柴胡疏肝散對(duì)代謝綜合征大鼠抗動(dòng)脈硬化的作用機(jī)制

林黃果，劉淑玲，趙 帥，陳伯鈞

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣州 510120）

代謝綜合征（MS）是指包括糖代謝異常、高血壓、腹型肥胖的一種臨床綜合征[1]。目前國(guó)內(nèi)MS患病率高達(dá)14%～17%，且呈上升和年輕化的趨勢(shì)[2-3]。MS可以加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，最終發(fā)展為心腦血管疾病[4-5]。研究[6-10]表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)中的超氧化物歧化酶（SOD）分泌減少、丙二醛（MDA）分泌增加，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解的基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）分泌增加、而抑制MMP-9活性的組織金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）表達(dá)減少等均介導(dǎo)MS-動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展。中醫(yī)認(rèn)為，肝郁脾虛是MS的主要病機(jī)[11]，柴胡疏肝散具有疏肝理氣的作用，臨床上應(yīng)用于治療代謝綜合征具有一定的療效，但是關(guān)于其機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制了大鼠MS模型[12]，觀察柴胡疏肝散對(duì)代謝綜合征大鼠體質(zhì)量、血脂、空腹血糖（FBG）、尾動(dòng)脈收縮壓、SOD、MDA、MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平的影響和大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化，探討其抗動(dòng)脈硬化的作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠40只，雄性，SPF級(jí)，4周齡，體質(zhì)量（80±10）g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2011-0015；基礎(chǔ)飼料；高糖高脂高鹽飼料（配方：45%基礎(chǔ)飼料，20%豬油，5%丙基硫氧嘧啶，25%蔗糖，5%食鹽）；以上基礎(chǔ)飼料和高糖高脂高鹽飼料均由廣州花都東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SYXK（粵）2014-0023。

1.1.2 藥品 柴胡疏肝散（柴胡12 g，陳皮12 g，川芎10 g，香附10 g，枳殼10 g，白芍10 g，炙甘草6 g），由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供，經(jīng)藥劑師鑒定為純正中藥材。煎煮方法：將該方加8倍的水將中藥浸泡30 min后煎煮40 min，藥渣再加6倍量的水煎煮30 min，2次濾液混合后置于100 ℃環(huán)境濃縮至100 mL（相當(dāng)于原藥6 g/mL），4 ℃下保存。二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格：0.5 g/片，20片/盒，批號(hào)20170102）；生理鹽水（上海百特醫(yī)療用品有限公司，規(guī)格：100 mL/瓶，批號(hào)：201170201）。

1.1.3 試劑與儀器 SOD、MDA、MMP-9、TIMP-1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELLISA）分析試劑盒（美國(guó)賽默飛公司）；VL-220R 高速冷凍離心機(jī)（湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；FA1004B電子分析天平（上海平軒科學(xué)儀器有限公司）；BP-98A尾動(dòng)血壓測(cè)量?jī)x（森西萬(wàn)通科技北京有限公司）；羅氏血糖儀（羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司）；AU5800全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模和給藥 40只SHR大鼠造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，適應(yīng)性喂養(yǎng)期間給予基礎(chǔ)飼料進(jìn)食，自由進(jìn)水，待其代謝狀態(tài)穩(wěn)定后分為空白組（n = 10）、模型組（n = 10）、二甲雙胍組（n = 10）和柴胡疏肝散組（n =10）?？瞻捉M喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，模型組、二甲雙胍組和柴胡疏肝散組喂養(yǎng)高糖高脂高鹽飼料，所有大鼠自由飲用蒸餾水，造模時(shí)間為8周。每4周檢測(cè)大鼠的體質(zhì)量、血壓、空腹血糖各1次。肥胖、高血壓、空腹血糖升高判斷為MS建立成功。8周后，將MS模型建立成功的大鼠繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)研究，MS模型建立不成功的大鼠予以剔除。模型組、二甲雙胍組和柴胡疏肝散組繼續(xù)高脂高糖高鹽飼料喂養(yǎng)，空白組繼續(xù)基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。大鼠給藥量按照“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比值表”[13]計(jì)算，柴胡疏肝散組給予柴胡疏肝散16 g/（kg·d）灌胃；二甲雙胍組給予鹽酸二甲雙胍70 mg/（kg·d）加0.9%氯化鈉配制成12 mg/mL的濃度灌胃；空白組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，共4周。

1.2.2 觀察指標(biāo) 禁食不禁飲12 h后經(jīng)腹腔注射麻醉10%水合氯醛溶液（3 mL/kg），頸總動(dòng)脈取血10 mL，3 000 r/min，離心20 min后取血清，- 70 ℃保存。ELISA法檢測(cè)大鼠血清SOD、MDA、MMP-9、TIMP-1的水平；羅氏血糖儀測(cè)定血糖水平；尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x測(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血脂水平；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)動(dòng)SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用one-way ANOVA法檢驗(yàn)，組間比較采用LSD-t法檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、尾動(dòng)脈收縮壓水平比較 見表1。

2.2 4組大鼠血脂水平比較 見表2。

2.3 4組大鼠SOD、MDA水平比較 見表3。

2.4 4組大鼠MMP-9、TIMP-1水平比較 見表4。

表1 4組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、尾動(dòng)脈收縮壓水平比較（ ，n = 10）

表1 4組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、尾動(dòng)脈收縮壓水平比較（ ，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與各組第8周比較，▲P＜0.05

組 別 體質(zhì)量/g 空腹血糖/（mmol/L） 尾動(dòng)脈收縮壓/mmHg 8周 12周 8周 12周 8周 12周空白組 412.12±18.95 508.93±64.87 5.46±2.31 5.45±1.46 121.35±13.62 121.62±12.84模型組 519.94±32.65# 657.92±34.21#▲ 8.64±2.46# 9.87±2.71#▲ 150.32±15.68# 157.32±15.25#▲二甲雙胍組 525.63±57.25# 573.51±67.26#△▲ 8.78±3.18# 6.85±8.12#△▲ 149.82±14.28# 131.85±13.82#△▲柴胡疏肝散組 514.53±89.67# 610.84±71.82#△▲ 9.12±1.48# 7.12±1.82#△▲ 150.76±13.15# 138.78±17.26#△▲

表2 4組大鼠血脂水平比較（ ，n = 10） mmol/L

表2 4組大鼠血脂水平比較（ ，n = 10） mmol/L

注：與空白組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與各組第8周比較，▲P＜0.05

組 別 TC TG HDL-C LDL-C 8周 12周 8周 12周 8周 12周 8周 12周空白組 1.41±0.64 1.46±0.47 0.71±0.17 0.89±0.24 1.12±0.25 1.06±0.27 1.28±0.35 1.34±0.27模型組 3.12±1.02#5.13±0.86#▲ 1.21±0.38# 1.95±0.71#▲ 0.81±0.48#0.48±0.13#▲ 2.41±0.68#3.18±0.39#▲二甲雙胍組 3.02±1.41#3.68±0.79#△▲ 1.19±0.43# 1.31±0.47#△▲ 0.79±0.41#0.71±0.24#△▲ 2.38±0.67#1.97±0.63#△▲柴胡疏肝散組 4.69±0.86#3.42±1.07#△▲ 1.37±0.21# 1.17±0.31#△▲ 0.68±0.27#0.75±0.18#△▲ 2.12±0.41#1.64±0.28#△▲

表3 4組大鼠SOD、MDA結(jié)果比較（ ，n = 10）

表3 4組大鼠SOD、MDA結(jié)果比較（ ，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與各組第8周比較，▲P＜0.05

組 別SOD/（U/mL）MDA/（mmol/L）8周 12周 8周 12周空白組 218.63±12.54 224.31±17.54 5.03±1.12 5.14±1.57模型組 186.42±18.63# 162.74±17.68#▲ 9.34±2.05# 13.36±2.78#▲二甲雙胍組 190.37±21.05# 201.36±21.35#△▲ 9.18±1.72# 7.31±1.34#△▲柴胡疏肝散組 187.33±17.52# 197.36±18.69#△▲ 9.11±1.67# 7.46±2.14#△▲

表4 4組大鼠MMP-9、TIMP-1結(jié)果比較（ ，n = 10） mmol/L

表4 4組大鼠MMP-9、TIMP-1結(jié)果比較（ ，n = 10） mmol/L

注：與空白組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與各組第8周比較，▲P＜0.05

組 別 MMP-9 TIMP-1 8周 12周 8周 12周空白組 0.23±0.08 0.24±0.04 7.63±1.03 7.67±0.64模型組 2.16±0.43# 4.36±0.38#▲ 4.34±0.68# 2.68±1.03#▲二甲雙胍組 2.23±0.41# 1.26±0.34#△▲ 4.41±1.22# 5.27±1.24#△▲柴胡疏肝散組 2.21±0.62# 1.32±0.29#△▲ 4.39±1.37# 5.19±1.42#△▲

2.5 4組大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化 第8周時(shí)，空白組細(xì)胞外形和細(xì)胞核規(guī)則，細(xì)胞周圍未見結(jié)締組織增生。而模型組、二甲雙胍組和柴胡疏肝散組細(xì)胞核不規(guī)則，細(xì)胞膜下見吞飲小泡，細(xì)胞周圍結(jié)締組織增生明顯。

第12周時(shí)，空白組細(xì)胞外形和細(xì)胞核規(guī)則，細(xì)胞周圍未見結(jié)締組織增生；模型組細(xì)胞明顯變形，細(xì)胞核不規(guī)則，細(xì)胞膜內(nèi)大量的吞飲小泡，細(xì)胞周圍結(jié)締組織大量增生。而二甲雙胍組和模型組可見脂滴，未見吞飲小泡，結(jié)締組織增生明顯改善。

3 討論

MS是多種心腦血管疾病聚集的一種病理狀態(tài)，其血脂異常、高血壓、胰島素抵抗、糖耐量異常、促血栓形成狀態(tài)等都是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14-17]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，代謝綜合征的主要病因病機(jī)為肝氣郁滯，肝主疏泄，肝氣郁滯，不能疏泄，郁而化火，內(nèi)熱自生，灼液成痰，痰濁阻滯。且肝郁乘脾，脾不健運(yùn)，津液運(yùn)化異常，聚液成痰，發(fā)為代謝綜合征，痰瘀阻滯進(jìn)一步發(fā)展，發(fā)為動(dòng)脈粥樣硬化。柴胡疏肝散出自《醫(yī)學(xué)統(tǒng)旨》，具有疏肝解郁的功效。方中柴胡、芍藥疏肝解郁為主，香附、枳殼、陳皮以理氣滯，川芎以活其血，甘草以和中緩?fù)?，全方共奏疏肝解郁之功?/p>

本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖高鹽喂養(yǎng)方法建立代謝綜合征大鼠模型，造模成功后給予相應(yīng)的藥物干預(yù)4周。干預(yù)后，與空白組比較，模型組體質(zhì)量、尾動(dòng)脈收縮壓、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、MDA、MMP-9水平繼續(xù)升高，HDL-C、SOD、TIMP-1水平繼續(xù)降低，組織病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜內(nèi)吞飲小泡和細(xì)胞外結(jié)締組織繼續(xù)增加。與模型組比較，柴胡疏肝散組體質(zhì)量、尾動(dòng)脈收縮壓、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、MDA、MMP-9水平明顯降低，HDL-C、SOD、TIMP-1水平明顯升高，組織病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜內(nèi)無(wú)吞飲小泡和細(xì)胞外結(jié)締組織增生減少。

綜上所述，柴胡疏肝散可能通過(guò)抑制MMP-9、MDA的表達(dá)和促進(jìn)SOD、TIMP-1的表達(dá)從而延緩代謝綜合征-動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，發(fā)揮治療代謝綜合征和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

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