優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵增香釀造愛格麗干白葡萄酒

王倩倩，覃杰，馬得草，陶永勝,2

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100）

0 引言

【研究意義】香氣是葡萄酒感官評價的重要指標(biāo)，也是影響葡萄酒感官質(zhì)量的重要因素。源于葡萄果實(shí)自身風(fēng)味前體物質(zhì)的品種香氣是形成葡萄酒香氣的重要特征[1]，這些前體物質(zhì)通常以非揮發(fā)性香氣糖苷的形式存在，在葡萄酒釀造過程中主要通過酵母菌產(chǎn)生的糖苷酶酶解釋放出游離態(tài)成分，表現(xiàn)出香氣特征[2]。同時釀造過程中由酵母活動形成的發(fā)酵香氣也是構(gòu)成葡萄酒香氣的重要方面[3]。‘愛格麗’（Ecolly）是西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院采用“歐亞種內(nèi)輪回選擇法”選育的一個豐產(chǎn)、抗病的釀酒葡萄新品種。在季風(fēng)氣候的陜西關(guān)中地區(qū)，葡萄成熟期雨熱同季，導(dǎo)致‘愛格麗’常常在達(dá)到漿果技術(shù)成熟度之前采收，所釀葡萄酒缺乏典型的花果香氣。因此，研究高產(chǎn)糖苷酶的優(yōu)選酵母混合發(fā)酵對愛格麗干白葡萄酒的增香釀造具有指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，相比釀酒酵母，某些非釀酒酵母可產(chǎn)生較多的利于水解香氣前體物質(zhì)的糖苷酶，并且其在釀酒環(huán)境下有更強(qiáng)的穩(wěn)定性[4]，同時，非釀酒酵母的某些代謝產(chǎn)物對葡萄酒的風(fēng)味與香氣具有重要作用[5]。然而，由于非釀酒酵母發(fā)酵過程中往往會給葡萄酒帶來一些不利的發(fā)酵副產(chǎn)物[6]，所以非釀酒酵母與釀酒酵母的混合發(fā)酵常被用來改善葡萄酒的風(fēng)味。目前為止，已有許多優(yōu)選非釀酒酵母菌株應(yīng)用于混合發(fā)酵，如葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）[7]、戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）[8]、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）[9]、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）[10]等。然而，不同非釀酒酵母菌株與釀酒酵母混合發(fā)酵產(chǎn)生的葡萄酒香氣成分以及感官質(zhì)量有差異，例如，戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵提高了葡萄酒中某些酯類的含量，增強(qiáng)了葡萄酒的果香特征[8]；美極梅奇酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵可促進(jìn)葡萄酒中中鏈脂肪酸、苯乙醇、乙酸異戊酯等成分的生成[10]。研究表明，優(yōu)選非釀酒酵母菌株與釀酒酵母的接種策略，尤其是接種比例顯著影響釀酒酵母的生長，并影響葡萄酒的感官質(zhì)量[11]。例如，DOMIZIO等[12]研究發(fā)現(xiàn)同時接種處理的接種比例為1:1時，異常畢赤酵母對釀酒酵母的生長并無影響，而接種比例達(dá)到100:1和10 000:1時，釀酒酵母的生長受到嚴(yán)重抑制。KIM等[9]利用東方伊薩酵母與釀酒酵母按不同比例同時接種發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種比例為1:1時釀造的葡萄酒感官質(zhì)量的得分最高。之前有研究認(rèn)為，畢赤酵母屬（Pichia）菌株具有高產(chǎn)乙酸乙酯的特性，同時是乙酸異丁酯和乙酸異戊酯的第二大生產(chǎn)者[12]，并且添加異常畢赤酵母（P.anomala）的胞外酶可增加葡萄酒中揮發(fā)性化合物的含量[4]。MINGORANCE-CAZORLA[13]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵畢赤酵母（P. fermentans）菌株產(chǎn)酒精率較低，但它能促進(jìn)酒中揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生，增強(qiáng)酒的香氣特征。已有研究報道發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母順序接種發(fā)酵提高了葡萄酒中一些高級醇、酯類和甘油的含量[14]。目前，發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母不同比例接種發(fā)酵的香氣研究報道還不充分?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者實(shí)驗(yàn)室前期在宜賓白酒酒窖中篩選到一株高產(chǎn)糖苷酶的發(fā)酵畢赤酵母（P. fermentans）菌株H5Y-28，而目前對于中國本土非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵的增香釀造研究還較少，因此，利用這株中國本土優(yōu)選菌株與釀酒酵母混合發(fā)酵，研究該酵母菌株增香釀造的應(yīng)用潛力?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母菌株 H5Y-28與釀酒酵母不同比例接種發(fā)酵過程中的菌體生長動力學(xué)，結(jié)合該菌株的胞外酶處理，分析不同接種比例對‘愛格麗’干白葡萄酒的香氣成分與香氣特征的影響，獲得優(yōu)選菌株與釀酒酵母混合發(fā)酵增香釀造‘愛格麗’干白葡萄酒的最佳接種比例，為干白葡萄酒增香釀造工藝技術(shù)的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2014年在西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院工藝實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 葡萄原料

‘愛格麗’（Ecolly）葡萄，由西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院選育。釀酒原料采自陜西楊凌農(nóng)業(yè)示范區(qū)官村葡萄基地，約200 kg，還原糖含量176 g·L-1，含酸量3.9 g·L-1（酒石酸計），衛(wèi)生狀況良好。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

釀酒酵母（S. cerevisiae）：Actiflore F5釀酒酵母活性干粉，購于法國Laffort公司。

發(fā)酵畢赤酵母（P. fermentans）：菌株H5Y-28，篩選于中國四川宜賓白酒酒窖，根據(jù)該菌株在WL鑒別培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和顯微細(xì)胞形態(tài)以及經(jīng) 26S rDNA D1/D2區(qū)域序列鑒定，確定其為發(fā)酵畢赤酵母（序列相似度99%）。

模擬葡萄汁培養(yǎng)基：培養(yǎng)基配制參照文獻(xiàn)[15]，略有改動。100 g·L-1葡萄糖，100 g·L-1果糖，0.2 g·L-1檸檬酸，3 g·L-1蘋果酸，2.5 g·L-1酒石酸氫鉀，1.1 g·L-1K2HPO4，1.5 g·L-1MgSO4·7H2O，0.4 g·L-1CaCl2·2H2O，0.04 g·L-1H3BO3，10 g·L-1酵母浸粉，調(diào)節(jié) pH 至 3.5。

其他培養(yǎng)基，如YPD培養(yǎng)基[16]、發(fā)酵培養(yǎng)基[7]。所有培養(yǎng)基配制后均需121℃滅菌20 min。

1.3 儀器與試劑

DVB/CAR/PDMS 萃取纖維（50/30 μm film thickness，2 cm stableflex，Supelco，Bellefonte PA，USA），配有57330-U聯(lián)用手柄；TRACE 1310氣相色譜聯(lián)用ISQ LT單四極質(zhì)譜檢測儀（Thermo SCITNTIFIC，USA），色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25μm，Alilent J&W，USA）

分析純化學(xué)試劑：葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、亞硫酸溶液（含SO26%）、Na2CO3、Na2HPO4、檸檬酸、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、吐溫 80、醋酸鈉購于天津化學(xué)試劑公司。

色譜純化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97%）：乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、1-己醇、異丁醇、1-丁醇、異戊醇、1-辛醇、里哪醇、異丁酸、2, 3-丁二醇、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、β-大馬酮、橙花叔醇、月桂酸乙酯、己酸、1-癸醇、2-辛醇、苯甲醇、苯乙醇和辛酸等色譜純標(biāo)品購于北京Sigma-Aldrich公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌體生長動力學(xué)模型建立 模擬汁發(fā)酵：發(fā)酵畢赤酵母H5Y-28經(jīng)YPD培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)3 d，與活化的釀酒酵母按照不同菌數(shù)比10:1、4:1、1:1、1:4、1:10等比例同時接種于裝有600 mL滅菌模擬葡萄汁的 1 L錐形瓶中，單位接種量為 1×106cells/mL，文中分別用C10:1、C4:1、C1:1、C1:4、C1:10表示以上不同比例接種發(fā)酵的酒樣。試驗(yàn)以釀酒酵母單一發(fā)酵作為對照（CK），每一處理重復(fù)2次。接種后于25℃恒溫培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵，并從接種當(dāng)天起，每隔 24 h取樣，根據(jù)菌落形態(tài)的差異（圖1：H5Y-28菌落呈米白色，表面粗糙，有褶皺，不透明；F5菌落呈白色，表面光滑，中心凸起，有光澤），采用平板菌落計數(shù)法記錄WL平板上不同酵母的菌落數(shù)，用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)法記錄酵母總菌數(shù)[17]，建立菌體生長動力學(xué)模型。

模型建立[16]：菌體生長使用Logistic方程進(jìn)行曲線擬合，方程如下，其中y反映酵母總菌數(shù)，以 Lg（cells/mL）表示；x為發(fā)酵時間（hours），a為發(fā)酵過程中酵母最大生物量，b、k為模型系數(shù)。

圖1 優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母菌株H5Y-28（a）和釀酒酵母F5（b）在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of selected strain Pichia fermentans H5Y-28 (a) and S. cerevisiae F5 (b) on WL medium

1.4.2 優(yōu)選菌株胞外酶提取液的制備 優(yōu)選菌株胞外酶提取制備參考HU等[18]的方法，有所改動。將-20℃甘油保藏的優(yōu)選菌株H5Y-28接入5 mL的YPD培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h活化，然后以5%的接種量接入50 mL的YPD培養(yǎng)基中，在28℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)48 h，之后再以10%接種量接入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床（28℃、150 r/min）培養(yǎng)72 h后取適量發(fā)酵液，離心（4℃、8 000 r/min、15 min）并取上清液，將上清液經(jīng)孔徑為0.45 μm的過濾膜濾去上清液中的細(xì)胞碎片等大分子物質(zhì)，即可得到優(yōu)選酵母菌株的胞外酶提取液。該提取液應(yīng)用于葡萄酒釀造試驗(yàn)。

胞外酶提取液的糖苷酶活性[7]：以 β-葡萄糖苷酶活力表示，采用p-NPG法測定。將200 μL胞外酶提取液、750 μL 檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 5.0）、250 μL 1 mmol·L-1的對硝基苯-β-葡萄糖苷（p-NPG）溶液混勻，在40℃水浴條件下反應(yīng)30 min，然后加入1 mL 1 mol·L-1的 Na2CO3終止反應(yīng)，并用分光光度計測 400 nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出優(yōu)選菌株胞外酶提取液的β-葡萄糖苷酶活力為0.106 U·mL-1。糖苷酶酶活力單位（U）定義為：40℃下1 min內(nèi)催化生成1 μmol對硝基苯酚所要的酶量。

1.4.3 葡萄酒釀造試驗(yàn) 發(fā)酵處理：按照上述模擬汁發(fā)酵的接種比例對‘愛格麗’葡萄汁進(jìn)行混合接種發(fā)酵，試驗(yàn)以釀酒酵母單一發(fā)酵和添加優(yōu)選菌株胞外酶提取液處理的釀酒酵母純發(fā)酵為對照，每一釀造處理重復(fù)2次。

釀造工藝：‘愛格麗’葡萄經(jīng)除梗破碎后分裝至20 L玻璃罐，同時加入60 mg·L-1的SO2，在4℃條件下浸漬24 h后壓榨取汁，轉(zhuǎn)入10 L玻璃罐，加入1.0 g·L-1膨潤土下膠澄清，24 h后分離澄清汁接種酵母菌（胞外酶處理需要同時添加0.5 U·L-1優(yōu)選菌株胞外酶提取液）啟動發(fā)酵，在發(fā)酵過程中實(shí)時監(jiān)測比重和溫度，控制發(fā)酵溫度16—20℃，并在發(fā)酵旺盛期添加蔗糖使最終酒度達(dá)到（11±0.5）% vol，添加酒石酸調(diào)整酸度到6.0 g·L-1。當(dāng)含糖量低于2.0 g·L-1時，添加60 mg·L-1的 SO2終止發(fā)酵，并將葡萄酒轉(zhuǎn)入干凈衛(wèi)生的5 L玻璃罐中滿罐、密封，進(jìn)行正常的澄清、穩(wěn)定。最后，裝瓶貯藏，直至次年4月采樣分析。

1.4.4 香氣特征的感官分析 葡萄酒香氣特征采用感官量化分析法進(jìn)行感官評價，每一供試酒樣重復(fù)分析2次，使用最終量化強(qiáng)度值MF（%）對某一香氣特征進(jìn)行描述，具體方法參考 TAO等[19]的方法進(jìn)行設(shè)計。品評小組由 30名葡萄酒專業(yè)的學(xué)生組成，經(jīng)由54香氣系列的“酒鼻子”（Le Nez du Vin?，法國）聞香訓(xùn)練6—8周，直至品評小組成員對葡萄酒香氣特征辨別定性的正確率大于95%。在分析過程中，將所有供試酒樣隨機(jī)編號，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，常溫20℃條件下，黑色郁金香杯盛放酒樣30 mL，每個成員需用葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)香氣里的 5—6個特征詞匯描述樣品香氣特征，并用“五點(diǎn)標(biāo)度法”（“1”—弱；“2”—較弱；“3”—中等；“4”—較強(qiáng)；“5”—強(qiáng)）對每一香氣特征進(jìn)行量化。最終量化強(qiáng)度值MF（%）由品嘗小組對某一香氣特征詞匯的使用頻率 F（%）和強(qiáng)度平均值I（%）表示，計算公式

1.4.5 香氣成分的儀器分析 SPME樣品處理：取8 mL葡萄酒樣和內(nèi)標(biāo)溶液（2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，濃度為0.4 mg·L-1）置于15 mL裝有磁力攪拌子的頂空瓶中，加入1.0 g的NaCl，啟動攪拌子，在4℃水浴中平衡15 min，然后插入萃取纖維，40℃下攪拌吸附30 min，立即將萃取頭在GC進(jìn)樣口解吸5 min后立即手動進(jìn)樣，用于GC-MS分析。

GC-MS分析條件：無分流進(jìn)樣，離子源溫度250℃，連接桿溫度250℃，進(jìn)樣口溫度250℃，電子源電壓70 eV，燈絲流量0.2 mA，檢測器電壓350 V。載氣：He（純度99.999%），流速1 mL·min-1。柱升溫程序：以3℃·min-1從40℃升至130℃，再以4℃·min-1從130℃升至250℃，保持8 min。質(zhì)譜為電離轟擊（EI）模式，全掃描質(zhì)譜范圍 25—350 amu，掃描頻率 0.2次/s。

定性定量方法：采用標(biāo)準(zhǔn)品保留時間比對、Wiley 275.L譜庫查詢和文獻(xiàn)保留指數(shù)比對法進(jìn)行化合物定性。采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，具體定量方法參考TAO等[20]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)分析采用方差分析（ANOVA）進(jìn)行不同酒樣中揮發(fā)性香氣物質(zhì)間的顯著性檢測，采用主成分分析（Principal component analysis，PCA）進(jìn)行不同處理供試酒樣中香氣成分分布規(guī)律的研究，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19. 0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）軟件。使用 Origin 8.5軟件進(jìn)行酵母菌體生長動力學(xué)的Logistic模型建立。

2 結(jié)果

2.1 菌體生長動力學(xué)

本研究建立了發(fā)酵畢赤酵母和釀酒酵母以不同比例接種的混合發(fā)酵過程中酵母菌體的生長動力學(xué)模型，如圖2。菌體生長動力學(xué)模型擬合的相關(guān)系數(shù)R2在 0.928—0.989，擬合效果理想。不同模擬發(fā)酵體系中酵母的生長均呈現(xiàn)典型的單“S”型曲線，自接種之后的24 h內(nèi)，酵母菌體開始快速繁殖，隨后生長緩慢，分別在36—48 h進(jìn)入平衡期，菌數(shù)達(dá)到最大值108cells/mL，直至發(fā)酵結(jié)束。

圖3展示了不同比例接種發(fā)酵過程中不同酵母菌株的生長變化趨勢，結(jié)果顯示，發(fā)酵畢赤酵母H5Y-28在發(fā)酵過程中的存活數(shù)量和存在時間隨著接種比例的增加而增加，而釀酒酵母 F5的生長也受到不同程度的抑制。如圖所示，在接種比例為4:1、10:1的發(fā)酵體系中，H5Y-28的存活時間較長，存活數(shù)量較多，并且明顯抑制了釀酒酵母 F5的生長，使其達(dá)到最大菌數(shù)的時間推遲至第 3—4天，同時最大菌數(shù)（0.9×108CFU/mL）也明顯低于釀酒酵母純發(fā)酵體系中的酵母數(shù)量（1.43×108CFU/mL），而其他接種比例的發(fā)酵體系中，發(fā)酵畢赤酵母H5Y-28幾乎不影響釀酒酵母的生長數(shù)量。總體來看，發(fā)酵畢赤H5Y-28的存在并不改變釀酒酵母的生長優(yōu)勢，在發(fā)酵旺盛期和后期（第3—10天），釀酒酵母占主導(dǎo)地位，控制整個體系酒精發(fā)酵的正常進(jìn)行。

圖2 模擬體系酒精發(fā)酵過程中酵母總量模型建立及動力學(xué)參數(shù)Fig. 2 Model diagram and kinetic parameters of yeast biomass during alcohol fermentation in synthetic must medium

圖3 模擬體系酒精發(fā)酵過程中不同酵母菌生長變化趨勢Fig. 3 Evolution of different yeasts during alcohol fermentation in synthetic must medium

2.2 香氣特征分析

圖4 愛格麗干白葡萄酒不同處理下香氣感官特征的量化強(qiáng)度值MF（%）Fig. 4 Quantitative value MF (%) of aroma characteristics from different treatments of Ecolly dry white wine

圖4顯示供試酒樣中6種香氣特征的MF值較高，混合發(fā)酵和發(fā)酵畢赤酵母胞外酶處理顯著提高了‘愛格麗’干白葡萄酒的果香和花香。與釀酒酵母純發(fā)酵酒樣相比，混合發(fā)酵和胞外酶處理的酒樣中，熱帶水果香氣特征極其顯著（P＜0.01），胞外酶處理所得酒樣中熱帶水果香氣特征的MF值可達(dá)到80%，其次是處理C4:1酒樣的MF值在70%以上，而處理C1:4的MF值最低（約55%），其他處理所得酒樣中熱帶水果香氣特征的MF值較為接近，在65%左右。柑橘類和花香類香氣特征在P＜0.05水平上顯著，處理C1:1酒樣中柑橘類香氣特征的MF值最高（約50%），而處理C4:1酒樣中花香類香氣特征的MF值最高（55%以上）。對于酸果類香氣特征而言，處理C10:1酒樣的MF值最高，達(dá)到70%以上。然而，混合發(fā)酵和胞外酶處理的不同酒樣之間酸果、甜果類香氣特征的MF值基本沒有差異，且酒樣之間花香和柑橘類香氣特征的MF值也比較接近。另外，混合發(fā)酵和胞外酶處理增加了‘愛格麗’葡萄酒的生青味，但胞外酶處理和C1:1、C4:1處理所得酒樣中生青味特征的MF值在25%左右，C10:1、C1:10處理酒樣中生青味特征的MF值大于40%。

2.3 香氣成分分析

如表1所示，經(jīng)SPME-GC-MS對供試酒樣中香氣成分的定性定量分析，共確定37種香氣成分，它們在酒中的總量為 204.1—284.3 mg·L-1，而混合發(fā)酵和胞外酶處理的酒樣中香氣成分的總含量顯著高于釀酒酵母純發(fā)酵（CK）酒樣中香氣成分的總含量（204.1 mg·L-1），且1:1比例接種的酒樣中香氣成分的總含量最高（284.3 mg·L-1），品種香氣成分與發(fā)酵香氣成分含量分別比對照酒樣（釀酒酵母純發(fā)酵）高26%、39%。其中，15種香氣成分在酒中的濃度與其嗅覺閾值的比值（OAV）大于1，10種香氣成分的OAV處于0.1—1。品種香氣成分主要來源于葡萄果皮中香氣糖苷前體物質(zhì)的水解，對葡萄酒的品種和區(qū)域典型性起決定性作用；而發(fā)酵香氣成分主要為酵母在酒精發(fā)酵過程中積累的副產(chǎn)物。

2.3.1 品種香氣成分 供試酒樣中共檢測出 9種品種香氣成分，包括5種萜烯類化合物、2種C13-去甲類異戊二烯類化合物、2種C6化合物，其中5種香氣成分的OAV在0.1—1，但只有β-大馬酮的OAV大于1。整體上，發(fā)酵畢赤酵母的接種比例大于1時，供試酒樣中品種香氣成分的總含量顯著增加，而胞外酶處理酒樣中的品種香氣成分含量最高（3 495 μg·L-1）。

由表1可見，混合發(fā)酵和胞外酶處理增加了大多數(shù)萜烯類和C13-去甲類異戊二烯化合物的含量，如α-萜品醇、橙花醇、β-大馬酮，尤其是C1:1、C4:1、C10:1酒樣中這些物質(zhì)的含量顯著增加。萜烯類物質(zhì)為葡萄酒帶來花香與果香，混合發(fā)酵酒樣中萜烯類化合物的含量最高可達(dá)到CK酒樣中的1.5倍，但低于優(yōu)選酵母胞外酶處理酒樣中的含量（186 μg·L-1）。C13-去甲類異戊二烯化合物中 β-大馬酮主要賦予葡萄酒甜果香氣，葡萄螺烷使葡萄酒具有桉樹香氣、木香以及辛辣感，優(yōu)選酵母胞外酶處理的酒樣中 C13-去甲類異戊二烯化合物的含量比CK酒樣高90%。在不同比例的混合接種發(fā)酵以及胞外酶處理酒樣中，β-大馬酮的含量雖低但卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出閾值含量，其含量顯著高于CK酒樣中的含量，但酒樣間的β-大馬酮含量并無顯著差異。

C6化合物含量隨著優(yōu)選酵母接種比例升高而增加，但只有高比例接種優(yōu)選酵母所得的酒樣中的 C6化合物含量與CK酒樣中的含量存在顯著差異，胞外酶處理的酒樣中含量最高。

為了揭示不同發(fā)酵處理對葡萄酒品種香氣成分的整體影響，對供試酒樣中OAV大于0.1的品種香氣成分及成分類別進(jìn)行主成分（PCA）分析，香氣成分、香氣類別在前兩個主成分上的載荷及供試酒樣的分布見圖5。由圖可見，PC1和PC2分別占數(shù)據(jù)總體方差的92.27%和5.07%，PC1是關(guān)鍵主成分。各類品種香氣成分及 C10:1、C4:1、胞外酶處理主要分布在 PC1的正向端。分析可得，隨著發(fā)酵畢赤酵母接種比例的升高，混合發(fā)酵處理酒樣中品種香氣成分含量增加，而優(yōu)選菌株胞外酶的發(fā)酵處理更利于促進(jìn)品種香氣成分含量的增加。

2.3.2 發(fā)酵香氣成分 供試酒樣中共檢測出28種發(fā)酵香氣成分，總含量在201.7—281.2 mg·L-1，約占相應(yīng)酒樣中總香氣成分含量的99%，包括8種高級醇、13種酯類物質(zhì)、4種脂肪酸和3種苯乙基類化合物，其中14種香氣成分的OAV大于1，5種香氣成分的OAV在0.1—1。

混合發(fā)酵酒樣中高級醇總含量（104.5—128.9 mg·L-1）顯著高于 CK 酒樣中的含量（101.9 mg·L-1），但只有異戊醇在酒中的含量超過其感官閾值。與 CK酒樣相比，優(yōu)選酵母接種比例大于1時，異戊醇、1-辛醇的含量顯著升高，胞外酶處理酒樣中這兩種香氣成分的含量也顯著高于CK酒樣中的含量。

本研究中中鏈脂肪酸（己酸、辛酸、癸酸、月桂酸）的含量隨著接種比例的升高而逐漸增加，在優(yōu)選酵母接種比例大于1的酒樣中，其含量大約是CK酒

樣中的2.0—2.5倍。相對地，供試酒樣中中鏈脂肪酸乙酯的含量也隨著優(yōu)選酵母接種比例的升高而顯著增加。當(dāng)優(yōu)選酵母接種比例達(dá)到10:1時，中鏈脂肪酸乙酯的含量可達(dá)到釀酒酵母純發(fā)酵的1.2—1.8倍，然而在 1:1接種優(yōu)選酵母的混合發(fā)酵酒樣中中鏈脂肪酸乙酯的總量最高，高于釀酒酵母純發(fā)酵的40%。但是，在混合發(fā)酵的供試酒樣中，短鏈脂肪酸乙酯和其他酯類的含量并沒有顯著增加，甚至某些酯類（2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、丁二酸二乙酯）的含量有明顯下降。

表1 優(yōu)選酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵的供試酒樣中香氣成分含量（μg·L-1）Table 1 Aroma compounds in the wine samples fermented by mixed inoculation of selected Pichia fermentans and Saccharomyces cerevisiae (μg·L-1)

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

苯乙基類化合物賦予葡萄酒果香和花香，試驗(yàn)中檢測到3種苯乙基類化合物，它們在混合發(fā)酵和胞外酶處理酒樣中的總含量為 79.0—124.4 mg·L-1，均超出CK酒樣中的總量（67.1 mg·L-1），其中苯乙醇和乙酸苯乙酯的OAV大于1。苯乙醇在供試酒樣中的含量顯著高于CK酒樣中的含量，但不同比例接種優(yōu)選酵母混合發(fā)酵和胞外酶處理卻使乙酸苯乙酯的含量有所降低。

對所有OAV大于0.1的發(fā)酵香氣成分及其類別進(jìn)行PCA分析，前兩個主成分上的發(fā)酵香氣成分載荷及酒樣分布見圖6。如圖所示，PC1、PC2分別占數(shù)據(jù)總體方差的 46.50%和 21.67%，大部分發(fā)酵香氣成分和處理C4:1、C1:1、C10:1以及胞外酶處理同時分布于PC1正向端，尤其是乙酸酯、中鏈脂肪酸及其酯類和處理C4:1、C1:1、C10:1主要分布于第一象限，而高級醇、短鏈脂肪酸乙酯和胞外酶處理分布在第四象限。處理 C1:10、C1:4分布在第二象限，周圍主要分布了其他酯類和苯乙基類的香氣成分。CK處于第三象限，其周圍無香氣成分分布。分析可得，1:1、4:1、10:1比例接種發(fā)酵畢赤酵母混合發(fā)酵有利于乙酸酯、中鏈脂肪酸及其酯類含量的增加，而胞外酶處理對發(fā)酵香氣成分的貢獻(xiàn)較小。

3 討論

3.1 混合發(fā)酵過程中的菌體生長變化

近年來，許多研究者和釀酒師在葡萄酒釀造過程中已不僅僅局限于釀酒酵母的單一使用，他們開始青睞優(yōu)選非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵以改善葡萄酒的風(fēng)味與香氣，尤其是對于中性葡萄品種的釀造[6]?；旌习l(fā)酵過程中香氣的形成與酵母生長息息相關(guān)，WANG等[27]采用干質(zhì)量稱重法測定出在葡萄酒酒精發(fā)酵期間酵母菌的菌體生長遵循“S”形曲線增長，同時有研究發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵過程中酵母的總生長量與釀酒酵母純發(fā)酵的總菌數(shù)一致（約108CFU/mL）[28]。本研究也發(fā)現(xiàn)，不同混合發(fā)酵體系中菌體的生長遵循“S”形增長，且在酵母生長穩(wěn)定期總菌數(shù)保持一致。然而，在混合發(fā)酵過程中不同菌種的生長之間往往存在相互作用。DOMIZIO[12]研究表明，高比例（100:1、10 000:1）接種異常畢赤酵母（P. anomala）的發(fā)酵初期，該酵母的生長會抑制釀酒酵母的生長。李婷等[29]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵畢赤酵母（P. fermentans）與釀酒酵母 1:1接種混合發(fā)酵中的釀酒酵母數(shù)量低于釀酒酵母純發(fā)酵時的菌體數(shù)量，而非釀酒酵母只存在于發(fā)酵的初期階段，在發(fā)酵旺盛期和末期，釀酒酵母占主導(dǎo)地位，控制酒精發(fā)酵進(jìn)程。本研究中，高比例（4:1、10:1）接種發(fā)酵畢赤酵母H5Y-28會延緩釀酒酵母的生長且降低釀酒酵母的生長數(shù)量，但是，釀酒酵母仍然在發(fā)酵過程中占據(jù)主導(dǎo)地位，直到酒精發(fā)酵徹底完成。不同的是，發(fā)酵畢赤酵母的存活數(shù)量和存活時間隨著非釀酒酵母接種比例的升高而增加，這可能是高比例接種該酵母影響釀酒酵母生長的直接原因，但它并不改變釀酒酵母的生長優(yōu)勢，能夠保證酒精發(fā)酵的順利完成。

3.2 混合發(fā)酵的接種比例對葡萄酒香氣成分的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，混合發(fā)酵所得的酒樣中香氣成分的含量隨著發(fā)酵畢赤酵母H5Y-28接種比例的升高而增加，尤其是高比例接種該酵母所得酒樣中的香氣成分含量顯著增加，這可能與發(fā)酵過程中該酵母的存活數(shù)量和存活時長有關(guān)。LEE等[11]將土星擬威爾酵母（Williopsis saturnus）與釀酒酵母按照3種比例接種釀造木瓜酒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種比例是混合發(fā)酵調(diào)節(jié)木瓜酒風(fēng)味的重要因素，10:1接種非釀酒酵母時，該酵母在發(fā)酵過程中的存活數(shù)量和存活時間更多，同時增加了酒中乙酸酯的含量，而1:1和1:10的接種比例使酒中的乙醇酯、高級醇和2-乙酸苯乙酯含量增加。同時有研究發(fā)現(xiàn)，嗜高壓有孢漢遜酵母（H. osmophila）和釀酒酵母不同比例混合發(fā)酵的Bobal葡萄酒中2-乙酸苯乙酯的含量大約是釀酒酵母純發(fā)酵酒的3—9倍，所釀酒具有更強(qiáng)烈的果香特征[30]。NAVARRETEBOLA?OS[31]研究發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵“prickly pear”，所釀酒中富含香氣化合物，具有愉悅的果香。而CLEMENTE-JIMENEZ[14]順序接種發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母發(fā)酵，所釀酒中1-丙醇、正丁醇、2,3-丁二醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯的含量增加。本研究發(fā)現(xiàn)，較高比例同時接種發(fā)酵畢赤酵母（C1:1、C4:1、C10:1）更能促進(jìn)酒中乙酸酯、乙醇酯、異戊醇與苯乙醇的生成，尤其是中鏈脂肪酸及其酯。脂肪酸是合成乙醇酯不可或缺的前體物質(zhì)[32]，因此，隨著優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母接種比例的升高，酒中中鏈脂肪酸乙酯的含量也隨著中鏈脂肪酸的增加呈現(xiàn)出增加趨勢。但是，不同比例接種發(fā)酵卻使乙酸苯乙酯的含量有所降低，而關(guān)于優(yōu)選菌株H5Y-28導(dǎo)致乙酸苯乙酯含量降低的原因有待進(jìn)一步研究確定。

圖5 前兩個主成分上的品種香氣成分的載荷值和酒樣分布Fig. 5 Loadings of varietal aroma compounds and the distribution of the wine samples in the first two PCs

圖6 前兩個主成分上的發(fā)酵香氣成分的載荷值和酒樣分布Fig. 6 Loadings of fermentative aroma compounds and the distribution of the wine samples in the first two PCs

此外，有研究認(rèn)為，優(yōu)選非釀酒酵母菌株分泌的β-葡萄糖苷酶以及某些代謝產(chǎn)物有利于促進(jìn)葡萄酒風(fēng)味的復(fù)雜化[5]。SWANGKEAW 等[4]在塔明內(nèi)（Traminette）葡萄醪中添加漢遜酵母屬（Hanseniaspora sp.）和異常畢赤酵母（P. anomala）分泌的胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶，發(fā)現(xiàn)所釀酒中揮發(fā)性香氣成分含量增加，可達(dá)到釀酒酵母純發(fā)酵的 1.3—3.0倍。陶永勝等[7]利用葡萄汁有孢漢遜酵母（H. uvarum）的胞外酶進(jìn)行發(fā)酵前處理，所釀的干紅葡萄酒中 C13-去甲類異戊二烯類和萜烯類物質(zhì)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵畢赤酵母H5Y-28的胞外酶處理更有利于促進(jìn)品種香氣成分的形成，尤其是C13-去甲類異戊二烯，約為釀酒酵母純發(fā)酵的1.9倍。同時該研究也發(fā)現(xiàn)較高比例接種發(fā)酵畢赤酵母（C1:1、C4:1、C10:1）所得酒樣中品種香氣成分的含量顯著高于釀酒酵母純發(fā)酵酒樣中的含量，這是因?yàn)橄啾柔劸平湍?，非釀酒酵母可產(chǎn)生活性更高且更穩(wěn)定的β-葡萄糖苷酶，利于水解糖苷前體物質(zhì)促進(jìn)揮發(fā)性香氣成分的釋放[4]，而隨著發(fā)酵畢赤酵母 H5Y-28接種比例的升高，非釀酒酵母在發(fā)酵過程中的存活數(shù)量和存活時間也逐漸增加，因此混合發(fā)酵過程中的β-葡萄糖苷酶累積量越來越高，從而更有利于促進(jìn)糖苷前體物質(zhì)的水解釋放，增加混合發(fā)酵中品種香氣成分的含量。

3.3 混合發(fā)酵對葡萄酒香氣特征的影響

感官分析表明，優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵增強(qiáng)了‘愛格麗’干白葡萄酒的果香與花香，尤其是熱帶水果香氣，但酸果類和甜果類香氣特征在不同處理的酒樣之間并無顯著差異。優(yōu)選菌株胞外酶處理的酒樣中熱帶水果香氣最為顯著，而C4:1接種處理使得所釀酒表現(xiàn)出較強(qiáng)的花香特征，C1:1處理賦予所釀酒較強(qiáng)的柑橘類香氣。之前有研究證實(shí)，葡萄酒的果香和復(fù)雜性與非釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酯類物質(zhì)密切相關(guān)[8]，同時，花香和熱帶水果香氣也是增強(qiáng)葡萄酒香氣復(fù)雜性的最有利因素[33]。本研究還發(fā)現(xiàn)，高比例接種發(fā)酵畢赤酵母的酒樣中生青味特征明顯高于其他接種處理的酒樣。但是，C6化合物是葡萄酒生青氣味的主要來源[34]，本研究中該類化合物含量隨發(fā)酵畢赤酵母接種比例的升高而增加，這可能是導(dǎo)致高比例接種H5Y-28的酒樣中生青味特征較強(qiáng)的原因。

4 結(jié)論

混合發(fā)酵中酵母菌生長遵循典型的“S”型曲線增長，高比例接種發(fā)酵畢赤酵母 H5Y-28（C4:1、C10:1）會延緩釀酒酵母生長，降低其生長數(shù)量，但不影響酒精發(fā)酵的順利完成?；旌习l(fā)酵和胞外酶處理顯著增強(qiáng)了葡萄酒的果香與花香，尤其是熱帶水果香氣，但高比例接種發(fā)酵畢赤酵母酵母的生青味特征明顯。發(fā)酵畢赤酵母的胞外酶處理極有利于釋放萜烯類（α-萜品醇、橙花醇）、C13-去甲類異戊二烯（β-大馬酮）等香氣成分，尤其是C13-去甲類異戊二烯比釀酒酵母純發(fā)酵酒樣的高90%。較高比例接種發(fā)酵畢赤酵母（C1:1、C4:1、C10:1）更能促進(jìn)乙酸異戊酯、C6-C12脂肪酸（己酸、辛酸、癸酸）及其酯類、異戊醇及苯乙醇等香氣成分的形成，混合發(fā)酵（1:1）顯著增加了‘愛格麗’干白葡萄酒中品種香氣成分和發(fā)酵香氣成分的含量，分別比釀酒酵母純發(fā)酵酒樣中的含量高 26%、39%，尤其是中鏈脂肪酸含量顯著高于對照酒樣40%?？傮w來看，發(fā)酵畢赤酵母和釀酒酵母 1:1接種不影響釀酒酵母生長，并且能夠改善葡萄酒香氣，所釀酒具有較好的果香與花香。

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