不同誘變處理對苜蓿葉片細(xì)胞顯微和超微結(jié)構(gòu)的影響

馮鵬,孫力,申曉慧,李如來,李增杰,李志民,鄭海燕,姜成,楊鶴,劉俊剛,郭偉,張英俊

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，黑龍江 哈爾濱150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003；4.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193)

葉片是植物體進(jìn)行光合作用的營養(yǎng)器官，同時也是對環(huán)境變化最為敏感的器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征最能體現(xiàn)環(huán)境因子的影響或植物對環(huán)境的適應(yīng)[1]。結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)，植物生理功能的改變是由植物葉片結(jié)構(gòu)的變化所致[2]。研究植物葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)是對外界環(huán)境的適應(yīng)性的反應(yīng)，葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)對環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制是探索植物適應(yīng)環(huán)境對策的基礎(chǔ)。

誘變育種(Mutation breeding)是利用物理、化學(xué)和生物等因素誘導(dǎo)植物遺傳性發(fā)生各種變異，并從變異群體中選擇符合育種目標(biāo)的個體，進(jìn)而育成新品種或新種質(zhì)的育種方法[3]。高等植物在不同逆境脅迫下，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)也會發(fā)生不同程度的改變，這一改變與植物所受脅迫程度和本身的抗逆性關(guān)系密切，誘變突變體為育種提供選擇材料。張文娟等[4]研究指出，空間誘變后德福、德寶、阿爾岡金、三得利4個苜蓿品種葉片厚度增加，葉脈突起度降低，柵欄組織顯著增厚；與對照相比，德福的細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度與對照差異均不顯著，阿爾岡金的細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度與對照差異不顯著，其他品種細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度、疏松度與對照均有顯著差異。馮鵬等[5]研究衛(wèi)星搭載對苜蓿超微結(jié)構(gòu)變化的影響，結(jié)果表明，空間飛行后植株葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)了不同程度的變化，對葉綠體的影響較大，線粒體也出現(xiàn)較為明顯的空洞和溢裂現(xiàn)象；夏曾潤等[6]通過不同濃度的甲基磺酸乙酯溶液誘變處理紫花苜蓿種子，結(jié)果表明，EMS處理抑制了M1代種子的最終發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和胚根胚芽長度，進(jìn)而影響植株葉色，原因可能是葉片葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。張?zhí)N薇等[7]發(fā)現(xiàn)空間誘變處理紅豆草(Onobrychisviciaefolia)突變體細(xì)胞壁不規(guī)則增厚、扭曲，細(xì)胞質(zhì)稀薄，液泡大，葉綠體變小，形狀多不規(guī)則。葉綠體內(nèi)淀粉粒細(xì)小、數(shù)量多，基粒數(shù)減少，每個基粒內(nèi)部的基粒片層直徑變小。

盡管零磁空間、60CO-γ射線、紫外線以及甲基磺酸乙酯處理對紫花苜蓿誘變的研究已有報道，但有關(guān)細(xì)胞顯微和超微結(jié)構(gòu)的報道仍較少。通過分析誘變處理后細(xì)胞顯、超微結(jié)構(gòu)的變化，旨在探明不同誘變處理對苜蓿葉片細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，為篩選最優(yōu)誘變處理方法提供科學(xué)依據(jù)，選育適合高寒地區(qū)種植的苜蓿品種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)于2015年10月-2017年6月在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院和沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)地是黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院牧草試驗(yàn)地。所在區(qū)域年平均降水量510 mm；土壤類型為草甸黑土，pH 為6.10，土壤有機(jī)質(zhì)為2.65%、速效鉀為112.76 mg·kg-1、速效磷為44.50 mg·kg-1、堿解氮為135.41 mg·kg-1、全磷為0.14%、全氮為0.19%，全鉀為1.60%。

1.2 試驗(yàn)材料

選取公農(nóng)1號、Wega7F、WL319HQ、敖漢4個苜蓿品種，其中WL319HQ苜蓿是由北京正道生態(tài)科技有限公司提供，Wega7F、公農(nóng)1號、敖漢苜蓿種子由黑龍江省畜牧研究所提供。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

1.3.1零磁空間 零磁空間采用雙層磁屏蔽結(jié)構(gòu)和線圈補(bǔ)償方式相結(jié)合的大型26面體磁屏蔽裝置，直徑為2.3 m，磁強(qiáng) ≤20 nT，為地球磁強(qiáng)度的4×10-4倍。將4個苜蓿品種風(fēng)干種子各10 g，3次重復(fù)，在室溫下經(jīng)零磁空間處理180 d。

1.3.260CO-γ射線 4個苜蓿品種種子進(jìn)行60CO-γ射線輻照處理，劑量分別為150、300、450 Gy，以0劑量處理作為對照，每個處理300粒，處理周期為7 d，3次重復(fù)。

1.3.3紫外線 選取籽粒飽滿的苜蓿種子300粒，將其包于紗布中，用45 ℃的蒸餾水浸泡1 h，用濾紙吸干種子表面的水分，再用0.1%的氯化汞溶液消毒 10 min。無菌水清洗 3～5次，將其置于紫外燈下40 cm處照射30、90 min。3次重復(fù)。

1.3.4甲基磺酸乙酯(EMS) 挑選成熟的苜蓿種子900粒，用濃硫酸處理5 min，蒸餾水沖洗多次。在4 ℃磷酸緩沖液 (100 mmol·L-1, pH 7.0)浸泡12 h使種子完全吸水膨脹。用磷酸緩沖液將EMS分別配制成濃度為0.1%、0.4% (v/v)的溶液，置于室溫黑暗條件下處理種子15 h，期間對藥劑浸泡的種子進(jìn)行輕輕翻轉(zhuǎn)搖動，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗，去除殘留種子表面的EMS溶液。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1顯微制片及觀察 選取誘變當(dāng)代健康植株中部功能葉片，葉片沿中脈切取大小為5 mm×5 mm，用 FAA 固定液固定，常規(guī)石蠟切片法制片，切片厚度 5 μm，番紅-固綠雙重染色。Nikon-DIAPHOT顯微鏡上觀察。

1.4.2電鏡制片及觀察 取誘變處理和未經(jīng)處理的苜蓿中部功能葉片，注意避開葉脈，切成長 1 cm、寬約0.5 cm 左右的小塊，迅速放入濃度 2.5%、pH 6.8 的戊二醛固定液中，同時抽真空使材料沉入固定液，在4 ℃下固定2 h后用 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH=6.8)沖洗2次，每次間隔時間為2 h，隨后采用濃度為50%、70%、80%、95%、100%的乙醇進(jìn)行依次脫水，脫水后轉(zhuǎn)移至100%的丙酮內(nèi)，最后用 Epon812包埋劑浸透包埋。利用 ULTRACUTE 型超薄切片機(jī)將包埋塊切成50～70 nm的薄片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，HITACI-II～HT7700 型透射電鏡下觀察，30000倍鏡下照相。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用 Motic Image 2000 1.3軟件進(jìn)行顯微測量，測量葉片厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度、葉脈厚度，各顯微結(jié)構(gòu)觀測值均為30個數(shù)值的平均值，并計算：

細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度 CTR(cell tense ratio)=柵欄組織厚度/葉片厚度×100%
細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度SR(spongy ratio)=海綿組織厚度/葉片厚度×100%
葉脈突起度VPD(vein protuberant degree)=葉脈厚度/葉片厚度

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微結(jié)構(gòu)

2.1.1葉片和葉脈突起度 不同誘變處理對苜蓿當(dāng)代植株葉片顯微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的影響，變異方向及變異程度因方法和誘變劑量不同而異[8-9]。4種苜蓿品種的葉片厚度在誘變后變化不同，但主要以葉片厚度增加為主。公農(nóng)1號除30 min紫外線和0.1% EMS處理下葉片厚度低于對照，其他處理均顯著高于對照 (P<0.05) (表1)；Wega7F除EMS 0.1%處理下葉片厚度低于對照，其他處理也均顯著高于對照(表2)；WL319HQ和敖漢苜蓿在所有處理下葉片厚度全部顯著高于對照(表3，4)。各苜蓿品種誘變處理后，葉脈突起程度均顯著小于對照(P<0.05)(表1～4)。

2.1.2柵欄組織和海綿組織 葉片的厚度主要取決于柵欄組織厚度和海綿組織厚度[10]。葉片厚度隨柵欄組織厚度增加而增加，即柵欄組織越厚，葉片厚度越厚。不同苜蓿品種受不同誘變處理后，柵欄組織的厚度隨著葉片厚度變化而變化[11]。與對照相比，公農(nóng)1號60CO-γ輻射、紫外線和EMS高劑量下均高于對照處理，同一誘變處理隨著劑量的增大，柵欄組織厚度增加，其他處理下均低于對照(表1)；海綿組織在紫外線30 min和0.1% (v/v)EMS處理及零磁空間處理下顯著低于對照(P<0.05)，其他處理均高于對照(表1)；Wega7F的柵欄組織均顯著高于對照，海綿組織多數(shù)處理?xiàng)l件下也顯著高于對照，但EMS處理下海綿組織厚度均低于對照(表2)；WL319HQ苜蓿的柵欄組織均顯著高于對照(P<0.05)(表3)。

注：表中同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。EMS: 甲基磺酸乙酯。下同。

Note: Different small letters in the same column indicate significant differences at theP<0.05 level. EMS: Ethylmethane sulfonate. The same below.

表2 誘變處理對Wega7F葉片主要結(jié)構(gòu)特征影響Table 2 Comparison of main structural features of Wega7F under different mutagenic treatments (μm)

2.1.3細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度(CTR)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度(SR) 供試的4 個苜蓿品種葉片結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度變化各不相同。與對照相比，公農(nóng)1號苜蓿只在紫外線處理下CTR顯著低于對照(P<0.05)，其他處理與對照差異不顯著(表1)；公農(nóng)1號60CO-γ輻射和紫外線處理SR均高于對照，其他處理低于對照(表1)；誘變后Wega7F CTR升高；SR只是60CO-γ的150 Gy輻射處理、紫外線處理和0.4% EMS處理高于對照；敖漢苜蓿與對照相比，除150 Gy處理的CTR顯著高于對照外，其他所有處理下CTR均低于對照處理，只有EMS 0.1%處理CTR高于對照，說明敖漢苜蓿誘變后細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為松散(表1～4)。

表3 誘變處理對WL319HQ葉片主要結(jié)構(gòu)特征影響Table 3 Comparison of main structural features of WL319HQ under different mutagenic treatments (μm)

表4 誘變處理對敖漢苜蓿葉片主要結(jié)構(gòu)特征影響Table 4 Comparison of main structural features of Aohan under different mutagenic treatments (μm)

2.2 超微結(jié)構(gòu)

從圖1可以看出，WL319HQ對照組葉肉細(xì)胞中的葉綠體靠近細(xì)胞壁整齊排列，形狀規(guī)則呈近紡錘形，葉綠體膜完整無缺，基粒片層結(jié)構(gòu)排列整齊、均勻、緊密，淀粉粒較小，含量較少。在紫外線(30 min)和EMS[0.1% (v/v)]低劑量或濃度處理下，葉肉細(xì)胞中的葉綠體形狀仍較規(guī)則，片層結(jié)構(gòu)和垛疊結(jié)構(gòu)排列整齊，但部分垛疊結(jié)構(gòu)開始模糊，線粒體脊部分消失，質(zhì)體數(shù)量減少，少量片層溶解，但在150 Gy輻射處理下，葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)除具有前面的其他處理低劑量的特征外，此處理下的垛疊結(jié)構(gòu)全部有腫脹現(xiàn)象。高劑量處理下[450 Gy60Co-γ，90 min紫外線，0.4% (v/v) EMS]，多數(shù)細(xì)胞壁仍然完好，但個別細(xì)胞壁完全溶解，內(nèi)容物全部外滲至細(xì)胞間隙，葉綠體膜溶解，個別葉綠體膜有向外突起現(xiàn)象，質(zhì)體明顯增多，片層結(jié)構(gòu)逐漸溶解，個別垛疊結(jié)構(gòu)增厚，部分有溶解模糊現(xiàn)象，在完整細(xì)胞內(nèi)，胞漿向四周擴(kuò)散，淀粉粒增多，多數(shù)線粒體脊消失。零磁空間處理下，細(xì)胞內(nèi)一些變化同高劑量處理相似，但是細(xì)胞壁處理有完全溶解現(xiàn)象外，細(xì)胞壁上還有分泌物質(zhì)存在，質(zhì)體數(shù)量下降，細(xì)胞充滿內(nèi)含物，淀粉粒多，且增大。

圖1 WL319HQ葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(×30000)Fig.1 Ultrastructure of WL319HQ (×30000) a: CK; b: 0.1% EMS處理; c: 30 min紫外線處理; d～e: 90 min紫外線處理; f: 150 Gy輻射處理; g: 300 Gy輻射處理; h～i: 450 Gy輻射處理; j～k: 0.4% EMS處理;l: 零磁空間處理。 CW: 細(xì)胞壁; VA: 液泡; CH: 葉綠體; M: 線粒體; S: 淀粉粒; D: 垛疊結(jié)構(gòu); P:質(zhì)體。 a: CK; b: 0.1% EMS treatment; c: 30 min UV treatment; d-e: 90 min UV treatment; f:150 Gy radiation treatment; g: 300 Gy radiation treatment; h-i: 450 Gy radiation treatment; j-k: 0.4% EMS treatment; l: magnetic field free space. CW: cell wall; VA: vacuole; CH: chloroplast; M: mitochondrion; S: starch grain; D: crib fold structure; P: plasmid.

3 討論

植物處于逆境下，其形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生變化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變既是基因變異的反映[12]，又是對環(huán)境的適應(yīng)性的體現(xiàn)[13-14]。所以通過對顯微結(jié)構(gòu)變化的研究分析可以探究其微觀變異機(jī)理，同時也可以通過對顯微結(jié)構(gòu)特征的了解來篩選出抗寒性強(qiáng)的誘變方法及有益突變體植株。通常情況下，葉片厚度，葉肉柵欄組織、海綿組織和葉脈等形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)變化多數(shù)是由于外部環(huán)境變化所致[15]。植物的柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度、疏松度等細(xì)胞結(jié)構(gòu)特性均與植物抗逆性有一定關(guān)系。由于葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密程度主要是針對柵欄組織而言，所以細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度用柵欄組織厚度占葉片厚度比例的相對值來體現(xiàn)，柵欄組織也被用來作為抗寒指標(biāo)進(jìn)行研究[16]。Pavel等[17]認(rèn)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密程度越大，該品種的抗寒能力越強(qiáng)。房用等[18]對茶樹的細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為，茶樹細(xì)胞柵欄組織厚度、柵欄組織層次、柵欄組織結(jié)構(gòu)排列緊密程度以及柵欄組織厚度與海綿組織厚度的比值與茶樹的抗寒具有正相關(guān)關(guān)系。馮鵬[19]研究表明，空間搭載后，紫花苜蓿高水分含量葉片厚度增加，海綿組織厚度和緊密程度也有所增加。張?zhí)N微等[20]研究表明，對于苜蓿葉片顯微結(jié)構(gòu)來說，海綿組織和柵欄組織在空間誘變處理下反應(yīng)效應(yīng)不同，空間誘變對海綿組織的影響大于對柵欄組織的影響，空間搭載后，苜蓿葉片海綿組織結(jié)構(gòu)與對照達(dá)到差異顯著水平，但柵欄組織與對照差異不顯著。本研究結(jié)果表明，誘變后葉片厚度、葉脈突起度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)緊密度等指標(biāo)均會產(chǎn)生變異，誘變方法和苜蓿品種不同，變化程度也不同，與對照相比，供試苜蓿品種葉片厚度多數(shù)呈增加趨勢，而葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度增加，有利于增強(qiáng)其抵御逆境的能力和抗寒性的提高。公農(nóng)1號苜蓿的柵欄組織厚度在450 Gy輻射誘變和90 min紫外線處理下增加，Wega7F、WL319HQ和敖漢苜蓿的柵欄組織與對照相比均呈增加趨勢，各品種的海綿組織厚度則隨誘變處理的不同而增減不同，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的緊密度與疏松度和海綿組織變化相似，說明其變異方向及變異程度具有不確定性。本研究選取的4個苜蓿品種半同胞種子作為誘變材料，極大地減少了種子間遺傳背景的差異，并選擇葉片作為顯微結(jié)構(gòu)的研究對象，可以更準(zhǔn)確地反映植株對誘變條件的適應(yīng)。

葉片對不同誘變反應(yīng)都非常敏感[21]。葉片細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)經(jīng)過誘變后都會發(fā)生顯著變化，如細(xì)胞壁薄厚不均勻[22]，葉肉細(xì)胞內(nèi)部分細(xì)胞器退化消失[23]，細(xì)胞液泡變大[24]，細(xì)胞器被擠到細(xì)胞壁邊緣[25]，葉綠體變形或膜解體[26]。楊鳳仙等[27]還觀察到低溫脅迫下葉綠體膜解體形似幾個變態(tài)葉綠體相互粘連堆疊在一起，大部分葉綠體的基質(zhì)片層排列紊亂，有些片層融合而變得模糊不清或完全消失。王冬梅等[28]研究表明，番茄(Lycopersiconesculentum)葉片葉綠體在高溫脅迫下會膨大變圓，葉綠體被膜出現(xiàn)不同程度的斷裂、解體，類囊體片層松散，排列紊亂。這是由于細(xì)胞受到傷害后做出的應(yīng)激反應(yīng)所致。本研究中，與對照相比，尤其是在不同誘變高劑量和零磁空間處理下，葉綠體膜會有部分模糊或解體，基粒片層膨脹、溶解、基粒垛疊程度下降，個別也有增加，有的細(xì)胞壁完全破裂，內(nèi)含物全部外泄，線粒體脊模糊，質(zhì)體明顯增多并出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。由于質(zhì)體是一類與碳水化合物合成與儲藏有關(guān)的細(xì)胞器，質(zhì)體增加能夠提高細(xì)胞活力，對于提高苜?？购跃哂袃?yōu)勢作用[29-30]。本研究還發(fā)現(xiàn)，誘變處理后，葉綠素中的個別淀粉粒變多變大，說明光合產(chǎn)物淀粉在葉肉細(xì)胞葉綠體內(nèi)的積累，能夠大大提高紫花苜蓿對寒冷的忍受能力，因?yàn)樵黾拥牡矸劢怏w時能夠釋放能量，這將更好的維持細(xì)胞較高的活性水平；同時解體的淀粉粒還具有提高細(xì)胞質(zhì)濃度、增加滲透壓及吸水力以及提高其抗逆性的作用。

4 結(jié)論

1)誘變處理增加了苜蓿葉片厚度，但降低了葉脈突起程度；細(xì)胞淀粉粒變大，數(shù)量變多，有助于提高苜蓿的抗寒性能。

2)在一定梯度范圍內(nèi)，60CO-γ射線和EMS誘變效率較高，突變體材料豐富，操作簡單，適宜于誘變育種的實(shí)際操作。

3)150 Gy60Co-γ射線、60 min紫外線、0.4%濃度EMS處理為苜蓿正向變異處理，有利于篩選有益誘變突變體。

參考文獻(xiàn)References：

[1] Mei C, Sasmita M, Scott A,etal. Proteomic analysis ofArabidopsisthalianaleaves in response to acute boron deficiency and toxicity reveals effects on photosynthesis, carbohydrate metabolism, and protein synthesis. Journal of Plant Physiology, 2014, 171: 3-4.

[2] Liu L C, Jiang C C, Dong X C,etal. Effects of boron deficiency on cellular structures of maturation zone from root tips and functional leaves from middle and upper plant in trifoliate orange rootstock. Scientia Acricultura Sinica, 2015, 48(24): 4957-4964.

劉磊超, 姜存?zhèn)}, 董肖昌, 等. 硼脅迫對枳橙砧木細(xì)根根尖成熟區(qū)和幼嫩葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(24): 4957-4964.

[3] Jiang S Y, Bachmann D, La H G,etal. Ds insertion mutagenesis as an efficient tool to produce diverse variations for rice breeding. Plant Molecular Biology, 2007, 4: 385-502.

[4] Zhang W J, Deng B, Zhang Y W,etal. Effect on the leaf microstructure of different alfalfa varieties from spaceflight. Acta Agrestia Sinica, 2010, 18(2): 233-236.

張文娟, 鄧波, 張?zhí)N薇, 等. 空間飛行對不同紫花苜蓿品種葉片顯微結(jié)構(gòu)的影響. 草地學(xué)報, 2010, 18(2): 233-236.

[5] Feng P, Liu R T, Li J,etal. Effects of satellite carrying on photosynthesis characteristics, microstructure and ultrastructure of different moisture content of alfalfa seeds. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2009, 23(4): 561-565.

馮鵬，劉榮堂，李健, 等. 不同含水量紫花苜蓿種子空載后當(dāng)代葉片顯微和超微結(jié)構(gòu)研究. 核農(nóng)學(xué)報，2009, 23(4): 561-565.

[6] Xia Z R, Du F F, Li S,etal. Construction of an EMS induced mutant library and identificatin of morphological characteristics inMedicagosativa. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(2): 215-222.

夏曾潤, 杜鳳鳳, 李偲, 等. 紫花苜蓿EMS突變體庫的構(gòu)建和形態(tài)學(xué)性狀鑒定. 草業(yè)學(xué)報, 2014, 23(2): 215-222.

[7] Zhang Y W, Ren W B, Liu M,etal. Study on peroxidase and esterase isoenzymes and the ultrastructure of the space induced mutant leaves of Sainfoin (OnobrychisviciaefoliaScop.). Acta Agrestia Sinica, 2004, 12(3): 223-226.

張?zhí)N薇, 任衛(wèi)波, 劉敏, 等. 紅豆草空間誘變突變體葉片同工酶及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析. 草地學(xué)報, 2004, 12(3): 223-226.

[8] Loutou M, Hajjaji M, Mansori M,etal. Heated blends of phosphate waste: Microstructure characterization, effects of processing factors and use as a phosphorus source for alfalfa growth. Journal of Environmental Management, 2016, 4: 337-345.

[9] Zhu H S, Zhang Y, Dong K H,etal. Effect of drought stress on microstrutural characteristic changes ofMedicagosativa‘Pingguan’. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 23(4): 771-779.

朱慧森, 張垚, 董寬虎, 等. 干旱脅迫下偏關(guān)苜蓿顯微結(jié)構(gòu)響應(yīng)特征研究. 草業(yè)學(xué)報, 2015, 23(4): 771-779.

[10] Peguero P J, Gil-Pelegrín E, Morales F. Photosystem II efficiency of the palisade and spongy mesophyll inQuercuscocciferausing adaxial/abaxial illumination and excitation light sources with wavelengths varying in penetration into the leaf tissue. Photosynthesis Research, 2008, 1: 49-61.

[11] Wang J, Zhang J, Yang J H,etal. Effects of enhanced UV-B radiation on the leaves microstructure of cotton. Xinjiang Agricultural Sciences, 2010, 47(8): 1619-1626.

王進(jìn), 張靜, 楊景輝, 等. UV-B輻射增強(qiáng)對棉花葉片顯微結(jié)構(gòu)的影響. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 47(8): 1619-1626.

[12] Li X F, Ni Z M, Wu Y Y,etal. Effects of salt stress on photosynthetic characteristics and leaf cell structure of ‘Yinhong’ grape seedlings. Acta Ecologica Sinica, 2015, 35(13): 4436-4444.

李學(xué)孚, 倪智敏, 吳月燕, 等. 鹽脅迫對‘鄞紅’葡萄光合特性及葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響. 生態(tài)學(xué)報, 2015, 35(13): 4436-4444.

[13] Suriyan C, Kanyaratt S W, Chalermpol K. Comparative effects of salt stress and extreme pH stress combined on glycinebetaine accumulation, photosynthetic abilities and growth characters of two rice genotypes. Rice Science, 2009, 16(4): 274-282.

[14] He J P, Zhu J C, Wang J P,etal. The relationship between seedling microtructure and cold resistance ofBrassicanapus. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2017, 33(1): 19-26.

何俊平, 朱家成, 王建平, 等. 甘藍(lán)型油菜幼苗顯微組織結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2017, 33(1): 19-26.

[15] Tian C X, Zhang Y M, Wang K,etal. The anatomical structure responses in alfalfa to salinity-alkalinity stress of NaHCO3. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(5): 133-142.

田晨霞, 張詠梅, 王凱, 等. 紫花苜蓿組織解剖結(jié)構(gòu)對NaHCO3鹽堿脅迫的響應(yīng). 草業(yè)學(xué)報, 2014, 23(5): 133-142.

[16] Suarez N. Comparative leaf anatomy and pressure-volume analysis in plants of ipomoea pes-caprae experimenting saline and/or drought stress. International Journal of Botany, 2011, 7(1): 53-62.

[17] Pavel L, Paul K, Alexander Z,etal. Recrystallization-based formation of uniform fine-grained austenite structure before polymorphic transition in high-strength steels for arctic applications. International Journal of Mechanical and Materials Engineering, 2016, 11(1): 55-59.

[18] Pang Y, Meng Z D, Li X F,etal. Analysis of anatomical structure on tea leaves in Shandong province. Journal of Tea Sciences, 2014, (3): 190-196.

房用, 孟振農(nóng), 李秀芬, 等. 山東茶樹葉片解剖結(jié)構(gòu)分析. 茶葉科學(xué), 2014, (3): 190-196.

[19] Feng P. Effects of alfalfa seed moisture content on mutagenic of satellite carrying. Lanzhou: Gansu Agricultural University, 2008.

馮鵬. 紫花苜蓿種子含水量對衛(wèi)星搭載誘變效應(yīng)的影響. 蘭州: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[20] Zhang Y W, Han J G, Ren W B,etal. Breeding by spaceflight mutagenesis and its application in forage breeding. Pratacultural Science, 2005, 2(10): 59-63.

張?zhí)N微, 韓建國, 任衛(wèi)波, 等. 植物空間誘變育種及其在牧草上的應(yīng)用. 草業(yè)科學(xué), 2005, 2(10): 59-63.

[21] Sun D Y, Zhang J X, Chen G Z,etal. Achievements and perspective outlook of space inducedMutationbreedingfor the rice blast resistance. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2017, 31(2): 271-279.

孫大元, 張景欣, 陳冠州, 等. 空間誘變選育抗稻瘟病水稻品種研究進(jìn)展與展望. 核農(nóng)學(xué)報, 2017, 31(2): 271-279.

[22] Ma Y, Cheng Z, Wang W,etal. Proteomic analysis of high yield rice variety mutated from spaceflight. Advances in Space Research, 2007, 40(4): 535-539.

[23] Bonaventura R, Poma V, Costa C,etal. UV-B radiation prevents skeleton growth and stimulates the expression of stress markers in sea urchin embryos. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 328(1): 150-157.

[24] Guo Y H, Xie L B, Meng F J,etal. Change of photosythetic, pigment and ulstructure sweet pepper leaves after space induction. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2011, 25(2): 237-241.

郭亞華, 謝立波, 孟凡娟, 等. 空間誘變后甜椒葉片光合、色素和超微結(jié)構(gòu)的變化. 核農(nóng)學(xué)報, 2011, 25(2): 237-241.

[25] Nechitailo G S, Lu J Y, Xue H. Influence of long term exposure to space flight on tomato seeds. Advances in Space Research, 2005, 36(7): 1329-1333.

[26] Zhao H B. Studies on chlorophyll-deficient wheat mutants induced by spaceflight environment. Beijing: Chinese Academy Agriculture Sciences, 2010.

趙洪兵. 空間環(huán)境誘變小麥葉綠素缺失突變體的研究. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2010.

[27] Yang F X, Dong J M, Yang X X. Variations of the ultrastructure of the leaf cell of cotton under low temperature. Journal of Shanxi Agricultural University, 2001, 16(2): 116-117.

楊鳳仙, 董俊梅, 楊曉霞. 低溫脅迫下棉葉葉綠體、液胞超微結(jié)構(gòu)的變化. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2001, 16(2): 116-117.

[28] Wang D M, Xu X Y, Li J,etal. Effect of heat stress on chloroplast ultrastructure changes in mesophyll cell of tomato. Acta Horticulturae Sinica, 2004, 31(6): 820-821.

王冬梅, 許向陽, 李景, 等. 熱脅迫對番茄葉肉細(xì)胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響. 園藝學(xué)報, 2004, 31(6): 820-821.

[29] Stupnikova G, Borovskii A, Antipina V I,etal. Polymorphism of thermostable proteins in soft wheat seedlings during low-temperature acclimation. Russian Journal of Plant Physiology, 2001, 48(6): 804-810.

[30] Gao J H. Genetic analysis of EAPP gene in Dongmu-70 rye and cold tolerance improvement in Cbf3 gene transgenic forage. Yangling: North West Agriculture and Forestry University, 2009.

高景慧. 冬牧70黑麥EAPP基因遺傳分析與CBF3基因?qū)肽敛萏岣呖购缘难芯? 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2009.