抗氟苯蟲酰胺小菜蛾差異表達(dá)基因及其通路

王成花，孫詩(shī)晴，徐巨龍，趙小龍，薛超彬

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

0 引言

【研究意義】小菜蛾（Plutella xylostella）屬鱗翅目菜蛾科，主要危害甘藍(lán)等十字花科植物，幼蟲取食葉片，苗期集中危害心葉，嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量及品質(zhì)，成為世界性的蔬菜害蟲。氟苯蟲酰胺（flubendiamide）是由日本農(nóng)藥株式會(huì)社和德國(guó)拜耳公司聯(lián)合開發(fā)的一種鄰苯二甲酰胺類殺蟲劑，其主要作用靶標(biāo)為昆蟲魚尼丁受體（ryanodine receptor，RyR），該藥劑已廣泛應(yīng)用于鱗翅目害蟲的防治，效果優(yōu)良，但近年來(lái)小菜蛾等鱗翅目害蟲對(duì)該藥劑的抗性越發(fā)突出。因此，明確小菜蛾對(duì)氟苯蟲酰胺的抗性機(jī)理對(duì)合理控制小菜蛾及其抗藥性發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2008—2011年，泰國(guó)Tha Muang地區(qū)小菜蛾對(duì)氟苯蟲酰胺的抗性由1.5倍發(fā)展到4 817倍[1]；2012年，泰國(guó)Sai Noi地區(qū)小菜蛾對(duì)氟苯蟲酰胺的抗性倍數(shù)超過750倍；菲律賓 Sudlon地區(qū)小菜蛾田間種群對(duì)氟苯蟲酰胺的抗性超過1 300倍[2]，2015年該Sudlon種群對(duì)氟苯蟲酰胺的抗性超過10 000倍[3]。中國(guó)廣東增城地區(qū)的小菜蛾田間種群對(duì)氟苯蟲酰胺的抗性高達(dá)1 779倍[4]。除此之外，其他鱗翅目害蟲也對(duì)氟苯蟲酰胺產(chǎn)生了不同程度的抗性，如茶小卷葉蛾（Adoxophyes honmai）對(duì)氟苯蟲酰胺的抗性達(dá) 105倍[5]；番茄潛葉蛾（Tuta absoluta）對(duì)氟苯蟲酰胺的抗性超過1 000倍[6]。抗性機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，泰國(guó)和菲律賓的小菜蛾田間高抗種群中魚尼丁受體基因（PxRyR）的4 946位均存在一個(gè)甘氨酸（G）到谷氨酸（E）的突變[7]，其位于受體基因羧基末端的跨膜區(qū)附近，且在所有昆蟲魚尼丁受體中高度保守，被認(rèn)為是導(dǎo)致小菜蛾對(duì)氯蟲苯甲酰胺產(chǎn)生抗性的主要原因。此外，解毒酶活性的提高，如細(xì)胞色素 P450單加氧酶活性的提高（P450）、羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性的提高[8-9]；PxRyR中G4946E、E1338D、Q4594L和I4790M等4個(gè)位點(diǎn)的協(xié)同突變[10]和PxRyRmRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化等[4,11-12]，也是小菜蛾對(duì)氯蟲苯甲酰胺產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在小菜蛾對(duì)雙酰胺類殺蟲劑抗性機(jī)制的研究中，多數(shù)報(bào)道均以氯蟲苯甲酰胺為藥劑對(duì)象，但小菜蛾對(duì)氟苯蟲酰胺與氯蟲苯甲酰胺的抗性機(jī)制是否一致，目前還未有明確的認(rèn)識(shí)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以小菜蛾抗氟苯蟲酰胺品系為試材，從轉(zhuǎn)錄組水平研究小菜蛾對(duì)氟苯蟲酰胺的抗性機(jī)制，進(jìn)一步揭示其抗性機(jī)理。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2016年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)和深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

1.1 供試材料

小菜蛾敏感品系（S）于2006年采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)實(shí)驗(yàn)站園，在室內(nèi)不接觸任何藥劑，用甘藍(lán)苗長(zhǎng)期飼養(yǎng)且穩(wěn)定繁殖；抗氟苯蟲酰胺品系（Rh）是敏感品系小菜蛾在氟苯蟲酰胺藥劑的持續(xù)選擇壓力下篩選至28代（Rh28），其抗性倍數(shù)為397.08倍；田間抗性種群（Rz）于2012年10月采集于廣州增城市周邊蔬菜田，在室內(nèi)無(wú)農(nóng)藥暴露情況下繁殖到第 36代（Rz36），與 S品系相比，該種群對(duì)氟苯蟲酰胺藥劑的抗性倍數(shù)為98.12倍。

1.2 RNA提取及檢測(cè)

選取標(biāo)準(zhǔn)一致的小菜蛾3齡幼蟲，迅速用液氮冷凍，用RNAsimp Total RNA Kit試劑盒提取RNA，并利用 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將得到的質(zhì)量較高RNA樣品送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司，利用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行高通量測(cè)序。每個(gè)樣品提供3次重復(fù)。并對(duì)質(zhì)檢合格的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，包括抗氟苯蟲酰胺品系與敏感品系對(duì)比（Rh28-vs-S）、抗氟苯蟲酰胺田間抗性種群與敏感品系對(duì)比（Rz36-vs-S），及抗氟苯蟲酰胺品系與抗氟苯蟲酰胺田間抗性種群對(duì)比（Rh28-vs-Rz36），并進(jìn)行相關(guān)生物信息分析。

1.3 基因定量方法

將3組樣品間兩兩比較，用RSEM工具[13]進(jìn)行基因表達(dá)定量。表達(dá)定量的結(jié)果以FPKM為單位，具體計(jì)算公式如下：

式中，F(xiàn)PKM（A）表示為基因A的表達(dá)豐度，C為唯一比對(duì)到基因A的fragments數(shù)，N為唯一比對(duì)到參考基因的總fragments數(shù)，L為基因A編碼區(qū)的堿基數(shù)。FPKM法能夠消除由于基因長(zhǎng)度和測(cè)序質(zhì)量差異的影響，使得到的基因量更加準(zhǔn)確地比較不同樣品間的表達(dá)差異。

1.4 明確差異基因

為了挖掘樣本間的顯著差異基因，基于泊松分布的分析方法，并參照 AUDIC等[14]的方法，假設(shè)觀測(cè)到基因A對(duì)應(yīng)的reads數(shù)為x，已知在一個(gè)大文庫(kù)中，每個(gè)基因的表達(dá)量只占所有基因表達(dá)量的一小部分，在這種情況下，x的分布服從泊松分布：

之后，對(duì)差異檢驗(yàn)的P值作多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過控制FDR（False Discovery Rate）來(lái)決定P值的域值[15]。在得到差異檢驗(yàn)的FDR值同時(shí)，根據(jù)基因的表達(dá)量（FPKM值）計(jì)算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。FDR值越小，差異倍數(shù)越大，則表明表達(dá)差異越顯著。本研究中，顯著差異表達(dá)基因定義為FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因。

1.5 GO顯著性富集分析

基因本體（Gene Ontology，GO）共有3個(gè)本體，分別描述基因的分子功能（molecular function）、細(xì)胞成分（cellular component）和參與的生物過程（biological process）。GO分析給出與參考基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO功能條目，從而篩選出差異表達(dá)基因與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。本研究首先把所有差異表達(dá)基因向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.geneontology.org/）的各個(gè)term映射，計(jì)算每個(gè)term的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目。通過GO功能顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能。

1.6 KEGG顯著性富集分析

京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）是關(guān)于通路（Pathway）的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)，Pathway顯著性富集分析應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，該分析的計(jì)算公式同GO功能顯著性富集分析。在差異表達(dá)基因中只有滿足Q值≤0.05才屬于顯著富集的 Pathway。通過Pathway顯著性富集分析，能夠確定差異表達(dá)基因參與的最主要的生化代謝途徑以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因

通過將抗氟苯蟲酰胺品系（Rh28）與敏感品系（S）的RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Rh28中共有540個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)的基因411個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有129個(gè)（附表1）；同樣的，將田間抗性種群（Rz36）與S品系的RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Rz36中共有439個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)的基因299個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有140個(gè)；進(jìn)一步將Rh28品系與Rz36種群數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Rh28中共有75個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)的48個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有27個(gè)。

2.2 顯著差異表達(dá)基因的基因本體（GO）分析

在得到每個(gè)差異基因的GO注釋后，用WEGO軟件[16]對(duì) 3個(gè)品系/種群間的對(duì)比（Rh28-vs-S、Rz36-vs-S和 Rh28-vs-Rz36）得到的差異基因 DEGs從生物過程/細(xì)胞組件和分子功能3大類進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，從宏觀上認(rèn)識(shí)差異基因的功能分布特征（附圖1）。其中生物黏附（biological adhesion）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）、代謝進(jìn)程（metabolic process）、免疫系統(tǒng)進(jìn)程（immune system process）、對(duì)刺激物的反應(yīng)（response to stimulus）、催化活性（catalytic activity）、酶調(diào)節(jié)活性（enzyme regulator activity）、結(jié)合因子（binding）、受體激活（receptor activity）、轉(zhuǎn)運(yùn)活力（transporter activity）、核酸綁定的轉(zhuǎn)錄因子激活（nucleic acid binding transcription factor activity）等功能都均與小菜蛾的抗性及免疫系統(tǒng)具有相關(guān)性。

2.3 顯著差異表達(dá)基因的通路（pathway）分析

利用 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì) Rh28-vs-S、Rz36-vs-S和Rh28-vs-Rz363組樣品的差異表達(dá)基因可能參與或涉及的通路（pathway）進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rh28與S品系之間共有14 527個(gè)被注釋到188條pathway上，其中包含基因數(shù)量最多的一條是代謝通路（metabolic pathway），共有2 591個(gè)基因，占總數(shù)的17.84%，與抗性相關(guān)的 pathway還包括藥物代謝——細(xì)胞色素P450（drug metabolism-cytochrome P450）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）、谷胱甘肽代謝（glutathione metabolism）、促分裂素原活化蛋白激酶信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、外來(lái)物質(zhì)代謝的細(xì)胞色素 P450（metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、心肌收縮（cardiac muscle contraction）、GABA能突觸（GABAergic synapse）、咖啡因代謝（caffeine metabolism）、黑色素生成（melanogenesis）等。

Rh28與S品系之間540個(gè)顯著差異的基因有289個(gè)被注釋到通路當(dāng)中，其中顯著性富集（Q值＜0.05）的pathway只有1個(gè)，即過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路（PPAR signaling pathway）。Rz36與S品系之間的差異基因中有237個(gè)被注釋到了KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到172條pathway，其中顯著富集的也只有1個(gè)，即 ubiquitin mediated proteolysis。而 Rh28與 Rz36品系之間的75個(gè)顯著差異性基因有56個(gè)注釋到了通路當(dāng)中，得到71條pathway，沒有顯著富集的通路。KEGG富集排名前20的pathway散點(diǎn)圖見附圖2。

2.4 抗性顯著上調(diào)基因

統(tǒng)計(jì)Rh28-vs-S，Rz36-vs-S和Rh28-vs-Rz363組間顯著上調(diào)的基因數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與S品系相比，Rh28品系顯著上調(diào)的411個(gè)基因中，有218個(gè)在Rz36種群中同樣顯著上調(diào)表達(dá)。Rh28相對(duì)于Rz36顯著上調(diào)的48個(gè)基因中，有 25個(gè)是Rh28品系特有的上調(diào)表達(dá)基因，而在Rz36種群中表現(xiàn)不顯著（圖1）。針對(duì)上述218及25個(gè)上調(diào)基因展開進(jìn)一步研究。

2.5 抗性顯著上調(diào)基因的GO分析

圖1 上調(diào)表達(dá)的基因在小菜蛾不同種群中的分布Fig. 1 Distribution of up-regulated express genes in different populations of P. xylostella

Rh28-vs-S和Rz36-vs-S顯著上調(diào)的218個(gè)交集基因，在GO 3大本體所占的比例及數(shù)目分布情況如圖2-a所示；Rh28-vs-S和Rh28-vs-Rz36顯著上調(diào)的25個(gè)交集基因如圖2-b所示。結(jié)果表明，這部分交集差異基因在GO本體中的分布情況與前述的整體的分布情況基本一致，集中在代謝進(jìn)程、對(duì)刺激物的反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、催化活性、結(jié)合因子等方面。數(shù)據(jù)分析表明，RNA-Seq獲得的小菜蛾上調(diào)的DEGs中，參與生物過程的基因占比較高，達(dá)50%以上。

對(duì)Rh28-vs-S與Rz36-vs-S交集的218個(gè)上調(diào)基因，注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)BP中，將具有相同生物學(xué)功能的基因整合到一起（附表2）。部分差異基因在BP中所占的比例及數(shù)目見圖3，其中主要涉及脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、能量代謝、對(duì)環(huán)境壓力的反應(yīng)、對(duì)刺激物的反應(yīng)、防御反應(yīng)機(jī)制及轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，附表3列舉了Rh28-vs-S與Rh28-vs-Rz36交集上調(diào)的25個(gè)基因所參與的BP。

2.6 抗性顯著上調(diào)基因的KEGG分析

為了較為準(zhǔn)確地定位顯著差異表達(dá)上調(diào)基因參與的生物學(xué)功能，針對(duì)其所參與的 pathway，通過查找統(tǒng)計(jì)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)Rh28-vs-S和Rz36-vs-S顯著上調(diào)的218個(gè)交集基因中，能夠注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的基因僅有 108個(gè)，主要集中在代謝通路上，有 110個(gè)（50.45%）基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有詳細(xì)的代謝通路圖。小菜蛾響應(yīng)氟苯蟲酰胺藥物選擇壓力下差異顯著的表達(dá)基因富集到的通路有：代謝通路、PPAR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等。同一個(gè)基因可能同時(shí)注釋到多條pathway之中，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，列舉了部分可能與抗性相關(guān)的通路（圖4）。

圖2 上調(diào)交集基因在GO分析中的分布Fig. 2 Distribution of up-regulated intersection genes in GO analysis

圖3 上調(diào)交集基因部分BP注釋Fig. 3 Up-regulated intersection genes annotated to the corresponding BP

圖4 上調(diào)交集基因中與小菜蛾抗氟苯蟲酰胺相關(guān)的部分通路Fig. 4 Partial pathway associated with the resistance to flubendiamide in P. xylostella

2.7 抗性相關(guān)基因的聚類分析

利用高通量數(shù)據(jù)，對(duì)與殺蟲劑抗性相關(guān)的基因進(jìn)行了動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)，并從中篩選出可能與抗藥性相關(guān)的通路基因，繪制了聚類熱圖（圖5）。通過聚類熱圖的紅色區(qū)域，可以看出Rh28品系與Rz36種群顯著表達(dá)量上調(diào)的基因，很多集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白質(zhì)的加工、酪氨酸代謝、咖啡因代謝、Wnt信號(hào)通路。

3 討論

隨著高通量測(cè)序技術(shù)日益成熟，為小菜蛾抗藥性研究提供了新方法，通過進(jìn)行小菜蛾基因的篩選與鑒定，進(jìn)而分析基因的差異表達(dá)，對(duì)深入闡述小菜蛾的抗性機(jī)制具有重要意義。本文通過基因序列篩選，從小菜蛾S、Rh28和Rz36品系/種群的RNA-Seq序列信息中鑒定出多個(gè)與殺蟲劑靶標(biāo)及解毒代謝相關(guān)的基因，對(duì)這些差異表達(dá)基因在GO以及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)與分類注釋，從獲得的2萬(wàn)多條差異表達(dá)基因序列中，篩選出滿足差異顯著性表達(dá)條件的只有幾百條，這部分顯著差異的序列，在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中差異表達(dá)基因顯著富集的生物過程均在應(yīng)激反應(yīng)（response to stress）和防御反應(yīng)（defense response）中，導(dǎo)致小菜蛾對(duì)氟苯蟲酰胺抗性產(chǎn)生的基因主要集中在這部分生物過程中，其生物學(xué)功能可能與小菜蛾的抗性之間存在一定的相關(guān)性。

通過對(duì)差異基因的Pathway統(tǒng)計(jì)，信號(hào)通路主要集中于PPAR信號(hào)通路、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的加工、甘油磷脂代謝、解毒酶代謝等。PPAR是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，包括PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ3種表型，其中以PPAR-γ的研究最為深入。現(xiàn)有的研究已證實(shí) PPAR-γ主要參與調(diào)控脂肪和糖類的代謝、能量平衡等多種生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，小菜蛾的體內(nèi)脂肪酸 LPL、膽固醇、甘油磷脂等各種脂類的代謝相關(guān)以及信號(hào)受體激活等一系列連鎖反應(yīng)[17]。蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的加工，主要參與協(xié)助一些蛋白質(zhì)裝配或者折疊，這類蛋白主要是Sec23蛋白和Hsps分子伴侶蛋白，它們與能量代謝、次級(jí)代謝途徑密切相關(guān)。參與各種氨基酸、嘌呤，代謝產(chǎn)物（萜類、半萜類）代謝及生物合成、糖酵解；能量代謝過程中K/Na離子通道ATPase表達(dá)上調(diào)。研究表明，氯蟲苯甲酰胺能顯著影響甜菜夜蛾幼蟲中樞神經(jīng)元的興奮性，使電壓門控鈉通道電流密度和通道功能發(fā)生改變，試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明鈉離子通道亦是氯蟲苯甲酰胺的作用靶標(biāo)之一[18]。本文通過聚類熱圖分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達(dá)的基因很多集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白質(zhì)的加工、酪氨酸代謝和 Wnt信號(hào)通路中，與前人研究結(jié)果基本一致。

圖5 小菜蛾抗氟苯蟲酰胺相關(guān)基因表達(dá)分析Fig. 5 Expression profiling of genes associated with the resistance to flubendiamide in P. xylostella

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）作為一種超基因家族酶類，可催化昆蟲因各種化學(xué)藥劑產(chǎn)生的有害物質(zhì)的代謝。依據(jù)GSTs所處的細(xì)胞位置和功能，主要分為微粒體、線粒體和胞質(zhì)型，而在昆蟲中這種酶主要屬于胞質(zhì)型，其家族中的Delta家族（昆蟲中特有的GSTs家族之一）[19]，在生物體內(nèi)起到的作用主要包括催化活性、谷胱甘肽過氧化物酶活性、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性及裂解酶活性等，這些均與昆蟲的代謝活性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抗氯蟲苯甲酰胺品系小菜蛾的GSTs 活性是敏感品系的3.34倍，因此GSTs可能在小菜蛾對(duì)氯蟲苯甲酰胺的代謝抗性中發(fā)揮著主要作用[9]，且本文的研究也表明主要富集于谷胱甘肽代謝的 2個(gè)基因（XM_011569702.1、XM_011557174.1）表現(xiàn)為顯著表達(dá)上調(diào)。

細(xì)胞色素 P450在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖等方面起著重要作用，并且在次生物質(zhì)和殺蟲劑代謝方面也有重要作用，在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中，細(xì)胞色素P450被注釋到了次生代謝產(chǎn)物的生物合成（second-metabolites biosynthesis）、運(yùn)輸和代謝（transport and catabolism）功能中，這也充分說(shuō)明了細(xì)胞色素 P450是昆蟲體內(nèi)主要的代謝解毒酶之一[20]。其中編碼 CYP2的基因（XM_011556598.1）表達(dá)量上調(diào)顯著，而且已有研究報(bào)道CYP家族的細(xì)胞色素P450解毒酶在一些昆蟲體內(nèi)與抗藥性密切相關(guān)[21]。

經(jīng)過部分篩選分析，從小菜蛾中鑒定出多個(gè)熱激蛋白（Hsp），發(fā)現(xiàn)該抗性小菜蛾體內(nèi)的 Hsp的多個(gè)家族（如 Hsp40、Hsp70、Hsp90）表達(dá)量顯著上調(diào)，并且參與了多個(gè)生物工程，筆者認(rèn)為Hsp很可能與昆蟲的抗性以及對(duì)環(huán)境的應(yīng)激性有關(guān)，而且在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，這些Hsp家族差異基因均注釋進(jìn)入了“對(duì)刺激物的反應(yīng)”和“細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程（cellular protein metabolic process）”功能中，同時(shí)“對(duì)刺激物的反應(yīng)”的功能注釋更加表明了 Hsp可能與小菜蛾抗藥性的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系。Hsp基因家族可被壓力誘導(dǎo)，在環(huán)境壓力因素下，如重金屬離子、極端溫度、營(yíng)養(yǎng)缺失、氧自由基及細(xì)菌或者病毒感染都有可能誘導(dǎo)熱激蛋白的過量表達(dá)[22]。在粉虱類的抗逆基因研究中已經(jīng)有過類似的報(bào)道，可能由于昆蟲的這種蛋白可以應(yīng)對(duì)環(huán)境中存在的極端脅迫壓力[23-24]，導(dǎo)致一些入侵性的有害生物在分布地域方面不斷擴(kuò)大[25]。已有研究證實(shí)在高溫、低溫、輻射、干旱和農(nóng)藥等的環(huán)境壓力下，都能夠誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)不同Hsp的表達(dá)，這證實(shí)了Hsp可以提高昆蟲對(duì)不良環(huán)境的耐受能力，從而保護(hù)昆蟲免受和少受脅迫的傷害。如溫度馴化的南美斑潛蠅（Lirionyza huidobrebsis），其體內(nèi)Hsp70基因大量表達(dá)，在性狀方面耐熱能力也顯著提高，表明Hsp表達(dá)和昆蟲耐熱性的獲得有著密切關(guān)系，而且耐熱性的誘導(dǎo)和消退動(dòng)力學(xué)與Hsp的誘導(dǎo)和降解存在著平行關(guān)系[26]。抗有機(jī)磷類殺蟲劑的搖蚊（Chiromomus yoshimatsui）品系Hsp的表達(dá)水平與敏感品系相比，是敏感品系的2—3倍，表明Hsp上調(diào)增強(qiáng)了昆蟲的抗藥能力[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，小菜蛾抗氟苯蟲酰胺品系的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素 P450解毒酶及參與昆蟲多種生理反應(yīng)的熱激蛋白超基因家族等基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)，與前人研究基本一致。因此，今后需要對(duì)這些基因及其所在的通路進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步明確其抗性機(jī)制。

昆蟲靶標(biāo)基因的mRNA表達(dá)量變化也是昆蟲抗藥性產(chǎn)生的原因之一。本研究中小菜蛾田間抗性種群魚尼丁受體相關(guān)8個(gè)基因表達(dá)量均下調(diào)，而且有6個(gè)顯著下調(diào)。LIN等[28]通過比較轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，對(duì)氯蟲苯甲酰胺產(chǎn)生不同抗性水平小菜蛾種群的魚尼丁受體mRNA的表達(dá)量均顯著下調(diào)；WAN等[29]利用RNAi干擾馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）魚尼丁受體的表達(dá)后，再用氯蟲苯甲酰胺處理，馬鈴薯甲蟲的死亡率明顯降低；YANG等[30]在白背飛虱（Sogatella furcifera）的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果。這些結(jié)果均表明魚尼丁受體基因表達(dá)量的下調(diào)可能會(huì)增強(qiáng)昆蟲對(duì)雙酰胺類藥劑的抗性。筆者實(shí)驗(yàn)室正在開展魚尼丁受體表達(dá)差異基因的驗(yàn)證工作，以明確該類基因在小菜蛾對(duì)雙酰胺類殺蟲劑抗性中所起的作用。

4 結(jié)論

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）獲得了小菜蛾抗氟苯蟲酰胺差異表達(dá)基因及抗性顯著上調(diào)表達(dá)基因，其主要富集于代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)及對(duì)刺激的反應(yīng)等條目中，這些基因的相互協(xié)同調(diào)控是小菜蛾對(duì)氟苯蟲酰胺產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制。

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