無毒性產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素突變體的表達(dá)及免疫保護(hù)力評價(jià)

杜吉革，薛麒，朱真，李啟紅，印春生，姚文生，康凱，陳小云

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所牛羊病實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

0 引言

【研究意義】 產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種重要的人畜共患病原，嚴(yán)重危害著畜牧業(yè)的健康發(fā)展[1-4]。該菌的主要致病因子是其分泌的能引起人和動物發(fā)病的外毒素[5]。其中，ETX是該菌所有外毒素中毒力最強(qiáng)的毒素[6]，可引起動物的壞死性腸炎或者腸毒血癥[7-9]，導(dǎo)致感染動物在很短的時(shí)間內(nèi)死亡[10-11]，從而使抗生素治療失去意義，疫苗注射成為了防治該病的主要手段。然而，傳統(tǒng)ETX的類毒素疫苗抗原成分復(fù)雜，有效抗原量較低，且脫毒過程中存在一定的安全隱患。因此，實(shí)現(xiàn)ETX的減毒乃至無毒，對于開發(fā)ETX基因工程亞單位疫苗具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ETX是由B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生[12]，由296個(gè)氨基酸構(gòu)成。ETX以毒素前體的形式分泌于菌體外[13]，隨后毒素前體在宿主的胰蛋白酶、糜蛋白酶或梭菌自身蛋白酶的作用下去掉N端11—13個(gè)以及C端22—29個(gè)氨基酸，從而成為活化的成熟毒素[14-15]。該毒素屬于成孔毒素家族，在結(jié)構(gòu)上主要分為I、II和III 3個(gè)區(qū)域，分別在毒素與細(xì)胞受體結(jié)合過程、與細(xì)胞受體結(jié)合穩(wěn)定性的維持以及細(xì)胞膜穿孔的形成過程中發(fā)揮著重要作用[16]。由于該毒素有 2條肽鏈同時(shí)跨過 I，II和III 3個(gè)區(qū)域[17]，導(dǎo)致僅使用毒素的一個(gè)域作為疫苗候選抗原的策略（如 α、β毒素的 C末端[18-19]）很難應(yīng)用于該毒素的防控。已有的研究證實(shí)，組氨酸殘基是影響 ETX蛋白活性的關(guān)鍵性氨基酸，而第106位的組氨酸突變?yōu)楦彼岬闹亟METX基本是無毒的[20-22]。此外，ETX中I區(qū)域內(nèi)的一組芳香族氨基酸（Tyr29、Tyr30、Tyr36、Tyr196以及Phe199）構(gòu)成了毒素的受體結(jié)合區(qū)域[23]。其中，第199位的苯丙氨酸突變?yōu)楣劝彼岷?，突變體的細(xì)胞毒性明顯下降（約為野生型重組毒素的1/2 527）。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，以上兩種單位點(diǎn)突變體的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯改變，說明以上兩處氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變后，蛋白活性的改變與結(jié)構(gòu)并沒有直接的關(guān)系，從而保持了良好的抗原性[24]。【本研究切入點(diǎn)】前人的研究主要是在野生型 ETX基礎(chǔ)上進(jìn)行單點(diǎn)突變，表達(dá)的重組蛋白可溶性較低，不利于后續(xù)的大量生產(chǎn)和純化。已有的研究發(fā)現(xiàn)，將目的基因按照大腸桿菌偏好的密碼子進(jìn)行優(yōu)化后可明顯提高目的蛋白的可溶表達(dá)[25-27]。此外，單個(gè)氨基酸突變的ETX在未來基因工程疫苗大規(guī)模生產(chǎn)中存在一定的生物安全隱患?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究根據(jù)現(xiàn)行D型產(chǎn)氣莢膜梭菌制苗用菌株（C60-2株）ETX的編碼序列，按大腸桿菌偏愛的密碼子進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)和人工合成，并將其第106和第199位氨基酸位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行突變，經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)、純化和鑒定，并對重組蛋白的毒力和免疫保護(hù)性進(jìn)行研究，為 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的防制提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年4—10月在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所牛羊病實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株天然毒素、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清以及pET-30a(+)表達(dá)載體為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所牛羊病實(shí)驗(yàn)室保存；1.5—2.0 kg普通級健康日本大耳兔和16—18g ICR小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector、感受態(tài)細(xì)胞Top10和BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Montanide ISA 201佐劑購自法國賽彼科（seppic）公司；Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒、蛋白 Marker、Western blot Marker、 蛋 白 溶 解 液 （ 50 mmol·L-1Tris-HCl, 10% Glycerol, 150 mmol·L-1NaCl, pH 8.0），均購自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶（KFX-401S）購自東洋坊公司；premix Taq version 2.0、DNA Marker購自Takara公司。T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購自Promaga公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindIII購自NEB公司；抗His標(biāo)簽單抗、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；明膠緩沖溶液，LB培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司。

1.2 基因合成及密碼子優(yōu)化

以前期擴(kuò)增獲得的 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌 C60-2株 ETX編碼基因?yàn)槟０?，按大腸桿菌偏愛的密碼子進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，并將第106位組氨酸以及第199位的苯丙氨酸分別突變?yōu)楦彼岷凸劝彼?。此外，在目的基?′端添加6*His標(biāo)簽蛋白編碼序列，最后由南京金斯瑞生物科技有限公司合成目的基因GETXm2。

1.3 ETX突變體原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以GETXm2基因?yàn)槟０?，采用引物對GETXm2-F/GETXm2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中上游引物GETXm2-F序列為：5′-CGCCATATG AAAGAAATCTC -3′，其5′端引入限制性內(nèi)切酶NdeⅠ位點(diǎn)（下劃線部分）及保護(hù)性堿基；下游引物 GETXm2-R序列為：5′-CCGAAGCTT TTAGTGGTGATG，其 5′端引入限制性內(nèi)切酶HindIII位點(diǎn)（下劃線部分）及保護(hù)性堿基。PCR體系為 50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；98℃變性10 s，56℃退火30 s，68℃延伸70 s，共33個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸7 min。回收擴(kuò)增獲得的DNA條帶，采用NdeⅠ/HindIII 雙酶切后與經(jīng)過相同處理的 pET30a（+）載體連接。將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒送中美泰和公司測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pET30a-GETXm2。

1.4 重組蛋白的表達(dá)與鑒定

將 pET30a-GETXm2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，分別在15℃和37℃條件下用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)情況及其可溶性，將表達(dá)的重組蛋白稱為rETXm2。采用Western blot方法，以抗His標(biāo)簽蛋白抗體為一抗，對重組蛋白做進(jìn)一步的鑒定。

1.5 重組蛋白的純化與鑒定

按照 Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒的使用說明書對菌體裂解上清中呈可溶性表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，-80℃保存?zhèn)溆?。將純化后的目的蛋白?.5μg）經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行孵育，按照底物顯色試劑盒說明書進(jìn)行顯色，檢測純化的重組蛋白與D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清的反應(yīng)情況。

1.6 重組蛋白的毒性分析

1.6.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將MDCK細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至形成細(xì)胞單層后，棄細(xì)胞生長液。將rETXm2用細(xì)胞維持液稀釋至 100 μg·mL-1以及 10μg·mL-1，每個(gè)稀釋度各接種3孔細(xì)胞，每孔100μL，置37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄細(xì)胞的病變情況。同時(shí)將肉肝胃酶消化湯和洗脫液用細(xì)胞維持液稀釋100倍后，分別孵育細(xì)胞，作為陰性對照組，將 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株天然毒素做2000倍稀釋后作為陽性對照。

1.6.2 小鼠的毒力測定 已有的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX毒素首先以前體毒素形式分泌，當(dāng)被蛋白酶，如胰酶、糜蛋白酶以及羧肽酶等，切除N端以及C端相應(yīng)的氨基酸后，毒素被活化，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物活性[21-23]?；罨腅TX對小鼠的半數(shù)致死量可達(dá)50 ng·kg-1[28]。本文按照《中華人民共和國獸藥典》（2015年版）[26]規(guī)定的方法，用終濃度為1%的胰酶對純化的rETXm2在37℃條件下活化1 h。將16—18 g的ICR小鼠隨機(jī)分為9組，每組5只。分別用活化前和活化后的rETXm2進(jìn)行尾靜脈注射，注射劑量分為 0.001 mg（0.0625 mg·kg-1）、0.01 mg（0.625 mg·kg-1）、0.1 mg（6.25 mg·kg-1）3 個(gè)注射劑量。同時(shí)設(shè)置胰酶消化液（終濃度為1%）以及蛋白溶解液兩個(gè)陰性對照和1個(gè)小鼠MLD的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌天然毒素陽性對照。樣品均用明膠緩沖液進(jìn)行稀釋，注射的液體總體積為200μL，觀察2d，記錄小鼠的存活狀態(tài)。

1.7 免疫原性分析

1.7.1 免疫程序 合適濃度的純化 rETXm2與Montanide ISA 201佐劑以1:1（v/v）的比例配制成rETXm2終濃度為 50 μg·mL-1的疫苗，另取滅菌 PBS 與Montanide ISA 201佐劑以1:1（v/v）的比例制備對照疫苗，置4℃保存?zhèn)溆?。選用體重1.5—2.0 kg健康家兔，測定免疫前每只家兔血清對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價(jià)。取8只對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價(jià)為0的家兔，其中4只分別頸部皮下注射疫苗，2.0mL/只，免疫14 d后，以相同劑量、相同途徑進(jìn)行第二次免疫。另外4只以相同劑量、相同途徑和相同方法免疫對照疫苗作為對照組。

1.7.2 血清中和抗體效價(jià)測定 分別在一免后 14 d以及二免后21 d，對試驗(yàn)組及對照組所有兔經(jīng)耳緣靜脈采血，分離血清備用。按照《中華人民共和國獸藥典》（2015年版）3部中規(guī)定的方法測定血清中和效價(jià)[29]。

1.7.3 攻毒試驗(yàn) 二免后21 d，對免疫組及對照組所有家兔經(jīng)耳緣靜脈各注射 1 MLD的天然毒素進(jìn)行攻毒，觀察5 d，記錄家兔的死亡情況。根據(jù)免疫組及對照組家兔的死亡情況，判定試驗(yàn)疫苗的免疫保護(hù)效力。

2 結(jié)果

2.1 ETX毒素突變體原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用引物GETXm2-F/GETXm2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后克隆至pET-30a（+）載體上。獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后電泳觀察，結(jié)果如圖1所示。酶切后出現(xiàn)大小約5 kb的載體DNA片段，以及大小約920 bp的目的基因片段，與預(yù)期相符。測序結(jié)果表明，插入的外源基因序列正確，將此重組質(zhì)粒命名為pET30a-GETXm2。

圖1 原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30a-GETXm2的酶切鑒定Fig. 1 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids pET30a-GETXm2

2.2 ETX毒素突變體的原核表達(dá)鑒定

將pET30a-GETXm2轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白rETXm2分子量約為39 kD，大小與預(yù)期相符。rETXm2在 BL21（DE3）菌體中以可溶性和包涵體兩種形式表達(dá)（圖2）。圖2-a為rETXm2的SDS-PAGE鑒定結(jié)果。如圖所示，rETXm2在15℃和37℃條件均有較高水平的表達(dá)，且rETXm2在15℃條件下可溶性表達(dá)比例大于后者。綜合考慮 rETXm2的表達(dá)量、可溶性及誘導(dǎo)時(shí)間等，可以確定rETXm2的最適誘導(dǎo)表達(dá)條件為37℃，誘導(dǎo)表達(dá)4 h，收獲細(xì)胞裂解上清。灰度掃描結(jié)果顯示，該誘導(dǎo)條件下的可溶表達(dá)蛋白比例可達(dá) 30%。圖2-b為重組蛋白的Western blot鑒定結(jié)果，如圖所示，重組蛋白能與抗His標(biāo)簽抗體發(fā)生反應(yīng)，證明目的蛋白含有His標(biāo)簽，與預(yù)期相符。

圖2 rETXm2的原核表達(dá)與鑒定Fig. 2 Prokaryotic expression and identification of rETXm2

2.3 rETXm2的純化與鑒定

如圖3所示，按照Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒說明書對 rETXm2進(jìn)行純化，收集純度較高的洗脫液（50 mmol·L-1Imidazole 以及 300 mmol·L-1Imidazole的洗脫液）進(jìn)行透析，最終獲得的蛋白濃度為 1.2 mg·mL-1，純度可達(dá)90%以上。將純化后的rETXm2經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印到 PVDF膜上進(jìn)行 Western blot檢測。結(jié)果顯示，rETXm2能夠與D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清反應(yīng)（圖4）。

2.4 rETXm2的毒力測定

2.4.1 對MDCK細(xì)胞的毒力測定 MDCK細(xì)胞加入各組分后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖5所示，2 000倍稀釋的天然D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素接種細(xì)胞組出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變（圖5-a）；接種濃度為100 μg·mL-1和 10 μg·mL-1的 rETXm2蛋白試驗(yàn)組（圖5-b）、接種肉肝胃酶消化湯和洗脫液的陰性對照組及空白對照組細(xì)胞均生長良好，未出現(xiàn)細(xì)胞病變（圖5-c）。

2.4.2 對小鼠的毒力測定 結(jié)果如表1所示，rETXm2注射組、蛋白溶解液以及胰酶消化液兩個(gè)陰性對照組小鼠，在注射后24 h均存活，未見任何異常，而注射1個(gè)小鼠MLD的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的小鼠，在注射后24 h內(nèi)全部死亡，說明rETXm2減毒成功。

圖3 rETXm2的純化Fig. 3 Purification of rETXm2

圖4 rETXm2與 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清反應(yīng)的 Western blot鑒定Fig. 4 Interaction of rETXm2 with antitoxin serum ofClostridium perfringens type D

圖5 rETXm2對MDCK細(xì)胞的影響Fig. 5 The influence of rETXm2 to MDCK cell

表1 注射rETXm2小鼠的存活情況Table 1 Survival of mice challenged with rETXm2

2.5 rETXm2的免疫原性分析

2.5.1 抗 rETXm2兔血清的毒素中和抗體效價(jià)測定如表2所示，經(jīng)血清中和法測定，以rETXm2免疫家兔后，每毫升的一免抗血清可中和 450—750個(gè)小鼠MLD的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素；每毫升的二免抗血清可中和2 500—4 000個(gè)小鼠MLD的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，而佐劑對照組的兔血清對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素?zé)o中和作用。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，rETXm2的免疫效力遠(yuǎn)高于現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（30個(gè)小鼠MLD/mL），是優(yōu)良的制苗用候選抗原。

2.5.2 攻毒保護(hù)性試驗(yàn) 在二免后 21 d，對所有rETXm2免疫組和佐劑免疫對照組的家兔，經(jīng)耳緣靜脈注射1個(gè)家兔MLD劑量的天然毒素進(jìn)行攻毒，結(jié)果如圖1所示，佐劑免疫對照組家兔在攻毒后5 d內(nèi)全部死亡，rETXm2免疫組家兔全部健活，未見任何不良反應(yīng)。

表2 rETXm2免疫兔血清的中和效價(jià)和免疫保護(hù)Table 2 Neutralizing titers of rabbit antiserum against rETXm2 and immuno protection of rETXm

3 討論

作為一種潛在的生物武器，ETX的毒力僅次于肉毒毒素和破傷風(fēng)毒素，可引起家禽和家畜特別是反芻動物強(qiáng)烈的腸毒血癥，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。因此，實(shí)現(xiàn)ETX的減毒乃至無毒的同時(shí)保留其免疫原性，進(jìn)而制備適當(dāng)?shù)囊呙绲壬镏苿哂薪?jīng)濟(jì)性和生物安全性兩方面的重要意義。李箐[24]等通過原核系統(tǒng)獲得的可溶性重組 ETX具有較強(qiáng)的毒力，導(dǎo)致野生型重組ETX在該毒素亞單位疫苗的制備過程中同樣存在毒素外泄或滅活不徹底等生物安全隱患。

在無毒重組 ETX亞單位疫苗的研究中，作為經(jīng)典的無細(xì)胞毒性突變體，rETXH106P的安全性和免疫原性已經(jīng)得到大量的驗(yàn)證[20-22]。李箐[24]等對ETX的第106位組氨酸、第111位色氨酸及第199位苯丙氨酸的突變體進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，rETXH106P的安全性最高，其次為 rETXF199E。其獲得的野生型重組ETX（rETX）對MDCK細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞致死濃度（CT50）為 37.73± 12.55ng·mL-1，而濃度為 100 μg·mL-1的 rETXH106P對 MDCK 細(xì)胞仍無毒力，rETXF199E的細(xì)胞毒力則為 rETX的1/2527。本文同時(shí)突變以上兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)，獲得rETXm2，其細(xì)胞毒性檢測結(jié)果進(jìn)一步支持了該結(jié)論。然而，已有的研究發(fā)現(xiàn)，rETXH106P的可溶性表達(dá)量非常低（小于5%）[24,30]，不利于大量生產(chǎn)及純化。而本研究中的rETXm2可溶性表達(dá)量較高，這可能是由于本研究按照大腸桿菌偏愛的密碼子，對 rETXm2進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道，50 ng·mL-1的天然ETX即可引起小鼠死亡，而本研究發(fā)現(xiàn)，以 6.25 mg·kg-1劑量的 rETXm2尾靜脈注射ICR小鼠后，小鼠全部存活（5/5），證明rETXm2具有良好的安全性。

自然環(huán)境中對動物致病的梭菌種類較多，且?；旌细腥?，因而梭菌病的預(yù)防多采用聯(lián)苗，以達(dá)到一針多防的目的。目前我國該類商品化疫苗均為天然毒素經(jīng)甲醛脫毒后制備的類毒素疫苗，生產(chǎn)過程中需采用肉肝胃酶消化湯等天然成分較多的培養(yǎng)基，易導(dǎo)致產(chǎn)毒不穩(wěn)定，難以保證批間一致性。此外，其抗原成分復(fù)雜，有效抗原含量較低，導(dǎo)致各菌株的類毒素免疫劑量均較高，制備聯(lián)苗后免疫劑量過大，容易引起動物的應(yīng)激反應(yīng)。如曾經(jīng)廣泛使用的“羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥四聯(lián)滅活疫苗”，因免疫劑量為每只羊5 mL，現(xiàn)已難以被養(yǎng)殖戶所接受。根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》（2015年版）三部的規(guī)定，在此類疫苗檢驗(yàn)中，對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的兔血清中和效價(jià)達(dá)到 3個(gè)小鼠MLD的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素（30 MLD·mL-1）即可判為合格。雖然該標(biāo)準(zhǔn)為疫苗的最低標(biāo)準(zhǔn)，但從中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所歷年的獸用生物制品監(jiān)督檢驗(yàn)結(jié)果來看，目前我國該類疫苗的免疫效力不容樂觀，疫苗抽檢不合格的情況時(shí)有發(fā)生（http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201504/t20150402_4472055. htm）。彭小兵等對自 2006—2015年間的此類疫苗檢驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，以血清中和法檢驗(yàn)后效力不符合規(guī)定的產(chǎn)品共有33批，其中β毒素組分效力不符合規(guī)定的比例最高，約為 72.7%[31]。然而，鑒于此類聯(lián)苗免疫劑量的限制，無法再大程度增加β類毒素的比例。為此，產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素亞單位疫苗的研制顯得極為重要。在一定的范圍內(nèi)，可以最大幅度地增大免疫原性較差的毒素抗原（如β類毒素），從而提高聯(lián)苗的總體免疫保護(hù)作用。而本研究中制備的rETXm2一免兔血清每毫升可中和450 MLD以上，二免兔血清每毫升可中和2 500 MLD以上，效果明顯優(yōu)于目前的商品化疫苗。

4 結(jié)論

對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株的ETX編碼基因進(jìn)行突變和密碼子優(yōu)化，通過基因合成獲得了含有H106P和 F199E兩個(gè)氨基酸突變的 ETX編碼基因GETXm2，經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)并純化，獲得可溶性比例達(dá) 30%的重組蛋白 rETXm2。該蛋白在本研究的檢測范圍內(nèi)同時(shí)失去了對MDCK細(xì)胞和小鼠的毒力，但仍保留了良好的免疫保護(hù)性，從而為我國現(xiàn)行 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素疫苗升級換代提供了的理想候選疫苗抗原。

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