGT-S透光率/霧度測定儀、W303水蒸氣透過率測定儀、GBH電子拉力試驗機 廣州標際包裝設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-CD-留蘭香包合物的制備

將20 g β-CD加600 mL水中置于燒杯中，60 ℃加熱至全溶，冷卻至40 ℃。在磁力攪拌下，用注射器滴加留蘭香提取物溶液（1∶2，m/V）8 mL，40 ℃條件下攪拌3 h，抽濾冷凍干燥，過80 目篩后放在干燥器備用。所得的包合物記為S-β-CD。

1.3.2 功能性緩釋膜的制備

通過擠出吹塑法制備PP、S/PP、S-β-CD/PP 3 種不同的薄膜包裝袋，將S和S-β-CD以質(zhì)量分數(shù)0.5%和1.0%添加到PP母粒中，單螺桿擠出機各區(qū)段溫度分別為121、198、203 ℃，擠出模頭溫度為200 ℃，單螺桿轉(zhuǎn)速為30 r/min。制備得到產(chǎn)品記錄為PP、0.5% S/PP、1.0% S/PP、0.5% S-β-CD/PP、1.0% S-β-CD/PP。對各組功能性緩釋膜的功能性指標進行測定。

1.3.3 樣品處理與分組

制備中溫乳化香腸，加工工藝如下：原料肉→解凍→修整→斬拌→灌制→干燥→蒸煮→冷卻。然后用5 種膜所做包裝袋分別對其進行真空包裝。采用中溫殺菌技術，在100 ℃、0.175 MPa條件下殺菌20 min后成品。25 ℃避光貯存，對貯存過程中樣品進行指標測定。

1.3.4 功能性釋緩膜基本特性指標的測定

1.3.4.1 厚度的測定

根據(jù)GB/T 6672—2001《塑料薄膜與薄片厚度的測定機械測量法》[12]，試樣隨機取5 個點采用薄膜測厚儀測定薄膜厚度，取平均值。

1.3.4.2 拉伸強度和斷裂伸長率的測定

根據(jù)GB/T 1040.1—2006《塑料 拉伸性能的測定 第1部分：總則》[13]，將待測樣品修剪成長100 mm、寬20 mm的樣條，使用電子拉力試驗機進行拉伸性能，初始間距20 mm，拉伸速率為50 mm/min，每個樣品測定5 次。

1.3.4.3 透光率和霧度的測定

依照GB 2410—2008《透明塑料透光率和霧度的測定》[14]，采用透光率/霧度測試儀測定薄膜的透明性，測定5 組平行，取平均值。

1.3.4.4 水蒸氣透過率的測定

采用水蒸氣透過率測定儀測定樣品在相對濕度100%、37 ℃下的水蒸氣透過率，測定3 次取平均值[15]。1.3.4.5 抑菌性能的測定

菌落總數(shù)的測定參考戶帥鋒等[15]的方法，將實驗菌種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌用3 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基在37 ℃下活化24 h，重復2 次。以生理鹽水為稀釋液依次10 倍稀釋，以5.0×105CFU/mL稀釋液為菌懸液。將5 種薄膜各0.4 g浸漬于10 mL營養(yǎng)肉湯中48 h后，接種100 μL菌懸液，37 ℃恒溫振蕩24 h。梯度稀釋至0.5 麥氏濁度標準，各取200 μL于平板計數(shù)瓊脂中培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)48 h，測定菌落總數(shù)。

1.3.5 乳化香腸指標的測定

1.3.5.1 色差的測定

將色差計開機自檢，用白板進行校正。將1.3.3節(jié)中的乳化香腸切片，測量其亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*），每測1 次順時針旋轉(zhuǎn)60°，總共測5 次平行。參考方夢琳[16]的方法，以e值為色澤評判參數(shù)，e值表示在明亮度和黃度的影響下樣品的紅度值，計算如式（2）所示。

1.3.5.2 pH值的測定

參照GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品 pH測定》[17]中的方法測定。將肉樣在無菌條件下用滅菌后的刀剁碎后取10.0 g，加入到90 mL生理鹽水中混勻，浸泡20 min并不時攪拌，然后用pH測定儀測定其pH值。每個樣品重復測3 次，結果以平均值表示。

1.3.5.3 TBA含量的測定

TBA含量的測定參照GB 5009.181—2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》[18]。

1.3.5.4 菌落總數(shù)的測定

菌落總數(shù)參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[19]中的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）進行單因素顯著性分析和Duncan’s多重比較檢驗法進行顯著性分析，采用Origin 8.0軟件制圖。P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同功能性緩釋膜的基本特性

表1 不同功能性釋緩膜的基本特性Table 1 Characteristics of different functional sustained-release films

由表1可知，功能性緩釋膜的厚度依次為：PP＜0.5%S/PP＜0.5% S-β-CD/PP＜1.0% S/PP＜1.0% S-β-CD/PP。包合物添加量為0.5%的樣品厚度均小于添加量1.0%的樣品；這表明，隨著包埋物添加量的增加，功能性緩釋膜的厚度增大。并且相同添加量的樣品，含有β-CD包埋物成分的樣品厚度更大，這可能與環(huán)糊精分子的空間位阻較大有關，從而導致功能性緩釋膜厚度增加。

拉伸強度隨著S和S-β-CD添加物含量的提高，斷裂伸長率和拉伸強度均降低；這是因為添加留蘭香會使得聚丙烯的結晶結構完整性被破壞，分子鏈間距增大，分子間作用力降低，導致力學性能變差。而環(huán)糊精微膠囊可能在功能性緩釋膜里發(fā)生團聚現(xiàn)象，導致應力集中，從而使拉伸強度和斷裂伸長率顯著降低，包埋物添加量越多可能導致添加物在PP中分散性越不均勻。所以綜合上述分析，力學性能的優(yōu)劣為：PP＜0.5% S/PP＜0.5%S-β-CD/PP＜1.0% S/PP＜1.0% S-β-CD/PP。

透光率是透過樣品的光通量與射到試樣上的光通量之比。透光率與功能性緩釋膜的透明性成正比[20]。霧度是偏離入射光2.5°以上的透射光強占總透射光強的百分數(shù)。霧度與功能性緩釋膜的通透性成反比，霧度越大，緩釋膜的光澤和透明度越差。如表1所示，對于相同的包埋物添加組，添加量為0.5%的樣品透光率高于1.0%的樣品，添加量為0.5%的樣品霧度小于1.0%的樣品。這表明，隨著包合物添加量的增加，功能性緩釋膜的顏色加深、透明性變差。對于相同添加量包埋物的樣品（0.5%S/PP和0.5% S-β-CD/PP、1.0% S/PP和1.0% S-β-CD/PP），含有β-CD的樣品透光率更低。此外，透光率還與厚度有關，厚度增加導致透光率降低和霧度增加。因此，功能性緩釋膜的透光率和霧度的變化是添加物質(zhì)和厚度共同作用的結果[20]。

水蒸氣透過率：PP＜0.5% S/PP＜1% S/PP＜0.5% S-β-CD/PP＜1% S-β-CD/PP。PP是非極性大分子，不親水，對水蒸氣的阻隔性最好，所以PP樣品水蒸氣透過率最小。和純PP相比，添加S和S-β-CD后，聚丙烯分子鏈間距離加大，所以導致水蒸氣透過率增大。0.5% S/PP和1.0% S/PP相比，隨著留蘭香添加量的增加，水蒸氣透過率增加，這是因為留蘭香添加量越多，PP分子鏈間距越大導致的。0.5% S/PP和0.5% S-β-CD/PP相比，隨著β-CD包埋物的添加，水蒸氣透過率增大，這是因為β-CD親水，并且β-CD分子空間位阻較大使得分子鏈間距進一步加大導致的。0.5% S-β-CD/PP和1% S-β-CD/PP相比，β-CD添加量越大，水蒸氣透過率越大。

2.2 不同功能性緩釋膜的抑菌活性

圖1 不同功能性緩釋膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig. 1 Antibacterial effect of different functional sustained-release films on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

圖1顯示0.5% S/PP、1.0% S/PP、0.5% S-β-CD/PP、1.0% S-β-CD/PP對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有一定程度的抑制效果。與PP相比，0.5% S/PP、1.0% S/PP、0.5% S-β-CD/PP、1.0% S-β-CD/PP使大腸桿菌下降2.24、2.45、2.62、3.04（lg（CFU/g）），使金黃色葡萄球菌下降1.20、1.45、1.60、1.90（lg（CFU/g））。

結果顯示，0.5% S-β-CD/PP、1.0% S-β-CD/PP相比于0.5% S/PP、1.0% S/PP的抑菌效果好，環(huán)糊精包埋組別的抑菌效果優(yōu)于直接添加留蘭香的組別；這說明環(huán)糊精可以在加工過程中保護留蘭香的有效成分，避免在加工過程中200 ℃的高溫對留蘭香的破壞及有效成分的損失。并且1.0% S/PP的抑菌效果優(yōu)于0.5% S/PP，1.0% S-β-CD/PP的抑菌效果優(yōu)于0.5% S-β-CD/PP；這是因為添加量越大，釋放抑菌成分越多，從而抑菌效果越好。本研究以革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌為代表研究抑菌效果，結果表明，0.5% S/PP、1.0% S/PP、0.5% S-β-CD/PP、1.0% S-β-CD/PP對革蘭氏陰性菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陽性菌；這可能是因為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細胞壁有著明顯的不同，留蘭香中的抑菌有效成分是左旋香芹酮[21]，左旋香芹酮在12.5 μg/mL即可對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌起到良好殺菌效果。而留蘭香通過破壞細菌的細胞壁使得細菌失活，革蘭氏陰性菌細胞壁肽聚糖含量較革蘭氏陽性菌少且細胞壁比革蘭氏陽性菌的薄，所以對革蘭氏陰性菌的抑制效果要明顯優(yōu)于陽性菌，從而導致抑菌效果的不同。

2.3 不同功能性緩釋膜對乳化香腸貯藏過程中色澤的影響

e值是可以客觀表示不同樣品的色澤變化的參數(shù)[22]，是受明亮度（L*）和黃度（b*）影響下的紅度值，可以更直觀地反映色澤的變化。如圖2所示，前期各組香腸e值變化不大，隨著時間的延長，均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。下降速率：PP＞0.5% S/PP＞1.0% S/PP＞0.5%S-β-CD/PP＞1.0% S-β-CD/PP。相對于PP組的色澤，相同的貯存時間，其他組別的色澤e值優(yōu)于PP組；這主要是因為隨著貯存時間延長，乳化香腸中氧合肌紅蛋白與鐵離子結合導致a*值降低，脂肪氧化和蛋白變性導致的b*值上升，從而使得e值下降。

圖2 貯藏時間對不同包裝的乳化香腸e值的影響Fig. 2 Changes in e value of sausage samples packaged with different films during storage

0.5% S/PP、0.5% S-β-CD/PP、1.0% S/PP、1.0% S-β-CD/PP組分別在第25、40、30、50天時色澤明顯變差，與PP組貨架期截止時（20 d）的色澤存在顯著差異（P＜0.05），這說明β-CD包埋留蘭香可以起到較好的緩釋效果。

2.4 不同功能性緩釋膜對乳化香腸貯藏過程中pH值的影響

pH值為判斷肉與肉制品微生物腐敗的重要標準[23]，pH值下降的速率與程度對貯藏期間肉制品的顏色和細菌繁殖有重要的影響。

圖3 貯藏時間對不同包裝的乳化香腸pH值的影響Fig. 3 Changes in pH of sausage samples packaged with different films during storage

由圖3可知，隨著貯存時間的延長，乳化香腸的pH值呈下降趨勢。中溫殺菌后的乳化香腸由于初始pH值較高（6.15±0.02），為大多數(shù)微生物提供了合適的繁殖環(huán)境，導致貨架期較短。結合pH值和菌落總數(shù)的變化可知，乳化香腸的pH值與菌落總數(shù)之間存在關聯(lián)性。尤其貯存后期微生物繁殖快，發(fā)酵產(chǎn)酸導致pH值下降較快[24]。并且0.5% S-β-CD/PP和1.0% S-β-CD/PP的pH值的下降變化平緩，且相同貯藏時間時pH值顯著高于PP組（P＜0.05）；這說明β-CD包埋材料緩釋留蘭香的效果顯著，可以一定程度上抑制香腸表面微生物的繁殖，延緩了pH值的下降。β-CD包埋材料可以較大程度地延長產(chǎn)品的貨架期，采用1.0% S-β-CD/PP包裝的乳化香腸可以延長至50 d，效果大大優(yōu)于采用PP包裝（20 d）。

2.5 不同功能性緩釋膜對乳化香腸貯藏過程中TBA含量的影響

丙二醛是脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物，TBA是脂質(zhì)氧化與丙二醛含量變化的綜合衡量指標，可以直觀分析肉制品的腐敗程度。通常TBA含量越大，腐敗程度越嚴重。王正勇等[25]認為，當肉制品TBA含量大于1 mg/kg時，該產(chǎn)品被認為已經(jīng)腐敗不能食用。

圖4 貯藏時間對不同包裝的乳化香腸TBA含量的影響Fig. 4 Changes in TBA value of sausage samples packaged with different films during storage

如圖4所示，乳化香腸的初始TBA含量為0.47 mg/kg，不同的樣品組都隨著貯存時間的延長而不斷上升，變化趨勢一致；這說明整個貯存期間，脂肪氧化程度不斷加大。貯藏時間大于20 d后，在相同的貯藏時間，其他組別的TBA含量顯著低于PP組（P＜0.05）。在產(chǎn)品貯存初期，是包裝內(nèi)部殘存的氧氣使得肉制品氧化，而隨著貯存時間的延長，乳化香腸失水，使得包裝膜的阻隔性進一步下降，脂肪氧化程度加重。而PP組最早腐敗則可能與微生物超標有一定的關聯(lián)性[26]。這進一步說明，留蘭香和β-CD包埋留蘭香的添加緩釋薄膜可以顯著抑制中溫乳化香腸肉制品中脂質(zhì)的氧化，從而減少TBA的產(chǎn)生，延長乳化香腸的貯存期。

2.6 不同功能性緩釋膜對乳化香腸貯藏過程中菌落總數(shù)的影響

參照GB 4789.1—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 總則》[27]中的采樣方案進行三級采樣。參照GB 2726—2016《食品安全國家標準 熟肉制品》[28]中的微生物限量進行分析。同一批次采集樣品數(shù)n＝5，最大允許超出微生物指標可接受水平限量值的樣品數(shù)（c）為2，微生物指標可接受水平限量為104，微生物指標的最高安全限量M＝105。

圖5 貯藏時間對不同包裝乳化香腸的菌落總數(shù)的影響Fig. 5 Changes in total bacterial count of sausage samples packaged with different films during storage

由圖5A可知，在貯藏期間，乳化香腸的菌落總數(shù)隨著貯藏時間延長不斷增加，相同貯藏時間時，PP組的菌落總數(shù)高于另外4 組。第20天，未經(jīng)處理的PP組乳化香腸菌落總數(shù)為（4.73±0.02）（lg（CFU/g）），c＝5，菌落總數(shù)超標；第25天，0.5% S/PP組乳化香腸菌落總數(shù)為（4.15±0.09）（lg（CFU/g）），c＝5，菌落總數(shù)超標；第30天，1.0% S/PP組乳化香腸菌落總數(shù)為（4.53±0.11）（lg（CFU/g）），c＝5，菌落總數(shù)超標；第40天，0.5% S-β-CD/PP組乳化香腸菌落總數(shù)為（4.31±0.03）（lg（CFU/g）），c＝5，菌落總數(shù)超標；第50天，1.0% S-β-CD/PP組乳化香腸菌落總數(shù)為（4.53±0.11）（lg（CFU/g）），c＝5，菌落總數(shù)超標。

由圖5B可知，隨著留蘭香添加量的增加，乳化香腸的貨架期延長，0.5% S/PP、1.0% S/PP、0.5% S-β-CD/PP、1.0% S-β-CD/PP可分別延長貨架期至25、30、40、50 d，說明這4 種抗菌膜可以在一定程度上抑制香腸表面微生物的繁殖。留蘭香的抑菌機理是有效成分利用其疏水性與細菌的細胞膜結合，使得微生物菌體溶脹裂解，從而抑制微生物的繁殖[29-30]。對該指標進一步分析得到，β-CD包埋留蘭香后，留蘭香的持續(xù)抑菌能力更久。這是因為β-CD具有很好的熱穩(wěn)定性，β-CD的分子結構在280 ℃被破壞，開始熱重損失發(fā)生降解，適合200 ℃以下的熱加工處理；而本研究吹塑的模頭溫度是200 ℃，采用β-CD作為包埋介質(zhì)可以極大地保護在薄膜加工過程中溫度對留蘭香物質(zhì)有效成分的破壞，可以很大程度上解決肉制品貨架期短的問題。

3 結 論

本研究利用β-CD包埋留蘭香提取物制備抑菌緩釋聚丙烯基薄膜，留蘭香的有效成分因其疏水性可與細菌細胞膜結合，使得微生物菌體溶脹裂解，從而抑制微生物的繁殖。本實驗采用擠出吹塑法制備了PP、0.5%S/PP、1.0% S/PP、0.5% S-β-CD/PP、1.0% S-β-CD/PP，比較分析了不同種功能性緩釋膜厚度、力學性能、透光率、水蒸氣透過率、抑菌性能和乳化香腸的色澤、pH值、TBA含量、菌落總數(shù)等指標；結果表明：在貯藏期間，1.0% S-β-CD/PP薄膜包裝可以顯著減少乳化香腸TBA的產(chǎn)生，降低菌落總數(shù)，使得乳化香腸保持良好的品質(zhì)從而延長貨架期。綜合考慮，1.0% S-β-CD/PP薄膜包裝的乳化香腸的貨架期最長，可以延長至50 d，微生物繁殖是影響中溫肉制品貨架期的關鍵因素。本研究為中溫乳化香腸的生產(chǎn)及貯藏提供了解決方法，可以很大程度解決肉制品貨架期的問題，可進一步應用在肉制品的包裝上，具有實際應用價值。

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