以大黃素為聲敏劑介導(dǎo)聲動(dòng)力療法對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化治療作用的研究

王立民 劉有旺 王恩波 閆兆龍 李雅林

摘 要：目的 探討以大黃素為聲敏劑介導(dǎo)聲動(dòng)力療法對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化治療作用。方法 高脂飲食誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化。將50只ApoE-/-小鼠分為不做任何處理的模型對(duì)照組、以5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照組、大黃素高、中、低劑量介導(dǎo)SDT組，每組 10只。除模型組外，其余各組自高脂4周起，分別進(jìn)行相應(yīng)的聲動(dòng)力治療，隔天1次，于12周處死小鼠。取心臟，制備切片，通過(guò)油紅染色檢測(cè)斑塊大小。取主動(dòng)脈，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶TMP-2、TMP-9和TIMP-1，分析對(duì)斑塊穩(wěn)定性的影響。同樣檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β，分析對(duì)炎癥的影響。結(jié)果 大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法能減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小；顯著增加TIMP-1而降低TMP-2和TMP-9在主動(dòng)脈的表達(dá)。顯著降低促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ而增加抗炎性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β在主動(dòng)脈局部的表達(dá)。結(jié)論 大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法可能通過(guò)降低炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，該方法對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的治療具有積極意義。

關(guān)鍵詞：大黃素；聲敏劑；聲動(dòng)力療法；動(dòng)脈粥樣硬化

中圖分類號(hào)：R364.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.06.019

文章編號(hào)：1006-1959（2018）06-0058-03

Study on the Effect of Emodin on the Treatment of Atherosclerosis in Mice

WANG Li-min，LIU You-wang，WANG En-bo，YAN Zhao-long，LI Ya-lin

（Taishan Medical College，Tai'an 271000，Shandong，China）

Abstract：Objective To investigate the therapeutic effect of emodin as a sonodynamic therapy on atherosclerosis in mice.Methods High fat diet induced atherosclerosis in ApoE-/- mice.50 ApoE-/- mice were divided into a model control group without any treatment，a 5- positive control group mediated by aminolevulinic acid，a large emodin，a medium and low dose SDT group，10 rats in each group.In addition to the model group，other groups were given fat 4 weeks，respectively，sonodynamic treatment，the next day 1， mice were sacrificed at 12 weeks.The heart was taken， the slices were prepared，and the size of the plaque was detected by oil and red staining.The aorta was taken and the matrix metalloproteinases TMP-2，TMP-9 and TIMP-1 were detected by fluorescence quantitative PCR，and the effect of the analysis on the stability of plaque was analyzed.The effects of cytokine TNF-α，IFN- gamma，IL-10 and TGF-β on the inflammation were also detected.Results Rhubarb mediated photodynamic therapy could reduce the size of atherosclerotic plaque，significantly increase TIMP-1 and reduce the expression of TMP-2 and TMP-9 in the aorta.The expression of anti-inflammatory cytokine TNF-α and IFN- gamma was significantly increased and the expression of anti-inflammatory cytokine IL-10 and TGF-β in the aorta was increased.Conclusion Emodin-mediated sonotherapy may play an anti-atherosclerotic role by reducing inflammatory response，which has a positive significance for the treatment of atherosclerosis.

Key words：Emodin；Sound sensitizer；Sonodynamic therapy；Atherosclerosis

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致心腦血管疾病最重要的危險(xiǎn)因素。盡管臨床上通過(guò)應(yīng)用他汀類藥物降低血脂來(lái)防治動(dòng)脈粥樣硬化有一定療效，但效果并不十分理想。聲動(dòng)力療法（sonodynamic therapy，SDT）利用超聲對(duì)組織的較強(qiáng)穿透能力，以聲敏劑介導(dǎo)超聲對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行治療，具有較好的應(yīng)用前景[1]。但開(kāi)發(fā)合適的聲敏劑來(lái)介導(dǎo)SDT是一個(gè)急需解決的問(wèn)題。國(guó)內(nèi)一些研究證明從大黃中提取的大黃素在抗炎、穩(wěn)定AS斑塊等方面具有良好的效果。本研究擬以大黃素為聲敏劑，介導(dǎo)SDT治療小鼠動(dòng)脈粥樣硬化，觀察療效并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑 健康雌性ApoE-/-小鼠，50只，鼠齡 7周齡，體重18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大黃素購(gòu)自陜西西安森弗生物技術(shù)有限公司。油紅O，購(gòu)自Sigma公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。引物為自行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。高脂飼料（21.32%脂肪，0.15%膽固醇）購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 所有ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)將小鼠分為不做任何處理的模型對(duì)照組、以5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照組、大黃素高、中、低劑量介導(dǎo)SDT組，每組 10只。模型組只進(jìn)行高脂飲食12 周。從高脂第4周起，陽(yáng)性對(duì)照組每隔1 d靜脈注射60 mg/kg 5-氨基酮戊酸2 h后，進(jìn)行聲動(dòng)力治療[2]。大黃素高、中、低劑量介導(dǎo)SDT組靜脈分別注射大黃素30、60和90 mg/kg 2 h后，進(jìn)行聲動(dòng)力治療。聲動(dòng)力治療每次聲強(qiáng)為1.5 W/cm2，持續(xù)時(shí)間15 min，持續(xù)8周。

1.2.2心臟冷凍切片 用PBS進(jìn)行心臟灌注，待肝臟顏色變白后，取小鼠的心臟，用OCT包埋后，用冷凍切片機(jī)進(jìn)行冷凍切片，厚度為5 μm。留取主動(dòng)脈根部大約30～40張切片用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用4%多聚甲醛固定15 min，儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3油紅染色及斑塊大小統(tǒng)計(jì)[3] 每只小鼠取10張主動(dòng)脈根部切片，切片平衡至室溫后，用PBS沖洗2～3遍，60%異丙醇分色2 s；油紅O室溫染15 min；再用60%異丙醇分色3～5 s；蘇木素染色40 s， 甘油-水封片劑封片。圖像采集采用Nikon Labophot 2 顯微鏡及Spot RT3 彩色數(shù)碼相機(jī)。斑塊的定量分析采用雙盲法，用Image-Pro Plus software 6.0進(jìn)行斑塊大小計(jì)算，每只小鼠取10張切片的平均值作為斑塊大小。

1.2.4熒光定量PCR檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶及細(xì)胞因子 按上述方法進(jìn)行心臟灌注，取主動(dòng)脈進(jìn)行RNA提取，取2 μg總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后采用SYBR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶TMP-2、TMP-9和TIMP-1，細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法能減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小 為了檢測(cè)大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小的影響，我們對(duì)主動(dòng)脈根部的冷凍切片進(jìn)行了油紅染色，并進(jìn)行了斑塊面積的計(jì)算。與模型組比較，5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照組及SDT低、中、高劑量組斑塊面積和斑塊面積/官腔面積比值均顯著性降低，且具有劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系（P<0.05，P<0.01，表 1）。本結(jié)果表明，大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法能減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小，具有較好的治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

2.2大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法具有穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用 為了檢測(cè)大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法對(duì)斑塊穩(wěn)定性的影響，我們采用熒光定量PCR方法檢測(cè)了主動(dòng)脈局部與斑塊穩(wěn)定性有關(guān)的基質(zhì)蛋白酶家族（MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制因子（，TIMP）的表達(dá)。MMPs可以通過(guò)促進(jìn)血管壁細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的破壞來(lái)使AS斑塊變得不穩(wěn)定[4]，TIMP是其內(nèi)源性的抑制劑。與模型組比較，5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照組及SDT低、中、高劑量組主動(dòng)脈局部TIMP-1的表達(dá)顯著升高，而TMP-2和TMP-9的表達(dá)均顯著性降低且具有劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系（P<0.05，P<0.01，表 2）。本結(jié)果表明，大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法具有穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用。

2.3大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法可能通過(guò)降低炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用 為了探討大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法抗動(dòng)脈粥樣硬化的可能機(jī)制，我們檢測(cè)了促炎性和抗炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。與模型組比較，5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照組及SDT低、中、高劑量組促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ在主動(dòng)脈局部的表達(dá)顯著降低，而抗炎性細(xì)胞因子IL-10，TGF-β的表達(dá)顯著升高，且具有劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系（P<0.05，P<0.01，表3）。本結(jié)果表明，大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法可能通過(guò)降低炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性心血管疾病，其中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂是急性心血管事件發(fā)生的主要原因，嚴(yán)重威脅人類健[3]。傳統(tǒng)的動(dòng)脈粥樣硬化治療包括藥物治療和手術(shù)介入治療，是目前臨床患者的主要選擇。然而，這些療法仍存在一些副作用，例如抗血小板藥物治療會(huì)引起血小板含量過(guò)低，最終導(dǎo)致出血；抗血脂藥會(huì)導(dǎo)致肌病；手術(shù)介入治療則存在機(jī)械創(chuàng)傷大、術(shù)后再狹窄率高、支架內(nèi)血栓發(fā)生率高的缺陷[3]。因此，尋求一種損傷小、靶向性強(qiáng)、副作用小的動(dòng)脈粥樣硬化治療方法勢(shì)在必行。聲動(dòng)力治療是一種無(wú)創(chuàng)、安全的治療方式，其在動(dòng)脈粥樣硬化治療中具有潛在的應(yīng)用前景[5]。

聲動(dòng)力治療中使用的藥物為聲敏劑，是影響其療效的主要因素之一。大黃素是一種羥基蒽醌的衍生物，在抗炎、抗纖維化、清除自由基等方面具有良好的效果。大黃素可以干預(yù)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[6]。另有研究報(bào)道，大黃素具有穩(wěn)定小鼠斑塊的作用[4]。大黃素作為聲敏劑，是否可以通過(guò)聲動(dòng)力療法發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，卻鮮有報(bào)道。

本次研究結(jié)果表明，大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法可以顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小，具有與已知陽(yáng)性對(duì)照聲敏劑5-氨基酮戊酸介導(dǎo)聲動(dòng)力療法相似的療效[2]。為了檢測(cè)該方法對(duì)斑塊穩(wěn)定性的影響，我們檢測(cè)了與斑塊穩(wěn)定性有關(guān)的MMP-2、MMP9和TIMP-1。MMP-2和 MMP-9是 AS斑塊中 MMPs的主要成分，與AS斑塊穩(wěn)定性關(guān)系密切[4]。 MMP-2的主要底物包括明膠 Ⅳ（粥樣斑塊基底膜纖維帽的主要組成部分）、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原，彈性 蛋白及纖維連接蛋白等。MMP-9的底物包括明膠Ⅳ、Ⅴ型膠原和彈性蛋白[4]。TIMP-1是MMP的內(nèi)源性抑制因子，降低斑塊局部MMPs而升高TIMP-1的表達(dá)，可以增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性及預(yù)防斑塊的破裂，對(duì)降低心血管疾病的致殘率及致死率有非常重要的意義。本研究觀察到經(jīng)過(guò)大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法干預(yù)之后，小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的MMP-2、MMP-9表達(dá)降低，其內(nèi)源性的抑制因子TIMP-1表達(dá)升高。表明該方法可以通過(guò)下調(diào)斑塊中MMP-2、MMP-9的表達(dá)，上調(diào) TIMP-1的表達(dá)，在一定程度上改變斑塊的組織學(xué)構(gòu)成，發(fā)揮穩(wěn)定 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用。

為了探討該方法的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子的在動(dòng)脈局部的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SDT低、中、高劑量組促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ在主動(dòng)脈局部的表達(dá)顯著降低，而抗炎性細(xì)胞因子IL-10，TGF-β的表達(dá)顯著升高。說(shuō)明大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力療法可能通過(guò)降低炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。本研究為初步探討大黃素作為聲敏劑介導(dǎo)聲動(dòng)力療法治療動(dòng)脈粥樣硬化，雖然結(jié)果較理想，但仍有待于用更經(jīng)典的方法如免疫組化進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本研究結(jié)果為采用大黃素介導(dǎo)聲動(dòng)力治療動(dòng)脈粥樣硬化提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。對(duì)于防治急性心血管臨床事件具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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收稿日期：2017-9-12；修回日期：2017-9-25

編輯/成森