飼料中添加β-葡聚糖對虹鱒部分生長指標(biāo)和血液生理指標(biāo)的影響*

王 藝 紀(jì)利芹 孫國祥 劉 鷹 王順奎

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)設(shè)施養(yǎng)殖與裝備工程技術(shù)研究中心 大連 116023；2. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 大連 116023；3. 中國科學(xué)院海洋研究所 青島 266071；4. 山東金城生物藥業(yè)有限公司 淄博 255000；5. 山東東方海洋科技股份有限公司 煙臺 264000)

虹鱒(Oncorhynchus mykiss)是冷水性的魚類，原產(chǎn)于美洲西部海岸，但因其有調(diào)控滲透壓的能力，亦可在普通淡水中正常生存，現(xiàn)在世界范圍內(nèi)分布廣泛(貝念湘等, 1995)。虹鱒肉嫩、刺少、味美、可食率高，可熟食亦可做生魚片食用。國際市場上將虹鱒列為高檔商品魚，是利用冷水資源的優(yōu)良魚種。近年來，隨著國內(nèi)養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高，虹鱒養(yǎng)殖病害頻發(fā)，嚴(yán)重影響了產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展(方允中等, 2003)。

為增強(qiáng)魚體體質(zhì)和提高抗病能力，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了水產(chǎn)動物免疫增強(qiáng)劑的研究工作(Montero et al,2001)。β-葡聚糖是一種存在于大多數(shù)微生物中具有增強(qiáng)免疫力作用的大分子多糖(Anderson et al, 1996)，具有抑制腫瘤活性、抵抗炎癥、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能(王永宏, 2013; 李萬坤等, 2007; 曹敏等,2011)。Nan等(2010)研究表明，β-葡聚糖能提高魚類機(jī)體免疫力，促進(jìn)生長。Mai等(2007)發(fā)現(xiàn)，口服β-葡聚糖能顯著提高大黃魚(Pseudosciaena crocea)的生長速度。凌統(tǒng)等(2005)發(fā)現(xiàn)，投喂β-葡聚糖能促進(jìn)不同種魚的生長并降低死亡率。Selvaraj等(2005)發(fā)現(xiàn)，不同劑量的 β-葡聚糖可以顯著提高鯉魚(Cyprinus carpio)的白細(xì)胞數(shù)量，尤其是嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量增加最顯著。隨著對β-葡聚糖使用方法、作用效果研究的進(jìn)一步深入，β-葡聚糖必將成為提高水生動物免疫力和控制水生動物疾病的重要途徑。

本研究通過在飼料中添加不同濃度的β-葡聚糖，對喂養(yǎng) 30 d后的虹鱒生長及血液生理指標(biāo)進(jìn)行檢測，探討 β-葡聚糖對虹鱒生長性能和部分血液生理指標(biāo)的影響，進(jìn)而篩選出β-葡聚糖的適宜添加濃度，為全面研究 β-葡聚糖對魚體生長及免疫功能的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及養(yǎng)殖管理

實驗于山東東方海洋科技股份有限公司煙臺開發(fā)區(qū)分公司的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)開展，共分 4個實驗組，每組3個平行，共用12個混凝土養(yǎng)殖池。實驗對象選用體質(zhì)健壯、大小均勻、體重為(454±52) g的虹鱒，每池虹鱒 1200尾，初始放養(yǎng)密度為(6.05±0.25) kg/m3。養(yǎng)殖池的長×寬×水深為5 m×5 m×4 m，有效養(yǎng)殖水體約為80 m3，養(yǎng)殖期間，水溫為11～13℃，溶解氧飽和度為70%～74%，pH為7.6～7.9，總氨氮濃度為0～0.2 mg/L，亞硝酸鹽濃度為0～0.1 mg/L。每天投喂5次，日投飼量為魚體重的2%～3%，養(yǎng)殖實驗持續(xù)30 d。

1.2 實驗飼料

實驗用 β-葡聚糖為 β-1,3-葡聚糖和 β-1,6-葡聚糖混合物，其中，β-1,3-葡聚糖含量為 90%，購買于湖北安琪酵母股份有限公司，純度為90%。實驗基礎(chǔ)飼料購買自北京漢業(yè)科技有限公司，配方見表1。在基礎(chǔ)飼料中添加 3種不同劑量的 β-葡聚糖，制備成 3種不同 β-葡聚糖濃度的實驗飼料(0.05%、0.1%和0.2%)，不添加葡聚糖的基礎(chǔ)飼料為對照飼料。

1.3 養(yǎng)殖實驗

養(yǎng)殖實驗在循環(huán)水養(yǎng)殖生產(chǎn)系統(tǒng)12個80 m3的養(yǎng)殖池內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)β-葡聚糖添加量將12個養(yǎng)殖池隨機(jī)分為 4個組(0、0.05%、0.1%和 0.2%)，每組 3個平行。其中，標(biāo)記無β-葡聚糖添加的基礎(chǔ)飼料為對照組(A組)，0.05%葡聚糖添加組為B組，0.1%葡聚糖添加組為C組，0.2%葡聚糖添加組為D組。實驗開始前，所有組別投喂不含β-葡聚糖的對照飼料，實驗開始后，對相應(yīng)池子的虹鱒投喂對應(yīng)飼料，投喂頻率及對應(yīng)投喂時間分別為6次/d (04:00、08:00、12:00、16:00、20:00和24:00)，日投飼量為魚體重的2%～3%，每次投喂結(jié)束20 min后排出殘餌，共計投喂30 d。

表1 基礎(chǔ)飼料配方Tab.1 Formula of the basal diet

1.4 樣品采集及處理

養(yǎng)殖實驗開始前1 d停食，每個養(yǎng)殖池隨機(jī)撈取200尾虹鱒，采用濃度為 200 mg/L的 MS-222麻醉60 s后抽樣稱重，記錄虹鱒的重量。養(yǎng)殖30 d后，停食1 d，每個養(yǎng)殖池隨機(jī)撈取200尾，麻醉后抽樣稱重，記錄養(yǎng)殖實驗結(jié)束后虹鱒的重量。

每個池子隨機(jī)留取虹鱒5尾作采樣魚，分兩步進(jìn)行尾靜脈采血，第一步用烘烤過的注射器在尾靜脈取血0.5 ml，用于血液生理指標(biāo)的測定，注射器內(nèi)含有肝素鈉，防止血液凝固；第二步用 1 ml普通注射器于魚尾柄動脈采血5 ml以上，注射器內(nèi)不加抗凝劑，在4℃冰箱靜置5 h后，用離心機(jī)4℃、12000 r/min、離心20 min制備血清，血清移入–80℃保存。采血后解剖魚體，取出肝臟、肌肉、腎臟、頭腎、腦、心臟、脾臟、胃、腸和性腺等組織用液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 生長指標(biāo)測定

增重率(Weight gain rate, WGR)(%)=(Wt–W0)/W0×100

特定生長率(Specific growth rate, SGR)(%/d)=100×(lnWt–lnW0)/t

肝體比(Hepotosomatic index, HIS)=Wg/W

肥滿度(Condition factor, CF)=W×100/L3

式中，W0為實驗開始時魚重，Wt為t時刻魚重，t為養(yǎng)殖天數(shù)(d)，Wg為魚肝臟重(g)，W為魚體重(g)；L為魚標(biāo)準(zhǔn)體長(cm)。

1.6 血清生理指標(biāo)的分析

采用BC-1800全自動血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，通過比色法測量血紅蛋白濃度，用電阻抗法檢測紅細(xì)胞、白細(xì)胞的數(shù)目以及體積分布，分析儀自動計算出相應(yīng)參數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包中的單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏多重范圍比較進(jìn)行分析，當(dāng)不同處理之間有顯著差異(P＜0.05)時，用Tukey檢驗比較不同處理間的平均值。P＜0.05表示有顯著差異，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 β-葡聚糖對虹鱒生長性能的影響

由表2可以看出，投喂30 d后，0.05%葡聚糖添加組的WGR(93.2%)最低，0.05%和0.1%葡聚糖添加組差異不顯著(P＞0.05)，但這 2組的 WGR都顯著低于對照組(P＜0.05)，0.2% 葡聚糖添加組WGR最高，為104.3%，顯著高于其他實驗組及對照組(P＜0.05)。投喂30 d后，0.2%葡聚糖添加組SGR顯著高于其他組(P＜0.05)，0.05%和 0.1%組與對照組相比，無顯著差異(P＞0.05)。投喂 30 d后，0.2%葡聚糖添加組HIS(1.5%)最高，與其他實驗組及對照組的 HIS差異顯著(P＜0.05)。投喂30 d后，0.05%葡聚糖添加組CF(1.75 g/cm2)最低，顯著低于其他實驗組及對照組。各添加組的CF隨著葡聚糖投喂量的增多而升高，其中，最大值出現(xiàn)于0.2%葡聚糖添加組，為2.26 g/cm2，但各添加組CF均顯著低于對照組(P＜0.05)。

表2 飼料中添加β-葡聚糖對虹鱒生長性能的影響Tab.2 Effects of dietary β-glucan on the growth of rainbow trout (Mean±SD, n=5)

2.2 β-葡聚糖對虹鱒血清生理指標(biāo)的影響

由表3可知，投喂30 d后，對照組白細(xì)胞數(shù)量最低，為2.44×1011cell/L，與0.2%葡聚糖組差異不顯著(P＞0.05)，與 0.05%和 0.1%葡聚糖組差異顯著(P＜0.05)。白細(xì)胞數(shù)量最高值出現(xiàn)在0.05%葡聚糖組，為 2.76×1011cell/L，與 0.1%葡聚糖組差異不顯著(P＞0.05)，與0.2%葡聚糖組及對照組差異顯著(P＜0.05)。投喂30 d后，對照組的紅細(xì)胞數(shù)量最低，為1.18×1011cell/L，顯著低于各實驗組(P＜0.05)。0.1%葡聚糖組的紅細(xì)胞數(shù)量最高，為1.9×1011cell/L，顯著高于其他實驗組及對照組(P＜0.05)。投喂30 d后，投喂30 d天后，對照組血紅蛋白濃度最低，為120.5 g/L，顯著低于各實驗組(P＜0.05)。0.1%葡聚糖組血紅蛋白濃度最高，為146.5 g/L，顯著高于其他實驗組及對照組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 飼料中添加β-葡聚糖對虹鱒生長性能的影響

本研究中，投喂30 d后，0.2%葡聚糖添加組增重率最高，顯著高于其他實驗組及對照組(P＜0.05)。0.2%葡聚糖添加組的特定生長率顯著高于其他組(P＜0.05)，0.05%和 0.1%組與對照組相比，無顯著差異(P＞0.05)。0.2%葡聚糖添加組肝體比最高，顯著高于其他實驗組及對照組(P＜0.05)。各添加組的肥滿度隨葡聚糖投喂量的增多而升高，其中，最大值出現(xiàn)于0.2%葡聚糖添加組，但各添加組肥滿度均顯著低于對照組(P＜0.05)。由此可見，飼料中添加葡聚糖在一定程度上有助于虹鱒的生長。這一結(jié)果與Cook等(2003)在紅鯛魚(Pagrus auratus)及Misra等(2006)在南亞野鯪(Labeo rohita)中的結(jié)果一致。張耀武等(2006)和陳云波等(2002)研究發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖添加量為0.4%時，可以顯著提高錦鯉(Cyprinus carpio koi)和南美白對蝦(Penaeus vannamei)增重率。周歧存等(2004)發(fā)現(xiàn)，飼料中添加免疫多糖能顯著降低南美白對蝦的飼料系數(shù)，提高對蝦的蛋白質(zhì)效率。以上報道與本研究的結(jié)果均說明，β-葡聚糖對水生動物具有促進(jìn)生長的作用。

表3 飼料中添加β-葡聚糖對虹鱒血液生理指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of dietary β-glucan on the blood physiological parameters of rainbow trout (Mean±SD, n=5)

一般認(rèn)為，β-葡聚糖不具有直接營養(yǎng)的作用，其促進(jìn)生長的作用與魚體對疾病抵抗能力的增強(qiáng)緊密相關(guān)(張健, 2012; 吳春玉等, 2013)。它可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫屏障，從而減少機(jī)體免疫應(yīng)答所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)，并且降低免疫應(yīng)答中的產(chǎn)物對攝食以及生長的抑制作用，從而促進(jìn)了動物的生長(張華等, 2009; 吳春玉等, 2013)。但Takahashi等(1999)認(rèn)為，飼料中能被利用的營養(yǎng)成分的量是一定的，若要提高免疫功能，則飼料中營養(yǎng)成分的大部分須用于免疫器官及抗體的合成，而生長性能的提高，需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)用于生長。因此，提高動物生產(chǎn)性能和增強(qiáng)動物免疫功能是矛盾的。而Klasing(1998)認(rèn)為，免疫系統(tǒng)所需營養(yǎng)物質(zhì)與生長所需相比微不足道，因此，并非營養(yǎng)物質(zhì)的再分配導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能的下降；另一方面，免疫增強(qiáng)劑的免疫增強(qiáng)作用與疾病感染引起的免疫應(yīng)激不同，后者往往伴隨消耗營養(yǎng)的全身反應(yīng)和體內(nèi)代謝、營養(yǎng)發(fā)生變化等副作用，而免疫增強(qiáng)劑僅作用于免疫系統(tǒng)，不消耗能量及影響采食量，這與周艷萍(2008)的結(jié)果一致。因此，推測免疫增強(qiáng)劑不會造成動物生產(chǎn)性能的下降。與此同時，對β-葡聚糖促魚蝦生長作用的結(jié)果也存在不同的報道。Verlhac等(1996)認(rèn)為，添加 β-葡聚糖對于凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)和虹鱒促生長效果不明顯。余水法等(2006)認(rèn)為，葡聚糖雖然可以通過提高對蝦的抗應(yīng)激能力、促進(jìn)其生長，但對河蟹(Eriocheir sinensis)的促生長作用并不明顯，這與季高華等(2004)對中華鱉(Trionyx sinensis)幼鱉的研究結(jié)果一致。因此，β-葡聚糖的促生長作用還存在爭議，這可能與不同來源的β-葡聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)差異影響其功效的發(fā)揮有關(guān)(Skjermo et al,2006; 蔡成崗等, 2011)。

3.2 飼料中添加β-葡聚糖對虹鱒血液生理指標(biāo)的影響

血液是動物體內(nèi)重要的組織器官，主要有交換、運輸和防御三大功能(姚泰, 2002)，是體內(nèi)各組織器官之間以及體內(nèi)組織器官與外界環(huán)境之間的橋梁，營養(yǎng)物質(zhì)通過血液運輸?shù)礁鹘M織器官，代謝廢物也通過血液運至排泄器官排出體外。當(dāng)動物體受到外界因子影響而發(fā)生生理或病理變化時，這些變化會在血液指標(biāo)中反映出來，因此，血液指標(biāo)被廣泛用來評價動物的代謝、營養(yǎng)狀況及對環(huán)境的適應(yīng)狀況(何福林等,2007; 周玉等, 2001; 吳春玉等, 2013; 蔡勝昌等,2015)，而血液中某種血細(xì)胞的含量通常與其生理功能相關(guān)(白東清等, 2010)。

白細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，具有吞噬、產(chǎn)生抗體、傳遞免疫信息等功能(李佩國等, 2000;趙心宇等, 2010)，通過血液循環(huán)系統(tǒng)遍及全身各器官。體內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)可以粗略反映包括骨髓成分在內(nèi)的免疫系統(tǒng)重量，反映機(jī)體免疫功能強(qiáng)弱(張雙紅等,2010)。白細(xì)胞的總數(shù)直接反映機(jī)體的狀態(tài)，其總數(shù)在血液中保持相對恒定(馬美湖, 1998)。劉至治等(2006)研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼料中添加β-葡聚糖，能不同程度地增加中華鱉血液中白細(xì)胞的吞噬活性，從而改善中華鱉的免疫能力。Muona等(1992)研究表明，血漿中溶菌酶活性變化與循環(huán)系統(tǒng)中白細(xì)胞數(shù)目變化具有相關(guān)性，白細(xì)胞數(shù)目多，溶菌酶活性就增加。這也同張雙紅等(2010)以及汪開毓等(2011)的研究結(jié)果一致。本研究中β-葡聚糖添加組虹鱒的白細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組，可能與溶菌酶含量的變化有關(guān)。

紅細(xì)胞數(shù)量可以反映出生物體對氧氣的運輸、攝取以及消耗能力。紅細(xì)胞數(shù)量正常情況下保持相對穩(wěn)定，但環(huán)境變化會造成紅細(xì)胞數(shù)量的變化(林浩然,1999)。Collazos等(1998)認(rèn)為，季節(jié)變化、溶解氧、健康狀況、運動強(qiáng)度、性腺發(fā)育的成熟度和餌料質(zhì)量等都會使紅細(xì)胞數(shù)量發(fā)生變化。Siegel等(1981)認(rèn)為，紅細(xì)胞除具有攜氧、運輸氣體等功能外，還具有運載和清除循環(huán)免疫復(fù)合物等重要的免疫功能。紅細(xì)胞是血循環(huán)中最重要的固有免疫細(xì)胞，有識別、粘附、濃縮、殺傷抗原、清除循環(huán)免疫復(fù)合物的能力，參與機(jī)體免疫調(diào)控，并有完整的自我調(diào)控系統(tǒng)(郭峰等,2002)。劉至治等(2006)發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率與T淋巴細(xì)胞活性E花環(huán)率間存在顯著正相關(guān)，紅細(xì)胞可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞活性，且同樣具有免疫調(diào)節(jié)功能，可在機(jī)體內(nèi)與其他免疫細(xì)胞相互作用形成復(fù)雜的動態(tài)平衡的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而免疫增強(qiáng)劑對魚體整個免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了積極影響，從而使紅細(xì)胞數(shù)量增多，這與本研究結(jié)果一致。本研究中，β-葡聚糖添加組虹鱒的紅細(xì)胞數(shù)量較投喂前有所升高，結(jié)合本研究中 β-葡聚糖能夠?qū)琪V的生長性能和白細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生積極影響，分析其原因，說明β-葡聚糖對虹鱒魚體有生長和免疫調(diào)控等方面的綜合性積極調(diào)節(jié)作用，因而提高了紅細(xì)胞這一固有免疫細(xì)胞的數(shù)量。

血紅蛋白是紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的一種結(jié)合蛋白，可以與氧結(jié)合，將氧氣運送到全身各處。血紅蛋白濃度與紅細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)。本研究中，血紅蛋白濃度較投喂前有所升高，與紅細(xì)胞數(shù)目變化相符。一般來說，血液中的紅細(xì)胞越多，血紅蛋白濃度越大(施泉芳,1991; 張耀騰, 2011)。本研究結(jié)果符合這一規(guī)律，且與王洪海等(2010)關(guān)于葡聚糖在牛中的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

0.05 % β-葡聚糖添加組各生長指標(biāo)的增長均不明顯甚至有所降低。0.2% β-葡聚糖添加組的增重率、特定增長率和肝體比增長較明顯。因此，β-葡聚糖的適宜添加量為 0.2%，有明顯促生長的作用；同樣，通過測定白細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白濃度，發(fā)現(xiàn)0.2% β-葡聚糖對虹鱒血液生理指標(biāo)有綜合性積極調(diào)節(jié)作用。

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