代乳粉對(duì)早期斷奶沂蒙黑山羊羔小腸發(fā)育、菌群多樣性及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

李永洙，金太花，韓照清，夏春峰，晁洪雨，張乃鋒，王世琴，刁其玉

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東臨沂276000）

0 引言

【研究意義】在現(xiàn)代養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)中，為充分發(fā)揮母羊繁殖性能，對(duì)羔羊采取早期斷奶，并利用代乳粉替代母乳。羔羊從母乳到代乳粉、固體飼料的替換以及無(wú)反芻到有反芻階段的轉(zhuǎn)變，都會(huì)對(duì)早期斷奶羔羊生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不良影響。其中，斷奶應(yīng)激影響羔羊腸道菌群的平衡，造成腸道消化不良、生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、消化系統(tǒng)功能紊亂[1]等。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體影響小腸黏膜上皮細(xì)胞對(duì)單糖的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響羔羊腸道發(fā)育[2-3]。因此，探討早期斷奶羔羊飼喂代乳粉，其腸道菌群定植以及葡萄糖在小腸中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律，對(duì)于促進(jìn)早期斷奶羔羊生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有研究表明，日糧中養(yǎng)分的均衡度、可消化吸收的難易程度、微生物數(shù)量及產(chǎn)生的毒素等均可導(dǎo)致腸道發(fā)育和功能發(fā)生程序化改變[4]。胃腸道微生物區(qū)系是影響胃腸道正常消化功能的主要因素之一，有助于分解飼料中各種纖維、淀粉、蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其微生態(tài)平衡與飼糧、品種、健康狀況、生活環(huán)境及環(huán)境中共生微生物間的群體效應(yīng)等有關(guān)[5-6]，而羔羊瘤胃初期尚未發(fā)育健全，因此其養(yǎng)分消化吸收與小腸生理功能的發(fā)揮直接有關(guān)。哺乳動(dòng)物機(jī)體通過(guò) SGLT-1激活蛋白激酶C（PKC）依賴性通路調(diào)節(jié)GLUT-2對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，決定小腸轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的效率，進(jìn)而影響小腸發(fā)育程度[7-8]。此外，有研究報(bào)道，營(yíng)養(yǎng)條件的改變會(huì)使得SGLT-1和GLUT-2的基因表達(dá)量降低[9]，還可能影響動(dòng)物基因的表達(dá)[10]和蛋白的合成，包括酶的分泌、受體的合成等[11]，而基因表達(dá)以及蛋白合成的改變也可能會(huì)直接或間接的影響動(dòng)物的生長(zhǎng)速度?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】但是目前關(guān)于飼喂代乳粉條件下，沂蒙黑山羊雙胎羔羊的小腸發(fā)育與菌群定植規(guī)律、小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)量的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。沂蒙黑山羊?qū)儆谌馄そq兼用，具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、耐粗飼等優(yōu)點(diǎn)的山東省優(yōu)良地方品種之一，其繁殖性能為全年發(fā)情，可達(dá)到1年1胎或2年3胎，每胎產(chǎn)羔 1—2只等特點(diǎn)[12]。本試驗(yàn)采用沂蒙黑山羊雙胎羔羊作為研究對(duì)象，針對(duì)早期斷奶沂蒙黑山羊羔羊在飼喂代乳粉條件下腸道發(fā)育及菌群定植規(guī)律、小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)量的影響進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】旨在揭示飼喂代乳粉對(duì)早期斷奶沂蒙黑山羊羔羊小腸發(fā)育與菌群定植規(guī)律以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)量相關(guān)性問(wèn)題，為羔羊飼喂代乳粉及開(kāi)食料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2015年10月至2016年4月在山東省臨沂市沂南縣龍吟莊園黑山羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用雙胎沂蒙黑山羊羔羊 36只（初生重 1.84±0.86kg，均為公羊），分成2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3只。對(duì)照組（Ⅰ組）隨母哺乳至75日齡，試驗(yàn)組（Ⅱ組）于8日齡開(kāi)始逐步斷奶，并在第10日齡完全斷奶后飼喂代乳粉，所有羔羊第 15日齡起補(bǔ)飼開(kāi)食料，試驗(yàn)期為75 d。分別于第10、15、25、45和75天稱重，并各取3只進(jìn)行屠宰、稱十二指腸、空腸、回腸重量以及收集其內(nèi)容物、黏膜組織樣品。屠宰前停食、停水12 h。

1.3 試驗(yàn)飼糧

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供本試驗(yàn)所需的代乳粉（主要參照發(fā)明專利ZL201210365927.6[13]）和開(kāi)食料。其原料組成與營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1、2。

表1 代乳粉的組成及營(yíng)養(yǎng)水平 (干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of milk replacer(DM basis)

1.4 測(cè)定日糧的方法

1.4.1 飼料樣品 代乳粉和開(kāi)食料各采樣點(diǎn)收集 1次，各混合攪拌均勻后冷凍保存，檢測(cè)前在烘箱中48h制備風(fēng)干樣品，采用常規(guī)分析法[14]測(cè)定代乳粉和開(kāi)食料中相關(guān)的養(yǎng)分含量。另外，各采樣點(diǎn)的代乳粉稀釋液、母乳和開(kāi)食料收集1次，混合后過(guò)濾冷凍保存，最終10、15、25、45和75 d的各自混合物再度混合成食糜中微生物的待測(cè)樣。

1.4.2 母乳養(yǎng)分及活性物質(zhì) 在10、45、75 d收集早晨哺乳前母乳2 mL，并在4℃、6 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，移除上層乳脂和沉淀物，取上清液放置-80℃冰箱中凍存待測(cè)。母乳中類胰島素因子（IGF-1）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）、超氧化物歧化酶（SOD），均使用雙抗體夾心生物素-親和素酶聯(lián)免疫吸附（ABC-ELISA）試劑盒，試劑盒均為美國(guó)R&D公司提供。利用酶標(biāo)分析儀（DNM-9602G）測(cè)定吸光度，其波長(zhǎng)為450 nm，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

表2 開(kāi)食料原料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutritional level of starters (DM basis)

表3 沂蒙黑山羊母乳營(yíng)養(yǎng)及活性物質(zhì)水平Table 3 The level of nutrition and active substance in the milk of Yimeng black goat

1.5 飼養(yǎng)管理

參照王海超等[15]方法哺喂羔羊，羔羊均于15 d開(kāi)始訓(xùn)練采食相同的開(kāi)食料，自由采食和飲水。表4為兩組羔羊從15 d開(kāi)始在不同日齡階段日均開(kāi)食料干物質(zhì)采食量。

表4 沂蒙黑山羊羔羊不同日齡階段日均干物質(zhì)采食量Table 4 Average daily DM intake of Yimeng black goat lambs at different days of age（g）

1.6 屠宰及樣品采集

屠宰時(shí)采用頸靜脈放血，屠宰后，打開(kāi)腹腔，立即結(jié)扎賁門(mén)瓣、直腸遠(yuǎn)段，將羔羊胃腸道取出，小心剝離并在腸段連接處進(jìn)行結(jié)扎、剪斷。在無(wú)菌操作臺(tái)下，分別收集十二指腸、空腸和回腸的內(nèi)容物，將3只羔羊各自不同部位腸內(nèi)容物均勻混合，分裝到2 mL離心管，-20℃保存?zhèn)溆?，用于分析菌群多樣性。另外，去除腸系膜與小腸外部脂肪，分離小腸各腸段，用生理鹽水漂洗后，分別對(duì)十二指腸近端（5 cm處）、空腸近端1/4處及回腸末端（靠近盲腸20 cm處）剪開(kāi)，并用載玻片刮取黏膜組織樣，及時(shí)裝入已消毒的離心管，速用液氮冷凍并轉(zhuǎn)入-80℃冰箱儲(chǔ)存，用于分析相關(guān)基因表達(dá)量。

1.7 小腸菌群多樣性分析

1.7.1 提取細(xì)菌總DNA 利用QIA amp? DNA Stool Mini Kit試劑盒提取細(xì)菌總DNA。采用核酸濃度測(cè)定儀（ND-2000）測(cè)定總DNA濃度，-20 ℃保存待測(cè)。

1.7.2 分析基因組總 DNA 16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增片段參照李永洙等[16]方法，PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：10×緩沖液 5 μL（含 15 mmol·L-1MgCl2），d NTP（10 mmol·μL-1）4 μL，引物（27f-GC、1495r, 10μmol·μL-1）1 μL、模板 DNA1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5U·μL-1）0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。用于擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)基因的通用引物序列為，上游引物：AD27f-GC（5'-AGAGTTTGA TCCTGG-3'）和下游引物：1495 r（5'-CTACGGCTACCTTGTA -3'），由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.7.3 分析基因組總DNA 16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增片段以及割膠回收、提純和基因載體的連接、檢測(cè) 參照李永洙等[16]方法，使用Bio-Rad Dcode進(jìn)行DGGE凝膠電泳，并對(duì)相應(yīng)的微衛(wèi)星引物（27f和1495r）進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增。此后，用無(wú)菌手術(shù)刀將凝膠電泳割膠回收，對(duì)其回收產(chǎn)物進(jìn)行提純，構(gòu)建克隆文庫(kù)，并用PCR和電泳確定克隆片段的正確性。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)處理后用310型DNA測(cè)序儀測(cè)序。所得上述結(jié)果在Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索對(duì)比，確定細(xì)菌種類和名稱，并進(jìn)行同源性分析。

1.8 小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因相對(duì)表達(dá)量的分析

1.8.1 小腸內(nèi)容物中總RNA提取 取十二指腸、空?qǐng)龊突啬c內(nèi)容物100 mg，使用Trizol（in vitro gen）試劑盒提取總RNA，核酸濃度測(cè)定儀（ND-2000）測(cè)定RNA濃度及純度。

1.8.2 總RNA質(zhì)量及反轉(zhuǎn)錄效果檢測(cè) 通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估總RNA的質(zhì)量見(jiàn)圖1?？俁NA的28 S和18 S兩條帶清晰，無(wú)DNA污染條帶及明顯降解條帶，表明提取總RNA純度較高，質(zhì)量可靠。

圖1 總RNA凝膠電泳圖Fig. 1 The electrophoresis gram of total RNA

1.8.3 引物檢測(cè) 以不同組織總RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用常規(guī) PCR法對(duì)所設(shè)計(jì)的 2對(duì)引物（SGLT-1和GLUT-2）進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)見(jiàn)圖2。

圖2 SGLT-1和GLUT-2 mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR電泳圖Fig. 2 The electrophoresis gram of SGLT1 and GLUT-2 mRNA by real-time fluorescence quantitative PCR

1.8.4 DNA消化和反轉(zhuǎn)錄 分別取3 μg總RNA，對(duì)其利用DNA酶（Fermentas）去除痕量DNA后，之后反轉(zhuǎn)錄獲得各樣品RNA的c DNA產(chǎn)物。并保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8.5 目的基因引物設(shè)計(jì)和 RT-PCR反應(yīng)條件建立使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，依托上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列及參數(shù)見(jiàn)表5。以?-actin管家基因作為內(nèi)標(biāo)，采用Real-Time PCR法對(duì)SGLT-1、GLUT-2mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。以最小Ct值和最高熒光值為標(biāo)準(zhǔn)。

1.8.6 PCR產(chǎn)物克隆、序列測(cè)定及RT-PCR分析 分析擴(kuò)增產(chǎn)物，并對(duì)切膠回收純化之后，將純化產(chǎn)物連接于載體中（pGEM-T Easy）。把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)接到E.coliDH5a 感受態(tài)細(xì)胞上，采用菌落PCR法鑒定陽(yáng)性克隆和測(cè)序，將上述測(cè)序結(jié)果依據(jù) Gen-Bank登錄的SGLT-1、GLUT-2和?-actin 基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.8.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 參照TAVERNIERS等[17]方法，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，其濃度用紫外分光光度儀（UV-6000PC）測(cè)定，使用已優(yōu)化條件的 PCR進(jìn)行RT-PCR，縱坐標(biāo)為Ct值，橫坐標(biāo)為稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)，繪制相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。以?-actin為內(nèi)標(biāo)，對(duì)SGLT-1、GLUT-2相對(duì)表達(dá)量定量分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.9.1 使用分析軟件 Bio Numerics 3.0（Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium）來(lái)分析 PCRDGGE 指紋圖譜進(jìn)行條帶計(jì)數(shù)，利用 Dice法計(jì)算相似性指數(shù)Cs，采用UPGM-A（un weighted pair group mean average）進(jìn)行聚類分析。

1.9.2 采用 2△△CT法[18]計(jì)算相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ±SD）表示，n=3，用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析（One-way ANOVA），以Duncan氏方法進(jìn)行多重比較。

表5 Real-Time PCR中使用的各種引物Table 5 Primers for Real-Time PCR

2 結(jié)果

2.1 飼喂代乳粉對(duì)沂蒙黑山羊羔羊日增重以及腸道發(fā)育的影響

從表6中可見(jiàn)，Ⅱ組平均日增重第10、15天時(shí)小于Ⅰ組，到 25 d時(shí)大于Ⅰ組，但差異均不顯著（P＞0.05），而45 d時(shí)顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），第75 天時(shí)其差異極顯著（P＜0.01）。另外，10—25d間Ⅱ組十二指腸重量小于Ⅰ組，25d后大于Ⅰ組，但差異均不顯著（P＞0.05）；Ⅱ組空腸、回腸重量25 d時(shí)大于Ⅰ組，但差異均不顯著（P＞0.05），而45 d時(shí)其差異顯著（P＜0.05），第75 天時(shí)回腸差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 飼喂代乳粉對(duì)沂蒙黑山羊羔羊小腸微生物菌群多樣性的影響

從圖3中可見(jiàn)，盡管哺喂母乳和代乳粉，但由于統(tǒng)一使用開(kāi)食料，所以不可避免的產(chǎn)生共性條帶；在小腸同一部位，不同日齡平均條帶數(shù)差異顯著（P＜0.05），其中空腸、回腸平均條帶數(shù)顯著高于十二指腸（P＜0.05）。兩組空腸內(nèi)容物混合物中細(xì)菌種類分別 14、14、9、11、12（共 60）和 11、10、12、15、13（共61）條；而十二指腸中細(xì)菌種類分別15、14、15、8、12（共 64）和 12、13、11、11、13（共 60）條；回腸中細(xì)菌種類分別13、10、14、11、9（共57）和8、12、13、14、13（共60）條。結(jié)果表明十二指腸在45、75 d，空腸在15 d，回腸在10 d時(shí)兩組間菌群變化較為明顯（P＜0.05）。

采用Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)方法對(duì)小腸部位菌群多樣性進(jìn)行分析，其結(jié)果見(jiàn)表7。Ⅰ、Ⅱ組菌群多樣性變化較為相似，10、25 d時(shí)多樣性指數(shù)Ⅰ組大于Ⅱ組，而45、75 d時(shí)Ⅱ大于Ⅰ組；Ⅰ組回腸平均多樣性指數(shù)大于Ⅱ組，而十二指腸平均多樣性指數(shù)小于Ⅱ組，且差異不顯著（P＞0.05）；對(duì)于小腸各腸段菌落多樣性指數(shù)，從高到低依次排序，分別為回腸、空腸和十二指腸，且差異不顯著（P＞0.05）。

表6 代乳粉對(duì)沂蒙黑山羊羔羊日增重及腸道發(fā)育的影響Table 6 Effect of milk replacer on daily gain and development of intestine of Yimeng black goat lambs (g)

圖3 不同腸段微生物細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)共性、特異性PCR-DGGE指紋圖譜Fig. 3 Common character and specificity PCR-DGGE DNA fingerprint of the V3 region of 16S rDNA gene in the microbial bacteria of different intestinal segments

2.3 飼喂代乳粉對(duì)沂蒙黑山羊小腸內(nèi)容物中菌落組成的影響

從圖4中可見(jiàn)，Ⅰ組十二指腸菌群相似性指數(shù)在15 d時(shí)達(dá)到高峰，且極顯著高于45、75 d（P＜0.01），Ⅱ組10 d時(shí)顯著高于25、45 d（P＜0.05），而45 d后呈上升趨勢(shì)；Ⅰ、Ⅱ組空腸分別在25、15 d時(shí)達(dá)到高峰，且均顯著高于 75 d（P＜0.05）；Ⅰ組回腸在15、75 d 相似性指數(shù)顯著低于 10、25、45 d（P＜0.05），而Ⅱ組15 d后呈上升趨勢(shì)，且75 d時(shí)差異極顯著高于15 d（P＜0.01）。結(jié)果表明Ⅰ組空腸、回腸相似性指數(shù)在25 d后呈下降趨勢(shì)，且回腸在75 d時(shí)顯著下降（P＜0.05）；Ⅱ組15 d后空腸相似性指數(shù)下降，而回腸上升，且差異極顯著（P＜0.01）。

Ⅰ、Ⅱ組 16S rDNA 基因 V3 區(qū)PCR-DGGE圖譜的PCA分析見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，Ⅰ、Ⅱ組10、15 d時(shí)各腸段菌群組成與食糜（F）相似，而25 d時(shí)Ⅰ、Ⅱ組的空腸與回腸菌群組成有分開(kāi)趨勢(shì)，45 d空腸與回腸菌群組成分開(kāi)明顯。

表7 不同腸段腸道菌群的Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)變化Table 7 Shannon-Wiener and Simpson index changes of intestinal flora in the different intestinal segments

圖4 腸道不同部位主要菌群相似性系數(shù)關(guān)系Fig. 4 Similarity coefficient relation of the main flora in the different parts of the intestine

2.4 飼喂代乳粉對(duì)沂蒙黑山羊羔羊小腸腸道內(nèi)容物菌落物種多樣性的影響

圖3中箭頭所指的指紋圖譜中分別割膠回收測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表8。兩組各腸段部位菌群定植受到食糜中的溶淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus strain2條帶）、普雷沃氏菌（Prevotella species3條帶）影響較大。Ⅰ組十二指腸的草酸桿菌（Oxalobacteraceae bacterium5條帶）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus vaginalispartial8條帶）在45 d時(shí)消失，而75 d時(shí)可檢測(cè)；與Ⅰ組相比，Ⅱ組草酸桿菌（Oxalobacteraceae bacterium5條帶）提前在25 d時(shí)消失，45 d時(shí)可檢測(cè)發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus vaginalis partial8條帶）。Ⅰ組空腸的約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii11條帶）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium strain14條帶）、不可培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured Acetanaero bacterium sp15條帶）在25 d后消失，而Ⅱ組25 d后可檢測(cè)約氏乳桿菌，45、75 d時(shí)均可檢測(cè)到不可培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured Acetanaero bacterium sp15條帶）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium strain14條帶）。Ⅰ組回腸的不可培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured Acetanaero bacterium sp15條帶）在10 d消失，而Ⅱ組在15d之后均可檢測(cè)；Ⅰ組回腸的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus vaginalis partial8條帶）、食淀粉乳桿菌（Lactobacillus_amy-lovorus20條帶）在25 d后消失，而Ⅱ組25 d后均可檢測(cè)。本試驗(yàn)測(cè)序結(jié)果與Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)微生物同源性比較分析來(lái)看，其同源性大部分超過(guò)98%甚至100%。然而，對(duì)于具有92、90、92、90%同源性的3、5、12、17條帶的普雷沃氏菌（Prevotella species）、草酸桿菌（Oxalobacteraceae bacterium）、瘤胃球菌（Ruminococcaceae）和氨基酸球菌（AcidaMinoCoccaceae）可推測(cè)為新種。

圖5 不同腸段微生物細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜的PCA分析Fig. 5 PCA analysis of the V3 region PCR-DGGE finger print of 16S rRNA gene of microbial bacterial in the different intestinal segments

2.5 沂蒙黑山羊羔羊小腸組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體（SGLT-1、GLUT-2）基因mRNA表達(dá)量分析

圖6中可見(jiàn)，Ⅰ組各腸段中SGLT-1和GLUT-2mRNA表達(dá)量25 d時(shí)最低，而后逐漸升高，但差異不顯著（P＞0.05）；Ⅱ組除空腸黏膜中GLUT-2mRNA表達(dá)量以外（P＜0.05），各腸段中SGLT-1和GLUT-2mRNA表達(dá)量10 d時(shí)最低（P＜0.01），而25 d后其表達(dá)量顯著高與10d（P＜0.05）；Ⅱ組各腸段中SGLT-1和GLUT-2mRNA表達(dá)量在 25 d后均高于Ⅰ組；SGLT-1和GLUT-2基因表達(dá)量呈現(xiàn)腸段部位間差異。其中，SGLT-1mRNA表達(dá)量在空腸最為明顯，其次為回腸，十二指腸最低，而GLUT-2mRNA表達(dá)量在十二指腸最為明顯，其次為空腸和回腸。

3 討論

3.1 代乳粉對(duì)沂蒙黑山羊羔羊日增重以及腸道發(fā)育的影響

刁其玉等[19]認(rèn)為，代乳粉可以作為早期斷奶羔羊母乳的代替品，但其效果受到諸多方面影響。譬如，代乳粉營(yíng)養(yǎng)素的組成、飼喂方式、斷奶日齡、羔羊健康狀態(tài)、設(shè)施環(huán)境等。已有研究表明，代乳粉組在試驗(yàn)初期與母乳組比較體重差異不明顯，而后期代乳粉組平均體重及日增重均大于母乳組，羔羊體增重和平均日增重相對(duì)于母羊哺乳的羔羊分別高于 26.4%和18.6%。另外，代乳粉組羔羊的十二指腸、空腸、回腸鮮重分別比對(duì)照組高14.85%、10.61%、75.28%。其中，回腸發(fā)育差異較大[20-21]。此外，張慶麗等[9]報(bào)道，早期能量與蛋白質(zhì)缺乏對(duì) 28日齡斷奶羔羊胃腸道器官發(fā)育有顯著影響。本研究中，25 d時(shí)飼喂代乳粉羔羊的日增重速度和腸道發(fā)育較慢，顯著低于母乳組，而45 d時(shí)羔羊平均日增重、空腸和回腸重量顯著高于母乳組，且75 d時(shí)差異極顯著，與前者試驗(yàn)結(jié)果相一致。這可能是與母乳和代乳粉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組成直接相關(guān)，本研究檢測(cè)母乳中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及活性物質(zhì)，其結(jié)果顯示25 d后母乳中活性物質(zhì)指標(biāo)顯著下降，并且蛋白能量比與代乳粉組比較逐漸降低，這些蛋白能量營(yíng)養(yǎng)素的短缺影響瘦肉組織沉積和蛋白質(zhì)合成周轉(zhuǎn)，導(dǎo)致日增重偏低[22]，而代乳粉中養(yǎng)分含量相對(duì)穩(wěn)定，雖然在試驗(yàn)初期應(yīng)激較大，但經(jīng)過(guò)20 d左右適應(yīng)過(guò)程促進(jìn)羔羊的腸道發(fā)育乃至生長(zhǎng)發(fā)育。

表8 PCR-DGGE共性條帶和特異性條帶的基因片段序列的比對(duì)結(jié)果Table 8 The comparison results of gene fragment sequences of PCR-DGGE common and specific bands analysis

圖6 SGLT-1mRNA在沂蒙黑山羊羔羊小腸中的差異性表達(dá)Fig. 6 The differential expression of SGLT-1 mRNA in small intestine of Yimeng black goat lambs

圖7 GLUT-2 mRNA在沂蒙黑山羊羔羊小腸中的差異性表達(dá)Fig. 7 The differential expression of GLUT-2 mRNA in small intestine of Yimeng black goat lambs

3.2 飼喂代乳粉對(duì)沂蒙黑山羊羔羊小腸微生物菌群多樣性的影響

已有研究報(bào)道[19-20]，飼糧組成、日齡以及環(huán)境條件均影響腸道菌群結(jié)構(gòu)。其中，日齡因素對(duì)腸道早期菌群定植影響較大，而到成熟期腸道菌群定植趨于相對(duì)平衡，此后腸道菌群多樣性主要受到飼料組成和飼養(yǎng)環(huán)境條件的影響[23]。李小鵬等[24]認(rèn)為，反芻動(dòng)物胃腸道內(nèi)微生物區(qū)系不是一出生就存在的，而是出生后隨著與母體和環(huán)境的接觸，經(jīng)過(guò)消化道環(huán)境的適應(yīng)和選擇，經(jīng)定植、存活和繁殖逐步建立起來(lái)的。當(dāng)家畜發(fā)生應(yīng)激（環(huán)境條件）時(shí)，可引起宿主腸道菌落結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致消化道菌群紊亂，微生態(tài)平衡破壞[25]。相似性指數(shù)的高低間接地說(shuō)明共性菌群以外的菌群情況[26]。本研究結(jié)果表明，Ⅰ組回腸在25 d后相似性指數(shù)呈下降趨勢(shì)，而Ⅱ組回腸在15 d后逐漸上升。筆者認(rèn)為，瘤胃功能尚未健全之際，作為微生物較為豐富的回腸，在代乳粉飼喂25 d后共性菌群比率逐漸增加，促進(jìn)其菌群平衡，反映羔羊腸道適應(yīng)環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)。對(duì)于反芻動(dòng)物而言，按不同的生理階段分為非反芻階段（1—20日齡），過(guò)渡階段（21—56日齡），反芻階段（57日齡后），而在反芻功能逐漸完善過(guò)程中胃腸道生理機(jī)能和菌落會(huì)發(fā)生較大變化[27-28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，空腸和回腸在 25 d后菌群變化較為明顯，而十二指腸在45、75 d時(shí)菌群變化較大。有研究已證實(shí)，除了瘤胃具有強(qiáng)大的降解纖維物質(zhì)的能力外，反芻動(dòng)物小腸（包括空腸和回腸）對(duì)飼糧纖維類物質(zhì)亦有很強(qiáng)的補(bǔ)償消化能力，說(shuō)明反芻動(dòng)物后消化道消化能力的建立和完善與后腸道定植的細(xì)菌數(shù)量和種類直接相關(guān)[29-30]。本研究結(jié)果也反映代乳粉飼喂對(duì)后腸道菌群定植有一定的影響作用，Ⅱ組十二指腸發(fā)酵乳桿菌，空腸約氏乳桿菌、巨大芽孢桿菌，回腸發(fā)酵乳桿菌、食淀粉乳桿菌等有益菌與Ⅰ組相比提前定植，本試驗(yàn)結(jié)果與UYENO等[31]分析荷斯坦母牛從出生到 12周的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化結(jié)果相吻合。

3.3 沂蒙黑山羊羔羊小腸組織黏膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)

鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體-1（SGLT-1）和促葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體-2（GLUT-2）是小腸中葡萄糖的吸收所需要的特殊葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體[33]。家畜腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因 mRNA表達(dá)量的變化反映了動(dòng)物胃腸道中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的狀態(tài)，哺乳動(dòng)物從出生至斷奶階段，SGLT-1基因在腸道中的表達(dá)較強(qiáng)，對(duì)己糖的攝取能力強(qiáng)；斷奶后，SGLT-1基因的表達(dá)量明顯減少，對(duì)己糖的吸收也減少[34]。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，Ⅱ組 8 d開(kāi)始斷奶后10 d時(shí)SGLT-1和GLUT-2mRNA表達(dá)量最低，而25 d后Ⅱ組表達(dá)量均高于Ⅰ組，此結(jié)果與Ⅱ組沂蒙黑山羔羊斷奶過(guò)渡階段羔羊機(jī)體組織從依賴母乳中葡萄糖轉(zhuǎn)換為依靠腸道生酮作用而提供能量的生理變化適應(yīng)過(guò)程直接相關(guān)。另外，25 d后Ⅰ組母乳中蛋白能量比的逐漸下降，會(huì)導(dǎo)致羔羊生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受阻，且機(jī)體組織細(xì)胞發(fā)育、增殖的調(diào)控轉(zhuǎn)錄表達(dá)都受到抑制[35]，以及影響胃腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體相關(guān)基因表達(dá)[36]。羔羊由于處在特殊的生理階段，對(duì)碳水化合物的消化吸收與單胃動(dòng)物相似。本研究結(jié)果顯示，飼喂代乳粉25 d時(shí)有益菌定植，有助于腸道分解消化能力，導(dǎo)致胃腸道內(nèi)葡萄糖濃度有所升高。當(dāng)腸腔中葡萄糖的含量較高時(shí)，反芻動(dòng)物可以通過(guò)增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的數(shù)量從而調(diào)整它們的吸收能力以提高小腸中葡萄糖的吸收效率[37-38]，進(jìn)而腸道的吸收功能得到增強(qiáng)，有利于斷奶后羔羊胃腸道功能的正常發(fā)揮。

總之，本研究結(jié)果表明，各腸段SGLT-1和GLUT-2mRNA表達(dá)量在25 d后Ⅱ組均高于Ⅰ組，此時(shí)空腸和回腸的菌群變化最大，并且有益菌定植比Ⅰ組提前，而日增重與空腸和回腸發(fā)育均在45d時(shí)Ⅱ組均顯著高于Ⅰ組。這一結(jié)果說(shuō)明除日糧（包括母乳）營(yíng)養(yǎng)素原因之外，可能還有代乳粉飼喂25d時(shí)有益菌提前定植，提高腸道分解消化能力，造成胃腸道內(nèi)葡萄糖濃度有所升高，影響空腸和回腸中SGLT-1和GLUT-2mRNA表達(dá)量，而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)量的變化直接影響腸道組織發(fā)育乃至機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，至于其分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

飼喂代乳粉第 25天時(shí)促進(jìn)沂蒙黑山羊早期斷奶羔羊空腸、回腸有益菌提前定植，并通過(guò)調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)而引起葡萄糖吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的改變，進(jìn)而影響羔羊后期腸道組織及機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育。

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