添加纖維素酶對干玉米秸稈與白菜廢棄物混貯品質(zhì)的影響

任海偉，劉菲菲，王莉，李志忠*，王昱，孫安琪，沈佳莉，孫文斌，余倩倩

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050； 2.蘭州理工大學(xué)西部能源與環(huán)境研究中心，甘肅 蘭州 730050； 3.甘肅省生物質(zhì)能與太陽能互補(bǔ)供能系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642)

作物秸稈是常用的飼草和能源作物，但由于我國農(nóng)村耕作條件和習(xí)慣等因素，秸稈多數(shù)在萎蔫干黃后才收獲，導(dǎo)致水分和糖分等養(yǎng)分大量流失，甚至高度纖維化，直接貯存不利于后期動物消化和能源轉(zhuǎn)化。以青貯為代表的濕法貯存技術(shù)為干黃秸稈貯存提供了思路，諸多學(xué)者將干秸稈與花椰菜[1]、馬鈴薯渣[2]、玉米粉漿[3]等物料混合貯存并獲得良好品質(zhì)，減少了有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)損失；但由于干秸稈自身營養(yǎng)物質(zhì)所限，與其混合的原料必須滿足高水分(65%～75%)、高糖分等特點(diǎn)，造成干秸稈貯存的局限性。本課題組前期也發(fā)現(xiàn)干秸稈與白菜、萵筍葉等尾菜能混貯50～60 d，但為了更好地保存營養(yǎng)物質(zhì)，混貯品質(zhì)仍需進(jìn)一步改善[4-5]。

研究表明，青貯過程中加入適宜添加劑能提高貯存品質(zhì)并延長貯存周期。纖維素酶是常用的青貯添加劑，能將植物細(xì)胞壁成分降解為可溶性糖，為乳酸菌發(fā)酵提供碳源，有效改善貯存品質(zhì)。陶蓮等[6]認(rèn)為添加纖維素酶能提高華北駝絨藜(Ceratoidesarborescens)青貯料的乳酸含量，降低pH值、氨態(tài)氮和丁酸含量，改善發(fā)酵品質(zhì)。陳鑫珠等[7]認(rèn)為纖維素酶能顯著降低象草(Pennisetumpurpureum)和甜玉米(Zeamays)秸稈混貯料的中性洗滌纖維含量，提高乳酸含量。趙政等[8]發(fā)現(xiàn)玉米秸稈青貯中添加0.3%纖維素酶的貯存效果最佳，腐敗率低于1.4%，有效降低了青貯腐敗率，提高了營養(yǎng)價(jià)值。Selmer-olsen[9]報(bào)道用纖維素酶處理的梯牧草(Phleumpratense)、牛毛草(Eleocharisyokoscensis)和紅三葉草(Trifoliumpratense)混合青貯，顯著降低了青貯pH，增加了乳酸及水溶性碳水化合物含量，明顯改善了青貯品質(zhì)。然而，尚未見有關(guān)纖維素酶應(yīng)用于秸稈/白菜混合貯存過程的文獻(xiàn)報(bào)道。

青貯品質(zhì)的優(yōu)劣歸根結(jié)底是微生物菌群代謝共同作用的結(jié)果。青貯中微生物多樣性的研究方法主要有16S rRNA鑒定、PCR-DGGE 技術(shù)及高通量測序技術(shù)等，其中高通量測序技術(shù)準(zhǔn)確性高、靈敏度高、成本低，能更全面、準(zhǔn)確描述微生物群落信息[10]，但高通量測序技術(shù)用于青貯中微生物菌群研究的文獻(xiàn)報(bào)道還不多，僅有少數(shù)學(xué)者進(jìn)行了報(bào)道。Li等[11]利用MiSeqPE 300平臺發(fā)現(xiàn)加入微藻會影響五節(jié)芒青貯過程中的微生物菌群，優(yōu)勢乳酸菌由原先Enterococcus變?yōu)長actobacillus，Enterococcus和Lactococcus的豐度也分別從10.08%和57.00%下降至2.30%和0.79%。陶蓮等[12]用Miseq測序技術(shù)分析了青貯前后玉米秸稈的菌群結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)青貯后飼料的發(fā)酵品質(zhì)良好，其中厚壁菌門(Firmicutes)、片球菌屬(Pediococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)的菌群豐度顯著增加(P<0.05)。而有關(guān)高通量測序用于秸稈與白菜廢棄物混貯過程中的微生物菌群分析尚未見報(bào)道。

為進(jìn)一步改善干玉米秸稈和廢棄白菜的混合貯存品質(zhì)，擬從感官品質(zhì)、化學(xué)組分和發(fā)酵品質(zhì)等方面研究添加不同劑量纖維素酶對二者混貯品質(zhì)影響，并通過高通量測序考察貯存過程中的微生物多樣性，尤其是乳酸細(xì)菌類群的變化情況，篩選適宜的纖維素酶添加量，以期為干玉米秸稈與白菜混貯模式的技術(shù)推廣提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

干玉米秸稈(dry corn straw，DCS)取自甘肅省定西市隴西縣，摘穗并在田間留置一段時(shí)間后收集、粉碎至1～2 cm，含水量為10.23%；白菜廢棄物(cabbage waste，CW)收集自蘭州市七里河區(qū)職工菜市場，含水量為91.41%，切成2 cm×2 cm備用。

纖維素酶(酶活力為10萬U·g-1)購自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司。

DNA試劑盒采用Water DNA Isolation Kit，購自成都福際生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器和設(shè)備

纖維測定儀(F800，山東海能科技有限公司)；GC9790II氣相色譜儀(浙江福立分析儀器有限公司)；紫外分光光度計(jì)(752N，上海儀電分析儀器有限公司)；電泳儀(DYY-11，北京市六一儀器廠)；PCR儀(MG96+，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)；微型臺式高速離心機(jī)(TG16-W，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

表1 干玉米秸稈和廢棄白菜的化學(xué)成分Table 1 Chemical compositions of dry corn straw (DCS) and cabbage waste (CW)

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與原料混貯制作

根據(jù)課題組前期試驗(yàn)基礎(chǔ)[4]，準(zhǔn)確稱取3.23 kg干玉米秸稈和9.87 kg廢棄白菜，充分混勻后均勻噴灑事先配制好的纖維素酶液，對照組噴灑相同體積的蒸餾水，使貯存體系中含水量為73%。試驗(yàn)設(shè)置低劑量CA組(酶添加量0.1%)、高劑量CB組(酶添加量0.3%)和無酶添加的對照組(ME組)3個(gè)處理組，每個(gè)處理組3個(gè)平行，17 ℃恒溫密封貯存于紅泥青貯袋中，連續(xù)貯存60 d(2015年1-3月)，間隔30 d進(jìn)行感官評定、化學(xué)組分、發(fā)酵品質(zhì)和細(xì)菌多樣性分析。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2份有代表性的混貯料200 g，其中1份取20 g按1∶9加蒸餾水打漿，依次通過4層紗布和定性濾紙過濾，3900 r·min-1離心10 min，所得浸提液測定pH值后-20 ℃冷凍保存，用于乳酸、乙酸、丙酸等有機(jī)酸和氨態(tài)氮的測定。另一份樣品用于木質(zhì)纖維等有機(jī)組分分析。

1.5 分析方法

1.5.1感官評價(jià) 現(xiàn)場感官評價(jià)參照德國農(nóng)業(yè)協(xié)會評分法，優(yōu)良(1級)為15～20分，尚好(2級)為10～15分，中等(3級)為4～10分，腐敗(4級)為0～4分[13]。

1.5.2化學(xué)成分分析 干物質(zhì)含量(DM)采用105 ℃烘干法。中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)測定采用纖維測定儀[4]。纖維素(CL)、半纖維素(HC)和綜纖維素(holocellulose，HoC)含量通過公式計(jì)算獲得，CL=ADF-ADL，HC=NDF-ADF，HoC=CL+HC?？扇苄蕴妓衔?WSC)測定采用蒽酮硫酸比色法[4]。

1.5.3發(fā)酵品質(zhì)分析 pH值測定采用PHS-3D型pH計(jì)。氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，NH3-N)測定采用苯酚-次氯酸鈉比色法。乳酸含量測定采用山東省科學(xué)院SBA-40X生物傳感器。乙酸、丙酸及丁酸等揮發(fā)酸含量測定采用氣相色譜法，進(jìn)樣口溫度200 ℃，載氣為高純氮?dú)?99.999%)，不分流進(jìn)樣，升溫程序：40 ℃保持2 min，以2 ℃·min-1升至100 ℃后保持5 min，再以10 ℃·min-1升至200 ℃，保持5 min。總有機(jī)酸包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等。發(fā)酵品質(zhì)采用V-score評分法，滿分為100分，80分以上為良好，60～80分為尚可，60分以下為不良[13]。

1.5.4細(xì)菌多樣性分析 無菌環(huán)境下稱取60 g貯存樣品均分成3份，分別加200 mL無菌生理鹽水混合，37 ℃振蕩2 h得到菌懸液，用直徑47 mm、孔徑0.22 μm無菌濾膜過濾獲得微生物菌體。再用無菌手術(shù)剪剪碎整張濾膜，置于2 mL無菌離心管中，然后按照Water DNA試劑盒說明步驟提取微生物DNA，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送上海派森諾生物公司Illumina MiSeq平臺進(jìn)行測序。選取相對豐度高于0.1%細(xì)菌類群進(jìn)行門水平和屬水平的微生物菌群分析，并深度分析優(yōu)勢乳酸細(xì)菌的多樣性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007軟件處理基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，用SPSS 18.0對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，各處理數(shù)據(jù)間用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯存期間主要有機(jī)化學(xué)組分的變化

2.1.1纖維素酶對木質(zhì)纖維組分的影響 由表2可知，隨著貯存時(shí)間延長，ME組中CL、HoC及NDF含量均呈上升趨勢，CA和CB組中ADF、NDF及ADL則呈下降趨勢，HC含量呈上升趨勢。30 d和60 d時(shí)，添加纖維素酶的CA和CB組中CL、ADF及NDF含量均顯著低于ME組(P<0.05)；30 d時(shí)CA和CB組中的HC、ADL含量與ME組差異不顯著(P>0.05)，且HoC含量顯著低于ME組(P<0.05)；60 d時(shí)CA組中ADL含量顯著低于ME和CB組(P<0.05)，CB組中HoC含量顯著低于ME和CA組(P<0.05)。

表2 混貯過程中木質(zhì)纖維組分的變化Table 2 Changes of chemical composition during silage (% DM)

注：同行不同小寫字母表示相同處理時(shí)間不同處理組差異顯著(P<0.05)，同行不同大寫字母表示相同處理組不同處理時(shí)間差異顯著(P<0.05)。

Note: The same line with different lowercase indicate significant difference atP<0.05 among different groups at the same treatment time, the same line with different capital letters indicate significant difference atP<0.05 for the same groups within different treatment time.

2.1.2纖維素酶對碳水化合物(WSC)和粗蛋白(CP)的影響 由表3可知，隨著時(shí)間延長，3個(gè)處理組中CP含量呈快速下降趨勢，蛋白組分損失嚴(yán)重；貯存30 d時(shí)3個(gè)處理組之間CP含量差異不顯著(P>0.05)，60 d時(shí)CA和CB組顯著高于ME組，但CA和CB組之間差異不顯著(P>0.05)。另一方面，3個(gè)處理組中WSC含量隨貯存時(shí)間的延長而呈顯著下降趨勢。30 d時(shí)CA和CB組中WSC含量顯著高于ME組(P<0.05)，且CB組最高；60 d時(shí)CA組的WSC含量顯著高于ME組(P<0.05)，但CB組分別與ME、CA組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 纖維素酶對發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表4可知，與ME組相比，CA和CB組pH值下降速度明顯提升，其中高劑量CB組pH下降速度最快，且CA和CB組在貯存期間的pH始終介于3.90～4.10；30 d時(shí)CA和CB組的pH值差異顯著(P<0.05)，但60 d時(shí)差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)中30 d時(shí)高劑量CB組中LA含量顯著高于ME組(P<0.05)，60 d時(shí)無論纖維素酶劑量高低均能促進(jìn)LA含量顯著增加(P<0.05)。AA含量亦隨時(shí)間延長而顯著提高，60 d時(shí)CB組AA含量顯著低于ME和CA組(P<0.05)。3個(gè)處理組中PPA和BA含量均處于較低值，尤其BA含量遠(yuǎn)低于優(yōu)良青貯推薦值1%。CA組中EA含量隨貯存時(shí)間延長呈顯著增加趨勢(P<0.05)，ME和CB組則變化不顯著(P>0.05)；30 d時(shí)CA組與CB組中EA含量顯著低于ME組(P<0.05)，60 d時(shí)差異不顯著(P>0.05)。另外，3個(gè)處理組中LA/AA值均高于3，LA/TOA值也均在0.7以上，其中CB組的LA/AA和LA/TOA均為最高值，說明纖維素酶的添加有助于強(qiáng)化乳酸發(fā)酵強(qiáng)度，且高劑量更有利于促進(jìn)乳酸發(fā)酵。CA和CB組均顯著降低了AN/TN值，且二者之間差異不顯著(P>0.05)，說明纖維素酶的添加減少了蛋白質(zhì)損失。

表3 混貯過程中WSC和CP組分的變化Table 3 Changes of WSC and CP during silage

注：同列不同小寫字母表示相同處理時(shí)間不同處理組差異顯著(P<0.05)，同列不同大寫字母表示相同處理組不同處理時(shí)間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: The same column with different lowercase indicate significant difference atP<0.05 among different groups at the same treatment time, the same column with different capital letters indicate significant difference atP<0.05 for the same groups within different treatment time. The same below.

表4 混貯過程中有機(jī)酸的變化Table 4 Changes of organic acids during silage

2.3 纖維素酶對貯存過程中微生物菌群的動態(tài)影響

2.3.1門分類水平細(xì)菌群落組成 如圖 1 所示，原料DCS中主要包括厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，相對豐度分別為33.78%和65.26%；少量的放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度均低于1.00%。原料CW中Proteobacteria和Bacteroidetes是主要類群，相對豐度分別為80.23%和18.57%；Firmicutes和Proteobacteria豐度都低于1.00%。DCS和CW混貯30和60 d時(shí)，ME組主要包括Firmicutes和Proteobacteria，且Firmicutes豐度逐漸提高，Proteobacteria豐度逐漸下降；30 d時(shí)相對豐度分別為51.10%和48.30%，60 d時(shí)分別為56.60%和40.40%；此外還含有少量Actinobacteria和Bacteroidetes，但二者豐度之和仍低于1.00%。添加纖維素酶混貯后，CA和CB組也主要包含F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria，且變化趨勢與ME組相同，前者豐度逐漸增加，后者豐度則逐漸下降。除此之外，CA和CB組中的Actinobacteria和Bacteroidetes豐度也有所增加，但貯存過程中二者豐度之和仍低于5.00%。

圖1 貯存過程中門水平細(xì)菌群落組成Fig.1 The composition of bacterial community at the phylum level during storage Actinobacteria: 放線菌門; Bacteroidetes: 擬桿菌門; Firmicutes: 厚壁菌門; Proteobacteria: 變形菌門。DCS：干玉米秸稈；CW：廢棄白菜；ME1：30 d的無酶添加對照組；CA1：30 d的低劑量組；CB1：30 d的高劑量組；ME2：60 d的無酶添加對照組；CA2：60 d的低劑量組；CB2：60 d的高劑量組。下同。DCS: Dry corn straw; CW: Cabbage waste; ME1: Non-additive at 30 d; CA1: Group CA (dose of 0.1%) at 30 d; CB1: Group CB (dose of 0.3%) at 30 d; ME2: Non-additive at 60 d; CA2: Group CA (dose of 0.1%) at 60 d; CB2: Group CB (dose of 0.3%) at 60 d; The same below.

2.3.2屬分類水平細(xì)菌群落組成 由圖2可知，原料DCS中含有肉食桿菌屬(Carnobacterium)和腸球菌屬(Enterococcus)等乳酸菌，相對豐度分別為27.71%和0.94%，同時(shí)附著有大量鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、泛生菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和金黃桿菌屬(Chryseobacterium)等非乳酸細(xì)菌，其中Enterobacter和Pantoea豐度較高，分別為47.11%和10.14%；原料CW附著的乳酸細(xì)菌含量極低，相對豐度僅為0.90%，但存在大量腐敗細(xì)菌，尤其Pantoea、Pseudomonas和Chryseobacterium等豐度較高，分別為17.10%、48.40%和16.26%，此外也有少量Enterobacter等，可見CW若不及時(shí)處理極易腐敗變質(zhì)。

圖2 貯存過程中屬水平細(xì)菌群落組成Fig.2 The composition of bacterial community at the genus level during storage Carnobacterium: 肉食桿菌屬; Paralactobacillus: 類乳桿菌屬; Lactobacillus: 乳桿菌屬; Pediococcus: 片球菌屬; Lactococcus: 乳球菌屬; Enterococcus: 腸球菌屬; Agrobacterium: 農(nóng)桿菌屬; Sphingomonadaceae: 鞘脂單胞菌科; Sphingomonas: 鞘氨醇單胞菌屬; Comamonadaceae: 叢毛單胞菌科; Enterobacter: 腸桿菌屬; Erwinia: 歐文氏菌屬; Pantoea: 泛生菌屬; Serratia: 沙雷士菌屬; Pseudomonas: 假單胞菌屬; Xanthomonadaceae: 黃單胞菌科; Stenotrophomonas: 寡養(yǎng)食單胞菌; Caulobacteraceae: 柄桿菌科; Rhizobiales: 根瘤菌目; Devosia: 德沃斯氏菌屬; Novosphingobium: 新鞘脂菌屬; Sphingobium: 鞘脂菌屬; Variovorax: 貪噬菌屬; Methylophaga: 噬甲基菌屬; Microbacteriaceae: 微桿菌科; Flavobacterium: 黃桿菌屬; Chryseobacterium: 金黃桿菌屬; Sphingobacteriaceae: 鞘脂桿菌科; Pedobacter: 地桿菌屬; Sphingobacterium: 鞘氨醇桿菌屬; Exiguobacterium:微小桿菌; Yersinia: 耶爾森氏菌屬; Janthinobacterium: 詹森菌屬; Duganella: 杜檊氏菌屬; others: 其他.

DCS與CW混貯后，ME組中乳酸細(xì)菌主要包括肉食桿菌屬(Carnobacterium)、類乳桿菌屬(Paralactobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)和乳球菌屬(Lactococcus)，其中Paralactobacillus和Lactobacillus相對豐度較高，30 d分別為22.90%和20.70%，60 d時(shí)為15.40%和35.40%，前者隨時(shí)間延長豐度下降，后者則升高。ME組中非乳酸細(xì)菌主要為Enterobacter，且豐度從30 d時(shí)的44.90%下降為60 d時(shí)的36.00%，除沙雷士菌屬(Serratia)相對豐度為1.40%外，其余Sphingomonas、Pseudomonas及Chryseobacterium等非乳酸細(xì)菌屬的豐度均在1.00%以下。

加入纖維素酶混貯后，CA、CB組中腸桿菌屬(Enterobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和類乳桿菌屬(Paralactobacillus)等細(xì)菌的相對豐度較高，30 d時(shí)這3類細(xì)菌在CA組中的豐度依次為38.80%、18.10%和20.90%，60 d時(shí)依次為27.40%、33.70%和18.70%；CB組30 d時(shí)豐度依次為35.80%、37.10%和13.20%，60 d時(shí)依次為32.20%、40.80%和13.80%。另一方面，30 d時(shí)ME、CA和CB組總?cè)樗峒?xì)菌豐度分別為49.00%、44.40%和52.80%，與ME組相比，CB組的總?cè)樗峒?xì)菌豐度提高，但CA組下降；CA和CB組還新增了片球菌屬(Pediococcus)、寡養(yǎng)食單胞菌(Stenotrophomonas)、鞘脂桿菌科(Sphingobacteriaceae)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)，但其相對豐度均低于5.00%。60 d時(shí)，CA和CB組總?cè)樗峒?xì)菌豐度均高于ME組，且CB組豐度最高，達(dá)58.90%；Enterobacter相對豐度明顯下降，且CA組由30 d的38.80%降至60 d的27.40%，下降較快；CB組由30 d時(shí)的35.10%降至60 d時(shí)的32.20%，均低于ME組腐敗菌的相對豐度(30 d時(shí)的44.90%和60 d時(shí)的36.00%)?？傊?，添加纖維素酶明顯降低了Enterobacter的相對豐度，提高了乳酸細(xì)菌相對豐度，且CB組始終高于CA組，說明高劑量纖維素酶更有利于提升乳酸菌相對豐度。

2.3.3乳酸細(xì)菌的多樣性分析 乳酸細(xì)菌是青貯發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，對貯存品質(zhì)優(yōu)劣起重要作用，因此有必要了解乳酸菌屬的多樣性。由圖3可知，DCS和CW中乳酸菌主要為肉食桿菌屬(Carnobacterium)，所占比例分別為96.50%和95.56%，還含有少量腸球菌屬(Enterococcus)和乳球菌屬(Lactococcus)，但由于CW自身附著的乳酸細(xì)菌豐度不足1.00%，故混貯原料附著的乳酸菌主要來自DCS。3個(gè)處理組在30和60 d時(shí)主要包含Carnobacterium、Enterococcus、類乳桿菌屬(Paralactobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和Lactococcus等乳酸菌。其中，Paralactobacillus和Lactobacillus在乳酸細(xì)菌中所占比重較高，30 d時(shí)二者在CA組中占乳酸細(xì)菌的比重分別為40.66%和35.21%，CB組中所占比重分別為24.44%和70.30%；60 d時(shí)二者在CA組中占乳酸細(xì)菌的比重分別為31.64%和57.02%，CB組中所占比重分別為23.27%和68.80%。另一方面，隨著時(shí)間的延長，CA組中Lactobacillus比重逐漸提高，Paralactobacillus比重逐漸下降，而CB組中Lactobacillus和Paralactobacillus略有降低，但其Lactobacillus的比重仍高于ME和CA組。

圖3 貯存過程中乳酸細(xì)菌群落組成Fig.3 Lactic acid bacteria community composition during storage Carnobacterium: 肉食桿菌屬; Enterococcus: 腸球菌屬; Paralactobacillus: 類乳桿菌屬; Lactobacillus:乳桿菌屬; Pediococcus: 片球菌屬; Leuconostoc: 明串珠菌屬; Lactococcus: 乳球菌屬。

3討論

3.1 纖維素酶對混貯化學(xué)組分的影響

原料DCS與CW混合后的水分和WSC含量能達(dá)到青貯要求，二者混貯有利于乳酸發(fā)酵和pH的快速下降，從而減少原料中的養(yǎng)分損失。加入纖維素酶的CA和CB組中WSC含量損失更少，原因是纖維素酶能分解原料中NDF和ADF等纖維組分為乳酸菌可利用的單糖，降低原料中CL含量的同時(shí)增加發(fā)酵底物量，促進(jìn)乳酸菌等有益菌發(fā)酵繁殖。表2中NDF和ADF含量的變化也說明了這一點(diǎn)。莊蘇等[14]認(rèn)為纖維素酶處理顯著降低了青貯料中NDF和ADF含量，并顯著增加WSC含量。薛艷林[15]認(rèn)為青貯發(fā)酵過程中的微生物和酶類物質(zhì)能降解半纖維素為微生物可直接利用的WSC，經(jīng)青貯發(fā)酵后的NDF含量顯著降低。倪奎奎等[16]認(rèn)為纖維素酶的添加顯著降低了麥秸青貯料的NDF和ADF含量。Amvan等[17]也認(rèn)為添加纖維素酶能使青貯牧草的NDF和ADF含量顯著降低。另一方面，纖維素酶的加入促進(jìn)了ADL的分解，弱化了其對纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物的束縛，有利于提高混貯料在動物瘤胃中的生物降解效率或能源轉(zhuǎn)化效率。王曉娟等[18]認(rèn)為ADL對CL和HC等碳水化合物既有物理性阻礙，又有牢固共價(jià)鍵束縛，使其對酶或微生物作用有屏障保護(hù)?？傊?，加入纖維素酶有利于保存WSC、HC和HoC等組分，顯著降低NDF、ADF等組分含量，這與Sun等[19]研究結(jié)果一致。

3.2 纖維素酶對混貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

混貯過程中快速生成乳酸和pH迅速下降是青貯成功并獲得高品質(zhì)青貯料的關(guān)鍵因素。青貯發(fā)酵過程中除生成較高含量的乳酸外，還會生成乙酸、丙酸和丁酸等小分子有機(jī)酸，但pH下降主要緣于乳酸的累積。一般認(rèn)為，發(fā)酵良好的青貯料中，乳酸含量應(yīng)占到總有機(jī)酸的60%以上，乙酸含量占1%～4%，丙酸含量占1.5%左右，丁酸含量則接近于0，乳酸/乙酸(LA/AA)值應(yīng)高于2∶1[20]。試驗(yàn)中，3個(gè)處理組均符合上述良好青貯條件，但與無添加劑ME組相比，CA和CB組pH值下降速度明顯加快，且高劑量CB組LA/AA和乳酸占總有機(jī)酸比例(LA/TOA)均明顯高于CA和ME組，說明高劑量纖維素酶的添加有利于強(qiáng)化乳酸發(fā)酵，提高乳酸生成比重，這與高劑量纖維素酶能有效提升乳酸菌相對豐度結(jié)果一致。Selmer-olsen[9]認(rèn)為用纖維素酶處理的梯牧草、牛毛草和紅三葉草混合青貯，顯著降低了青貯pH，增加了乳酸含量。Tengerdy等[22]研究也發(fā)現(xiàn)纖維素酶的添加能顯著降低青貯料的pH值，增加乳酸和WSC含量，本研究結(jié)論與其一致。另有報(bào)道認(rèn)為，當(dāng)青貯料中乳酸/乙酸高于3時(shí)，一般是同型發(fā)酵乳酸菌占主導(dǎo)地位[23]。推測試驗(yàn)中3個(gè)處理組可能均為同型乳酸發(fā)酵。

氨態(tài)氮主要是微生物或酶分解蛋白質(zhì)、氨基酸和含氮物質(zhì)所生成， AN/TN值越大，說明蛋白質(zhì)分解程度越高，青貯質(zhì)量越差。試驗(yàn)中加入纖維素酶后，CA和CB組均使AN/TN值顯著降低(P<0.05)，且遠(yuǎn)低于優(yōu)質(zhì)青貯料的推薦值10%，說明纖維素酶的添加有助于減少蛋白質(zhì)損失。Dean等[24]也認(rèn)為青貯料中添加纖維素酶能夠獲得較低的pH和NH3-N含量，從而提高青貯品質(zhì)。但從粗蛋白角度分析，貯存30 d時(shí)3個(gè)處理組中粗蛋白含量均顯著下降，且含量不足1%，原因可能是因?yàn)樵现写值鞍自谥参锏鞍酌概c微生物的共同作用下先分解為肽氮和游離氨基酸氮，其中一小部分氨基酸進(jìn)一步被降解成氨、有機(jī)酸及生物胺等產(chǎn)物。尤其貯存體系pH值低于4.2時(shí)蛋白質(zhì)一般分解為較穩(wěn)定的氨基酸[25]，并不會繼續(xù)降解為氨等產(chǎn)物，所以出現(xiàn)了CP含量很少而AN/TN值不高的狀態(tài)，推測試驗(yàn)中蛋白質(zhì)主要分解為肽或者氨基酸產(chǎn)物。

另外，貯存60 d期間3個(gè)處理組的感官品質(zhì)均為優(yōu)等，但V-score評分結(jié)果卻為尚可。出現(xiàn)這種差異的原因可能是感官評定存在一定的主觀性，個(gè)人評價(jià)之間存在差異，而V-score評分則根據(jù)氨態(tài)氮含量以及乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)酸含量來確定發(fā)酵品質(zhì)，較為客觀。Filya[26]認(rèn)為優(yōu)質(zhì)青貯料應(yīng)具有較高含量的乳酸和較低的丁酸、氨態(tài)氮含量及pH值，試驗(yàn)中3個(gè)處理組均符合優(yōu)質(zhì)青貯標(biāo)準(zhǔn)，且CA和CB組品質(zhì)更好?？傊w維素酶的加入改善了秸稈與白菜的混貯發(fā)酵品質(zhì)，有利于乳酸生成，降低pH和NH3-N含量，高劑量纖維素酶(0.3%)對混貯發(fā)酵品質(zhì)的促進(jìn)效果更明顯。

3.3 纖維素酶對微生物菌群的影響

貯存過程中感官品質(zhì)、化學(xué)組分及發(fā)酵品質(zhì)的變化本質(zhì)上是微生物菌群共同作用的結(jié)果。從門水平細(xì)菌群落分析，原料DCS主要包含Proteobacteria和Firmicutes，CW主要包含Proteobacteria和Bacteroidetes，混合貯存60 d期間始終以Proteobacteria和Firmicutes為主。加入纖維素酶后，無論劑量高低，仍以Proteobacteria和Firmicutes為主，但高劑量纖維素酶CB組的Firmicutes豐度明顯提高，而Proteobacteria豐度在CA和CB組則明顯下降。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌能降解大分子化合物，如纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)等有機(jī)組分[12]，而Firmicutes細(xì)菌可產(chǎn)芽孢，所以推測加入纖維素酶的CA和CB組ADF、NDF及CP含量的顯著降低也可能是由Firmicutes引起的。

從屬水平細(xì)菌群落可知，CW中乳酸細(xì)菌含量不足1%，DCS中有約28%左右的乳酸細(xì)菌，二者混貯具有乳酸細(xì)菌互補(bǔ)性，能使混貯發(fā)酵過程快速啟動，并抑制腐敗菌生長。試驗(yàn)中ME組包括Enterobacter、Lactobacillus、Paralactobacillus、Pediococcus、Lactococcus、Carnobacterium和Serratia等近30個(gè)屬，細(xì)菌豐富程度較高，與其他學(xué)者報(bào)道結(jié)果有一致也有差異。Dunière等[27]發(fā)現(xiàn)玉米青貯中主要細(xì)菌包括Paenibacillus、Flavobacteriaceae、Sphingomonas、Exiguobacterium、root nodule bacteria、Acinetobacter和Buchnera等。劉晶晶等[28]發(fā)現(xiàn)青貯柳枝稷中主要包括Lactobacillus、Enterobacter、Enterococcus、Clostridium、Aerococcus、Sporolactobacillus、Lachnospira、Ruminococcaceae、Weissella、Pantoea和Serratia等。加入纖維素酶后，CA和CB組主要的屬水平細(xì)菌與ME組基本一致，但加入纖維素酶后乳酸菌屬的相對豐度大大提高，并使有害菌Enterobacter豐度明顯降低，尤其高劑量纖維素酶使CB組乳酸細(xì)菌豐度高達(dá)55.70%。正是這些乳酸細(xì)菌的快速繁殖和主要代謝物乳酸的積累使貯存過程pH快速下降，從而抑制腐敗細(xì)菌，促進(jìn)了有機(jī)組分的保存，這與發(fā)酵品質(zhì)、化學(xué)組分變化結(jié)果一致。

乳酸菌是影響青貯品質(zhì)好壞的主要有益微生物。Cai等[21]發(fā)現(xiàn)從青貯水稻中分離得到161株乳酸菌包含Lactococcus、Lactobacillus、Leuconostoc、Enterococcus和Pediococcus，這些菌株主要為同型發(fā)酵乳酸菌，占總數(shù)的66.00%。乳酸菌多樣性結(jié)果顯示，原料中乳酸菌主要為Carnobacterium，但DCS和CW混貯后的Carnobacterium所占的比例不足10%，逐漸演變成Paralactobacillus和Lactobacillus為主要乳酸細(xì)菌。加入纖維素酶后，CA和CB組中仍以Paralactobacillus和Lactobacillus為主，且CA組的Paralactobacillus始終高于CB組，而CB組Lactobacillus始終高于CA組，這可能是纖維素酶添加劑量高低所致，但總體上貯存期間均以耐酸性能較好的桿菌為主。

4 結(jié)論

加入纖維素酶有效促進(jìn)了干玉米秸稈與白菜廢棄物的混貯發(fā)酵和乳酸生成，使pH值快速下降，從而抑制有害菌生長。低劑量纖維素酶有利于ADL組分的降解以及WSC、HC和HoC等組分的保存，高劑量纖維素酶有助于改善發(fā)酵品質(zhì)，但綜合考慮有機(jī)組分保存和酶制劑成本等因素，建議選擇低劑量纖維素酶(0.1%)。

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