家蠶脫膠蠶絲的蛋白組成成分

張艷，董照明，席星航，張曉璐，葉林，郭凱雨，夏慶友，趙萍

（西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/重慶市蠶絲纖維新材料工程技術(shù)研究中心/西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715）

0 引言

【研究意義】家蠶（Bombyx mori）是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，最重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于可以生產(chǎn)一種天然的高分子纖維材料——蠶絲。絲素蛋白構(gòu)成了蠶絲的核心纖維，而絲膠包裹在絲素的外圍，具有保護(hù)和膠著絲素的作用。除了絲素與絲膠外，筆者課題組在最近的研究中從蠶絲中鑒定到了酶、蛋白酶抑制劑和未知功能蛋白等上百種蛋白質(zhì)[1-2]。另外，蠶絲中還含有糖、脂、氨基酸、有機(jī)酸和烷烴等小分子物質(zhì)，它們主要存在于絲膠層中[3]。蠶絲應(yīng)用于紡織工業(yè)需要經(jīng)過一系列的加工過程，絲素在這個(gè)過程中基本不變，而絕大部分絲膠則在煮繭、繅絲和精煉的過程中被脫去并排放掉，而其他絲蛋白的變化情況至今未被闡明。因此，對蠶絲加工過程中蛋白質(zhì)組分的變化進(jìn)行研究，不僅有利于深入理解蠶絲的蛋白質(zhì)組分與特性，而且有利于探索更加先進(jìn)的蠶絲加工工藝。【前人研究進(jìn)展】蠶絲的主要組分是絲素蛋白（fibroin）和絲膠（sericin）蛋白[4]。絲素是一種纖維蛋白，是絲的中心成分，約占絲重的70%—80%。絲素蛋白含有3種成分：390 kD的重鏈蛋白（H-chain）、25 kD的輕鏈蛋白（L-chain)和27或30 kD的fibrohexamerin/P25蛋白（fhx）[5-7]。這 3種絲素蛋白在后部絲腺細(xì)胞內(nèi)按照一定的比例（H-chain:L-chain:fhx=6:6:1）形成絲素蛋白基本單位，然后被分泌到絲腺腔[5]。絲膠是一種膠狀的球蛋白，存在于絲素的外圍，包被著絲素，對絲素起著保護(hù)和膠黏作用。目前已發(fā)現(xiàn)3種絲膠蛋白，包括絲膠1、絲膠2和絲膠3[8-11]。絲膠1和絲膠3的主要作用是黏附絲素纖維以形成繭；絲膠2不存在于蠶繭中，卻在繭網(wǎng)和小蠶的蠶絲中被檢測到，它具有更好的黏性，可能的作用是將蠶繭或幼蟲黏附于周圍物體，從而防止蠶體掉落，幫助蛻皮和結(jié)繭[9-10]。為了深入了解蠶絲的蛋白組分，DONG等[1]收集了家蠶在不同發(fā)育時(shí)期所分泌的7種蠶絲，利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法從各種蠶絲中共鑒定到500種蛋白質(zhì)，通過GO分類和非標(biāo)記定量分析，發(fā)現(xiàn)蠶絲中的主要蛋白質(zhì)包括絲素、絲膠、蛋白酶抑制劑、酶、未知功能蛋白；ZHANG等[2]對家蠶蠶繭中處于不同分層的繭絲進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定，也鑒定到了同樣類型的絲蛋白，并且發(fā)現(xiàn)蠶繭外層絲比內(nèi)層絲擁有更多的絲膠1和蛋白酶抑制劑；DONG等[12]通過調(diào)查各種絲蛋白在絲腺腔內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化過程，發(fā)現(xiàn)絲素、絲膠、蛋白酶抑制劑、seroin以及未知功能蛋白都是在食桑期的絲腺內(nèi)不斷積累，構(gòu)成了蠶絲的主要成分，而酶類等其他絲蛋白并不是絲蛋白的主要成分；GUO等[13]發(fā)現(xiàn)繭絲中的蛋白酶抑制劑不僅對真菌蛋白酶表現(xiàn)出高效的抑制活性，還能夠抑制白僵菌孢子的萌發(fā)。蠶絲中還存在另外一類抗菌蛋白 seroin，研究發(fā)現(xiàn)中部及后部絲腺都能分泌這種蛋白[14-16]。SINGH 等[17]發(fā)現(xiàn)家蠶的seroin還具有抗病毒的活性。除了抗菌蛋白外，蠶絲中還有大量未知功能的蛋白質(zhì)未被研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來關(guān)于蠶絲蛋白組分與活性的研究已經(jīng)取得了較多進(jìn)展，然而關(guān)于蠶絲加工過程對于蠶絲組成與特性的影響仍然所知甚少。為了更好地開發(fā)和利用好蠶絲制品，有必要對蠶絲加工過程中絲蛋白成分的變化進(jìn)行系統(tǒng)地研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用不同方法對蠶絲進(jìn)行脫膠處理，對脫膠后的蠶絲進(jìn)行電泳檢測以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并對經(jīng)歷了不同加工過程的蠶絲產(chǎn)品進(jìn)行電泳檢測與蛋白質(zhì)組學(xué)分析，闡明各種脫膠方法及不同加工過程對蠶絲蛋白質(zhì)成分與性質(zhì)的影響，為蠶絲加工工藝的改進(jìn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014—2015年在西南大學(xué)完成。

1.1 材料與試劑

選取家蠶大造品種作為試驗(yàn)對象，由西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室家蠶基因資源庫提供。幼蟲在25℃、相對濕度60%、自然光照條件下用桑葉進(jìn)行飼喂，試驗(yàn)材料為新鮮的蠶繭。生絲、胚綢、綢、緞、電力紡由西南大學(xué)席星航教授提供，使用多年的絲綢衣服由西南大學(xué)趙萍教授提供。木瓜蛋白酶、尿素、二硫蘇糖醇購于上海生工生物工程公司，碳酸鈉、氫氧化鈉購于成都科龍化工試劑廠，Bradford蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司，超濾管和脫鹽柱購于密理博公司，胰蛋白酶、硫氰化鋰、碘乙酰胺和甲酸購于 Sigma公司。

1.2 蠶繭樣品的預(yù)處理與脫膠

將去掉繭網(wǎng)的蠶繭分為外層、中層和內(nèi)層。選取中間層的蠶繭置于 65℃恒溫烘箱烘干，之后進(jìn)行稱重，用5種方法對蠶繭進(jìn)行脫膠處理。（1）木瓜蛋白酶脫膠法：將蠶繭置于 0.1%的木瓜蛋白酶溶液中（浴比為1:50），在60℃水浴鍋中水浴60 min；（2）尿素脫膠法：將蠶繭置于 8 mol·L-1尿素溶液中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴75 min，取出脫膠液，將脫膠的蠶絲用 40℃溫水清洗 2次并盡量擰干，再放入新的8 mol·L-1尿素溶液中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴60 min；（3）碳酸鈉脫膠法：將蠶繭置于0.5% Na2CO3溶液中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴75 min，取出脫膠液，將脫膠的蠶絲用40℃溫水清洗2次并盡量擰干，再放入新的0.5% Na2CO3中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴60 min；（4）中性皂脫膠法：將蠶絲置于0.5%的中性皂液中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴30 min，取出脫膠液，將脫膠的蠶絲盡量擰干，放入0.05% Na2CO3溶液中水浴20 min（浴比為1:100），取出脫膠液，將脫膠的蠶絲盡量擰干，再放入0.2% Na3PO4溶液中水浴60 min；（5）堿水脫膠法：將蠶繭置于含有NaOH的pH 11的純水溶液中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴30 min。以上5種方法脫膠后取出脫膠液，并分別將脫膠后的蠶絲用40℃溫水清洗2次，于65℃恒溫烘箱中烘干。

1.3 蠶絲蛋白的提取、定量與電泳

稱取約0.01 g的未脫膠蠶繭、脫膠蠶繭或蠶絲制品放入1.5 mL離心管中，加入60% LiSCN溶液（1 g/100 mL）劇烈渦旋振蕩2 h，12000×g離心10 min，取上清，于-20℃保存。利用Brandford法測定蛋白濃度[18]。分別取 2 μg蠶絲蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并通過硝酸銀染色來分析提取的蠶絲蛋白。

1.4 蠶絲蛋白的質(zhì)譜前處理

采取FASP（filter-aided sample preparation）酶解法對蠶絲蛋白進(jìn)行溶液內(nèi)酶解[19]，步驟如下：將150 μg蠶絲蛋白加入超濾管（MWCO 10 000，Millipore），用8 mol·L-1尿素溶液（UA）洗3次以置換LiSCN溶液，每次洗完后在12 000×g室溫離心20 min，除去離心下去的液體。加入15 mmol·L-1的二硫蘇糖醇溶液（DTT），37℃孵育 1 h，加入 15 μL 50 mmol·L-1的碘乙酰胺溶液（IAA），室溫避光反應(yīng)1 h后，12 000×g室溫離心20 min，棄掉液體。用尿素溶液洗滌3次，以去除殘留的DTT和IAA，每次加入200 μL UA溶液。用50 mmol·L-1NH4HCO3溶液洗滌4次，以去除殘留的尿素溶液，12 000×g室溫離心20 min，棄掉液體，并更換新的離心管。在超濾管中按照1:50的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，于37℃酶解20 h。12 000×g室溫離心 20 min，回收管中酶解后的肽段溶液，4℃濃縮干燥，用0.1%甲酸水復(fù)溶后用Zip TipC18脫鹽柱脫鹽，然后在4℃濃縮干燥。

1.5 蠶絲蛋白的質(zhì)譜鑒定

干燥后的肽段用0.1%甲酸水復(fù)溶，使用C18柱在EASY-nLC 1000系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific）上進(jìn)行 140 min的色譜梯度分離。分離的肽段通過 Q Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜檢測使用TOP20原則。Full MS掃描的分辨率為70 000，MS2掃描的分辨率為17 500；Full MS的最大離子注入數(shù)為3e6，最大離子注入時(shí)間為20 ms，二級最大離子注入數(shù)為1e6，最大離子注入時(shí)間為60 ms。

利用MaxQuant（1.3.0.1版）軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索鑒定[20]。將家蠶基因組數(shù)據(jù)庫SilkDB（http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/）和 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）家蠶數(shù)據(jù)庫整合，構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫（共包含35 379個(gè)蛋白質(zhì)）。搜索引擎為Andromeda[21]。搜庫的參數(shù)設(shè)置如下，Mutiplicity=1，肽段 FDR（false discovery rate）=0.01，蛋白 FDR=0.01，可變修飾為Oxidations（M）和Acetyl（protein N-term），最小肽段的氨基酸數(shù)為6，切割酶為Trypsin，蛋白定量方法為 iBAQ。從得到的結(jié)果中手動(dòng)去除污染序列和反向序列。

2 結(jié)果

2.1 不同方法脫膠后蠶絲蛋白的電泳檢測

目前常用的脫膠方法包括碳酸鈉法[22]、尿素法[23]、中性皂法[24-25]和蛋白酶法[26-27]等。為了觀察不同方法的脫膠效果，收集了各種方法的脫膠溶液與脫膠后的蠶絲纖維并進(jìn)行蛋白電泳。從圖1的電泳結(jié)果可以看出，每種方法的第一次脫膠溶液中都能檢測到或多或少的蛋白質(zhì)，而第二次脫膠溶液中幾乎檢測不到蛋白質(zhì)，表明第一次脫膠處理就已經(jīng)把容易脫掉的絲膠蛋白去掉了。電泳檢測脫膠后的蠶絲纖維可以發(fā)現(xiàn)不同方法處理后的纖維蛋白有著不同的分子量分布，表明絲素蛋白在脫膠過程中可能發(fā)生了不同程度的降解或殘留了不同量的絲膠蛋白。

圖1 脫膠溶液和脫膠后蠶繭絲的電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE of degummed solution and cocoon silk

木瓜蛋白酶法脫膠的溶液中只能檢測到小分子量的蛋白，但脫膠后的蠶繭中還能明顯地檢測到絲素重鏈和輕鏈，表明木瓜蛋白酶對絲膠蛋白具有較強(qiáng)的水解作用，而對絲素蛋白的水解作用較弱。碳酸鈉法脫膠溶液中能看到兩條明顯的絲膠條帶，脫膠后的蠶繭蛋白明顯比木瓜蛋白酶處理后的蠶繭蛋白分子量低，表明碳酸鈉溶液對絲膠的降解程度較弱，對絲素的降解程度較強(qiáng)。尿素脫膠溶液中存在拖帶的絲膠蛋白，脫膠后的蠶繭中能檢測到分子量明顯降低的絲素蛋白，表明尿素對絲膠蛋白和絲素蛋白的降解都比較嚴(yán)重（圖1-A）。中性皂液脫膠溶液和尿素脫膠溶液相似，能導(dǎo)致絲膠蛋白的降解，經(jīng)過碳酸鈉和磷酸三鈉二次脫膠后，溶液中基本檢測不到蛋白，脫膠后的蠶繭中能檢測到分子量明顯降低的絲素蛋白。堿水脫膠溶液中只能檢測到少量的蛋白，表明脫膠效果不是很理想，脫膠后的蠶繭中存在大量的高分子量的絲素蛋白，降解不明顯（圖1-B）。

為了進(jìn)一步比較不同方法的脫膠效果，將5種方法脫膠后的蠶繭與未脫膠的蠶繭一起進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)未脫膠的蠶繭、木瓜蛋白酶脫膠的蠶繭和堿水脫膠后的蠶繭蛋白的條帶較類似，能明顯地看到絲素重鏈和絲素輕鏈，并且絲素蛋白沒有出現(xiàn)明顯的降解；而尿素、碳酸鈉和中性皂脫膠后的蠶繭蛋白條帶類似，其絲素重鏈和輕鏈都出現(xiàn)了明顯的降解（圖2）。

圖2 脫膠后蠶繭絲蛋白的電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE of proteins in the degummed cocoon silk

2.2 不同方法脫膠后的蠶繭蛋白質(zhì)組學(xué)分析

利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)，對不同方法脫膠后的蠶繭進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定。共鑒定到159種蛋白，其中未脫膠蠶繭中鑒定到107種蛋白，堿水法脫膠后的蠶繭中鑒定到112種蛋白，木瓜蛋白酶法鑒定到64種蛋白，中性皂法鑒定到37種蛋白，碳酸鈉法鑒定到24種蛋白，尿素法鑒定到19種蛋白，表明這些脫膠方法的效果差異很大。堿水法的蛋白數(shù)目比未脫膠蠶繭的蛋白數(shù)目稍多，屬于實(shí)驗(yàn)誤差，也暗示了堿水法效果最差。尿素法鑒定到的蛋白數(shù)目最少，表明尿素法的脫膠效果最好。

表1 脫膠后的蠶繭絲中主要蛋白質(zhì)的信息列表Table 1 List of major proteins in the degummed cocoon silk

將未脫膠的蠶繭和5種脫膠方法處理的蠶繭蛋白組分進(jìn)行非標(biāo)定量比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿水法處理過的蠶繭和未脫膠蠶繭的蛋白組分相似，主要包括絲素重鏈、絲素輕鏈、絲素p25、絲膠1、seroin 1、osiris 9a、甘氨酸富含蛋白和蛋白酶抑制劑SPI51和SPI39等（表1）。木瓜蛋白酶法和中性皂法脫膠后的蠶繭中絲膠1蛋白幾乎消失，絲素蛋白的比例明顯增加，除了絲素蛋白外還含有seroin 1和甘氨酸富含蛋白等。碳酸鈉法和尿素法的脫膠效果最好，這兩種方法脫膠后的蠶繭中絲素蛋白是主要的成分，此外還含有甘氨酸富含蛋白，表明甘氨酸富含蛋白可能是絲素蛋白或最內(nèi)層的絲膠蛋白（圖3）。

2.3 不同蠶絲產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的電泳檢測

為了檢測蠶絲工業(yè)實(shí)際加工過程對蠶絲成分的影響，選取了蠶絲加工獲得的各種產(chǎn)品，包括生絲、胚綢、綢、緞、電力紡和絲綢舊衣，提取其中的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分析與質(zhì)譜鑒定。通過電泳檢測可以看出，在生絲和胚綢中，絲素重鏈與絲素輕鏈的條帶都比較清晰；在綢、緞和電力紡中，絲素重鏈出現(xiàn)了部分程度的降解，絲素輕鏈的條帶也變得模糊；在絲綢舊衣中，絲素重鏈與輕鏈蛋白都出現(xiàn)了嚴(yán)重的降解，已經(jīng)看不到清晰的蛋白條帶（圖4）。

圖3 脫膠的蠶繭絲中蛋白質(zhì)的非標(biāo)定量分析Fig. 3 Label-free quantitative analysis of proteins in the degummed cocoon silk

圖4 蠶絲產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的SDS-PAGEFig. 4 SDS-PAGE of proteins from different silk products

2.4 不同蠶絲產(chǎn)品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)，對工業(yè)上生產(chǎn)中獲得的各種蠶絲加工品進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在生絲和胚綢中都能鑒定到近百種蛋白質(zhì)（分別為95和100種），這與蠶繭的鑒定結(jié)果類似；但是，在綢、緞和電力紡中分別鑒定到了29、44和38種蛋白質(zhì)，蛋白數(shù)量明顯減少；在使用多年的絲綢舊衣中只能鑒定到10種蛋白質(zhì)；這些結(jié)果與各種方法脫膠后蠶絲蛋白的鑒定結(jié)果相似。在生絲和胚綢中，能檢測到大量蛋白質(zhì)，主要成分包括3種絲素蛋白、絲膠1、seroin 1、osiris 9a、甘氨酸富含蛋白和蛋白酶抑制劑SPI51等（表2）；在綢、緞和電力紡中，主要成分包括3種絲素蛋白和seroin 1等（表2）；在使用多年的絲綢衣服中，仍然能鑒定到3種絲素蛋白和甘氨酸富含蛋白（圖5），這一結(jié)果與不同方法脫膠的結(jié)果類似（表2）。

3 討論

蠶絲作為紡織的原料已有5000年的歷史。經(jīng)過長期的經(jīng)驗(yàn)積累和工藝改進(jìn)，蠶絲的加工工藝已經(jīng)十分成熟，主要包括脫膠和整理絲素等工藝。本研究參考已報(bào)道的多種脫膠方法，利用電泳檢測與質(zhì)譜鑒定的方法，發(fā)現(xiàn)堿水法無法去掉絲膠，而其他4種方法都能有效地去除絕大部分的絲膠蛋白。木瓜蛋白酶法在去除絲膠的同時(shí)能夠最大程度地保持絲素纖維的完整性，這可能是由于蠶絲中的絲素蛋白疏水性強(qiáng)，形成高度有序排列的β折疊[28-29]，而絲膠是水溶性的糖蛋白，以無規(guī)則結(jié)構(gòu)為主[30]。因此木瓜蛋白酶較容易作用于結(jié)構(gòu)疏松的親水性絲膠，而很難作用于排列緊密的疏水性絲素。中性皂、碳酸鈉和尿素法會對絲素造成損傷，推測原因?yàn)檫@3種方法的處理溫度較高。這些結(jié)果表明完全脫掉絲膠是很困難的，采用劇烈的條件去除絲膠的同時(shí)會導(dǎo)致絲素蛋白的降解，進(jìn)而導(dǎo)致蠶絲機(jī)械性能的降低[22]。之前有研究發(fā)現(xiàn)用尿素溶液在80℃溶解絲膠蛋白，當(dāng)處理時(shí)間小于5 min時(shí)，能保持絲膠蛋白不降解[9,31]。這表明較劇烈的溶劑也可以保持絲蛋白的穩(wěn)定性，但處理溫度不能太高，時(shí)間也不能太長。

表2 蠶絲加工產(chǎn)品中主要蛋白質(zhì)的信息列表Table 2 List of major proteins in the different silk products

圖5 蠶絲加工產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的非標(biāo)定量分析Fig. 5 Label-free quantitative analysis of proteins from different silk products

從蛋白種類上看，木瓜蛋白酶、中性皂、碳酸鈉和尿素 4種方法幾乎都能夠完全去除絲膠 1。木瓜蛋白酶和中性皂脫膠后，主要?dú)堄嘟z素蛋白和seroin1蛋白，碳酸鈉和尿素脫膠后，殘余的蛋白主要是絲素蛋白和甘氨酸富含蛋白。之前的研究發(fā)現(xiàn)，seroin1蛋白在中部絲腺和后部絲腺都能合成，同時(shí)存在于絲素層與絲膠層中[14-16]。甘氨酸富含蛋白在中部絲腺中區(qū)和后區(qū)表達(dá)[12]，存在于絲膠的內(nèi)層。這些結(jié)果表明 seroin1和甘氨酸富含蛋白可能存在于絲膠內(nèi)層，因此多種脫膠方法都難以將這兩種蛋白除凈。

對多種蠶絲產(chǎn)品進(jìn)行蛋白電泳檢測發(fā)現(xiàn)生絲和胚綢中的絲素蛋白比較完整，這可能是由于這兩者的加工時(shí)間較短，處理?xiàng)l件較溫和的緣故。綢、緞和電力紡由于經(jīng)歷了后續(xù)更劇烈的條件，絲素蛋白已發(fā)生了部分降解，分子量明顯降低，力學(xué)性能也隨之降低。從蛋白成分與含量來看，生絲和胚綢中保留了很多種類的絲蛋白，包括絲素、絲膠1、seroin 1、osiris9a、甘氨酸富含蛋白、蛋白酶抑制劑和其他蛋白；而綢、緞和電力紡中主要是絲素和seroin 1。

4 結(jié)論

蠶絲的加工過程實(shí)質(zhì)上是脫膠的過程。比較5種不同的脫膠方法發(fā)現(xiàn)，堿水脫膠的效果最差；木瓜蛋白酶脫膠法可以去掉大部分絲膠蛋白，同時(shí)最大程度地保持絲素纖維的完整性；中性皂、碳酸鈉和尿素法的脫膠程度都比較好，但是會對絲素造成損傷。比較5種蠶絲工業(yè)產(chǎn)品可以發(fā)現(xiàn)，蠶絲加工為生絲或胚綢后，絲膠蛋白含量很高，絲素纖維還很完整。蠶絲加工為綢、緞或電力紡后，絲膠蛋白基本被去除干凈了，但是絲素纖維已經(jīng)出現(xiàn)部分程度的降解。

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